Receptor Protocole autoradiographie pour la visualisation Localisée de l'angiotensine II Receptors

L’objectif global de cette procédure est de localiser anatomiquement et de quantifier l’expression du récepteur de l’angiotensine II dans les sections du cerveau en utilisant l’autoradiographie des récepteurs et l’identification histologique des structures cérébrales. Cette méthode identifie les régions du cerveau où l’angiotensine II affecte le comportement, la fonction cognitive et le système cardiovasculaire, fournissant des informations pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement des maladies neurodégénératives et cardiovasculaires. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est quantitative, qualitative et permet d’identifier les récepteurs fonctionnels de l’angiotensine II avec une plus grande spécificité que les autres méthodes.

Cette méthode peut également caractériser la fonctionnalité d’autres systèmes de récepteurs hormonaux dans tout le corps, tels que les récepteurs liés aux drogues. Immédiatement après la récolte, placez les tissus cérébraux dans des moules cérébraux qui simulent l’intérieur du crâne et enveloppez les moules dans du papier d’aluminium pour un stockage à moins 20 degrés Celsius. Après 30 minutes, transférez les mouchoirs dans un sac de congélation refermable et conservez le sac à moins 80 degrés Celsius.

Avant la section, retirez délicatement le cerveau du moule cérébral. Pour sectionner le tissu cérébral, transférez l’échantillon d’intérêt dans un cryostat réglé entre moins 10 et moins 18 degrés Celsius. Lorsque le tissu s’est équilibré à la nouvelle température, utilisez un milieu à base de glycol et de résine pour intégrer verticalement une petite partie de l’échantillon dans un support de tissu afin de permettre la section du plan coronal.

Chargez le tissu sur le microtome et serrez fermement le support en place, puis commencez à couper le cerveau à l’épaisseur souhaitée, puis montez les sections sur des lames de microscope dans une orientation verticale pour appliquer une plus grande surface de tissu sur la lame. Rassemblez les sections en séries séquentielles de cinq. Lorsque toutes les sections ont été recueillies, laissez les lames sécher à l’air libre pendant une heure maximum.

Placez ensuite les échantillons dans une boîte à lames en plastique dans un sac de congélation auto-obturant pour un stockage à moins 20 degrés Celsius. Pour étiqueter les échantillons par radio, retirez les première et deuxième lames de chaque ensemble de cinq et montez-les dans des poignées coulissantes disponibles dans le commerce ou imprimées en 3D. Les diapositives du tiret un sont pour le groupe de traitement non spécifique et les diapositives du tiret deux sont pour le groupe de traitement total.

Retournez les lames dans 35 à 40 millilitres d’AM5 à température ambiante et leurs inhibiteurs respectifs dans les bocaux Coplin de pré-incubation appropriés. L’exécution de plusieurs séries de diapositives peut être écrasante. Par conséquent, il est extrêmement important de placer les lames dans les bocaux de pré-incubation à des intervalles de quatre minutes pour s’assurer qu’il n’y a pas de chevauchement pendant l’étape de séchage.

Après 30 minutes, transférez les lames dans des enveloppes de lames d’incubation contenant 10 millilitres d’AM5 complété par la concentration appropriée d’angiotensine I125 SI II et les inhibiteurs du groupe de traitement respectif pendant 60 à 90 minutes à température ambiante. Déterminer la concentration exacte de 125I SI Ang II est essentiel pour permettre de comparer les récepteurs de l’angiotensine II d’un jour à l’autre. À la fin de l’incubation, remettez les lames dans les poignées coulissantes, bloquez les lames et faites-les tourner doucement pendant une à deux secondes dans deux récipients séparés de 400 millilitres d’eau distillée.

Après le deuxième lavage à l’eau, rincez les lames avec quatre lavages séquentiels d’une minute dans 30 à 40 millilitres de AM5. Après le quatrième lavage, faites tourner doucement les sections pendant une à deux secondes en quatre changements d’eau distillée glacée. Ensuite, utilisez quatre séchoirs à cheveux réglés à différents angles pour sécher les lames à l’air frais pendant quatre minutes.

Lorsque toutes les sections sont sèches, transférez les lames sur une serviette en papier. Ensuite, utilisez du ruban adhésif double face pour monter les lames, côté tissu vers le haut, sur un morceau de carton pour film radiographique en position et comprenant au moins une lame d’étalon d’étalonnage de l’iode 125 par groupe. Pour filmer exposer les sections, dans une pièce sombre, placez les diapositives en carton à l’intérieur d’une cassette à rayons X à sangle arrière et éteignez les lumières.

Allumez la lumière de sécurité et ouvrez avec précaution une boîte de film radiographique. Placez un film, côté brillant vers le haut avec le bord dentelé dans le coin inférieur droit au-dessus des diapositives de la cassette. Fermez ensuite soigneusement la cassette avec les barres de verrouillage torsadées pour empêcher la lumière de pénétrer et rangez la cassette à moins 20 degrés Celsius.

Après la période d’exposition appropriée, transférez le film dans une solution de révélateur pendant deux minutes suivies de 30 secondes dans un bain d’arrêt, de l’eau distillée deux fois avec de l’acide acétique, puis cinq minutes dans une solution fixatrice. Lavez le film dans une plaque d’eau courante pendant 20 minutes. Transférez-le dans un surmatelas pendant environ 10 secondes et suspendez le film pour qu’il sèche.

Pour l’analyse histologique des sections de tissu cérébral, décongelez le tiret en trois sections dans un support de diapositives. Ensuite, lavez les sections dans de l’eau désionisée pendant une minute, suivie d’une incubation de 10 minutes dans une solution de coloration à la thionine et de trois trempages dans un récipient d’eau désionisée. Immergez les lames pour un lavage à l’eau désionisée supplémentaire de 30 secondes.

Ensuite, lavez les lames dans des lavages séquentiels à l’éthanol comme indiqué. Après le dernier lavage à 100 % éthanol, lavez les lames dans deux récipients de xylène pendant trois et cinq minutes consécutives. À la fin du deuxième lavage au xylène, couvrez le bord supérieur d’une lame à la fois avec une base de résine, un moyen de montage à base de solvant inorganique.

Montez le couvercle de 24 x 60 millimètres qui se glisse sur les diapositives et laissez les lames sécher pendant 48 heures. Numérisez ensuite les diapositives et le film dans l’ordinateur à 2400 DPI en niveaux de gris. Pour analyser le film par densitométrie, après le balayage, tracez empiriquement les zones d’intérêt sur chaque film.

Il s’agit de l’image pseudo-couleur générée après l’ouverture du film numérisé dans le programme d’analyse d’image. Incluez la densité, la zone de balayage et la surface cible totale dans les mesures. Ajustez les barres de la zone de balayage pour vous assurer que chaque région d’intérêt se situe entre les paramètres de la mise en surbrillance.

Exportez ensuite les données dans une feuille de calcul pour déterminer la liaison spécifique présente pour chaque échantillon. Les unités d’étalon d’étalonnage pour la quantification sont déterminées en fonction de la date à laquelle l’essai a été effectué. Après avoir scanné les films, les valeurs d’étalonnage sont utilisées pour générer une courbe basée sur les différentes concentrations d’étalons d’iode 125 pour ce film spécifique.

L’étalonnage et les valeurs standard sont enregistrés en trois exemplaires pour plus de précision. Les distinctions entre les groupes de liaison non spécifique et les groupes totaux ainsi que les étiquettes tissulaires sont établies en attribuant chaque ensemble de données aux sous-groupes appropriés. Une valeur de seuil plus élevée doit être réglée en ajustant les paramètres du rouge au noir, tandis que la valeur de seuil inférieure doit être proche de zéro pour permettre une mesure plus précise de l’ensemble de la zone d’intérêt balayée.

Par exemple, ici, les zones finales mesurées du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus dans le groupe de liaison total par rapport aux groupes de liaison non spécifiques sont comparées à une coupe colorée à la thionine pour confirmation anatomique. La liaison non spécifique est la quantité de radioligand liée aux récepteurs non radioactifs de l’angiotensine en présence d’une concentration saturante de ligand non radioactif du récepteur de l’angiotensine I, tandis que la liaison totale est la quantité de radioligand liée en l’absence de ligand non radioactif du récepteur de l’angiotensine I. Les valeurs de liaison non spécifiques peuvent ensuite être soustraites des valeurs de liaison totales pour obtenir les valeurs de liaison spécifiques pour les récepteurs de l’angiotensine I.

Une fois maîtrisée, l’étape d’autoradiographie du récepteur peut être complétée en quatre heures environ, tandis que l’étape de développement du film prend environ 30 minutes par film. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de garder une trace du temps pour s’assurer que toutes les lames sont incubées, rincées et séchées pendant exactement la même durée. Suite à cette procédure, des études supplémentaires de la morphologie cérébrale peuvent être effectuées pour évaluer les changements dans la taille des régions présentant l’expression du récepteur de l’angiotensine II.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient la pharmacologie des récepteurs pour déterminer comment différentes régions du cerveau sont affectées par diverses neurohormones, neurotransmetteurs et médicaments. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer avec succès un test d’autoradiographie des récepteurs, des lames colorées histologiquement et d’évaluer les autoradiogrammes pour localiser les récepteurs dans des régions cérébrales spécifiques. N’oubliez pas que le travail avec de la radioactivité peut être dangereux et que des précautions telles qu’un blindage approprié, un confinement, une surveillance de l’exposition et une élimination doivent toujours être prises pour éviter la contamination radioactive.