Corrélative microscopie optique et électronique pour l'étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les plaques bêta-amyloïdes dans des sections de cerveau à partir de modèles murins de la maladie d’Alzheimer avant de pré-intégrer l’immunomarquage et le traitement tissulaire pour la microscopie électronique. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la neuroimmunologie telles que l’interaction de la cellule microgliale avec la synapse près des parcelles bêta-amyloïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de pré-cribler des coupes de tissu cérébral contenant des tracés de bêta-amyloïde dans les régions et les couches d’intérêt.

Bien que cette méthode puisse être appliquée à la maladie d’Alzheimer, elle peut également être appliquée à toute autre maladie ou tissu où l’amylose est présente. Tout d’abord, préparez une solution de cinq milligrammes par millilitre de composé méthoxy X04. À l’aide d’une balance mirco, pesez cinq milligrammes de méthoxy X04.

Sous une hotte, dissoudre le méthoxy X04 dans 100 microlitres de DMSO et remuer jusqu’à l’obtention d’une solution claire et verdâtre. Ajouter successivement 450 microlitres de propylène glycol et 450 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate tout en remuant. Maintenez la solution en mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, une émulsion vert jaunâtre devrait être observée. Après avoir injecté du méthoxy X04, ajoutez une dose de 10 milligrammes par kilogramme de poids corporel et sacrifiez l’animal au moment souhaité selon les méthodes approuvées, lavez le cerveau fixé au para ormaldéhyde trois fois avec du PBS réfrigéré. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir tranchante, retirez le bulbe olfactif et coupez le cerveau coronalement en deux à trois morceaux de hauteur à peu près égale, qui peuvent tous être sectionnés simultanément afin d’accélérer la procédure.

Collez les morceaux de tissu cérébral sur la plaque d’échantillon fixée dans le plateau. Assurez-vous que la surface de coupe lisse adhère fermement à la plaque d’échantillon. Ajoutez la solution PBS dans le plateau jusqu’à ce que toute la surface du cerveau soit complètement immergée.

Placez le plateau dans le vibratome et ajustez les paramètres du vibratome pour obtenir des sections de 50 microns d’épaisseur. Commencez à couper et, en cas de criblage, transférez immédiatement les sections dans du PBS à l’aide d’un pinceau fin. Alternativement, les sections peuvent être placées dans des flacons en verre contenant une solution cryoprotégée pour un stockage à 20 degrés Celsius.

À l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau de souris, sélectionnez des sections de cerveau contenant la région d’intérêt et placez chaque section dans un cryoprotecteur dans un puits d’une plaque de culture de 24 puits. Ensuite, utilisez une pipette jetable pour ajouter une gouttelette de PBS sur une lame de microscope, puis placez la section sur la gouttelette. Examinez la coupe au microscope fluorescent pour identifier les régions contenant des plaques a-bêta marquées au méthoxy X04.

Sans déplacer la platine du microscope, capturez des images des régions d’intérêt en fond clair ainsi qu’en mode fluorescence. Chaque image doit montrer la même région dans les deux champs pour corréler la plaque à la région structurelle de la section de tissu. Enregistrez et nommez les images prises en fonction du numéro d’animal.

Notez également le numéro du puits dans la plaque et le champ des photos prises. Remettez la section dans le puits désigné une fois l’imagerie terminée. Examinez la section suivante de la séquence en utilisant la même procédure pour éviter de sécher les sections.

Pour aligner les images, ouvrez les images en fond clair et en champ UV pour le même retour sur investissement dans ImageJ. Ensuite, utilisez le plugin MosaicJ pour aligner les bords des deux images. Enregistrez l’image alignée et combinée selon le numéro du puits dans un dossier avec le numéro de l’animal particulier.

Combinez les images de différentes sections d’un même animal pour identifier et localiser les plaques dans la région d’intérêt. Une fois le processus de dépistage terminé, stockez les sections examinées à 20 degrés Celsius dans une plaque de culture à 24 puits contenant un cryoprotecteur jusqu’à ce qu’une immunocoloration ou un traitement ultérieur soit effectué. Tout d’abord, préparez une solution de tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon phosphate dans un flacon en verre.

Comme le tétroxyde d’osmium est photosensible, couvrez le flacon en verre avec une feuille d’aluminium pour protéger la solution de la lumière. Après le lavage au tampon phosphate, retirez le tampon des sections et étalez-les à plat à l’aide d’un pinceau fin. Assurez-vous d’aplatir les sections immédiatement avant d’ajouter du tétroxyde d’osmium, car tous les plis dans les sections deviendront permanents et tenter d’aplatir les tissus après la fixation à l’osmium ne fera que briser les sections.

À l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez du tétroxyde d’osmium aux sections, une goutte à la fois, jusqu’à ce que la section soit immergée. Couvrez le puits d’une feuille d’aluminium pour protéger les sections de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Au cours de cette incubation, préparez la résine plastique dans un bécher jetable.

Combinez les composants dans l’ordre et mélangez bien à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres jusqu’à l’obtention d’une couleur uniforme. Transférez le mélange préparé dans des plateaux de pesée en aluminium. Ceux-ci recevront les coupes de tissus une fois qu’ils auront été déshydratés.

Une fois le temps d’incubation écoulé, déshydratez les sections à des concentrations croissantes d’éthanol pendant deux minutes chacune. Transférez les sections déshydratées de la plaque de culture à 24 puits dans des flacons en verre de 20 millilitres. Ensuite, plongez les sections dans de l’oxyde de propylène trois fois pendant deux minutes à chaque fois pour éliminer l’éthanol résiduel.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette en verre courbé ou un pinceau fin pour transférer les sections de la solution d’oxyde de propylène dans la résine plastique et laissez passer la nuit pour une infiltration à température ambiante. Après infiltration, placez les plateaux de pesée en aluminium contenant les échantillons dans un four à 50 à 60 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Pour encastrer des sections sur des feuilles de film de polychlorotrifluoroéthylène, utilisez d’abord un pinceau fin pour peindre une fine couche de résine sur la section.

Ensuite, déplacez une section de tissu à la fois d’une parabole en aluminium à la feuille de film PCTFE. Retirez l’excès de résine autour du tissu, en faisant attention de ne pas le déranger. Après avoir déplacé toutes les sections d’une parabole vers la feuille de film PCTFE, placez une deuxième feuille de PCTFE sur la première, créant ainsi un sandwich de tissu et de résine entre les deux feuilles.

Polymériser la résine dans un incubateur pendant trois jours à 55 à 60 degrés Celsius. Le tissu est alors prêt pour la coupe ultrafine et l’examen ultrastructurel. Les images suivantes montrent une double imagerie d’une section d’hippocampe à l’aide des modes fond clair et fluorescence.

Les régions et les couches d’intérêt sont visualisées en fond clair. Alors que les plaques a-bêta sont localisées avec succès à l’aide d’un filtre UV dans une gamme de 340 à 380 nanomètres. Cette image montre une coupe de l’hippocampe avant de pré-intégrer l’immunocoloration pour IBA1.

Une plaque visible est délimitée par la ligne pointillée. Cette image montre la même section après le pré-intégration de l’immunomarquage pour IBA1 et le traitement pour la microscopie électronique à transmission. Notez que la plaque entourée d’une ligne pointillée est toujours visible lors du traitement des tissus pour la microscopie électronique.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété en une semaine s’il est correctement exécuté. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque étape doit être effectuée rigoureusement pour réduire la probabilité de contamination et d’autres dégradations structurelles qui affecteront la qualité des échantillons. N’oubliez pas que travailler avec de l’osmium peut être extrêmement dangereux et que vous devez donc toujours prendre des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire et de gants lors de l’exécution de cette procédure.

Assurez-vous de jeter après utilisation à la fin de votre expérience, conformément aux directives de votre établissement.