Mise en place d'un programme d'installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans Pseudomonas aeruginosa

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de petites molécules qui modulent les niveaux intracellulaires du deuxième messager cyclique-di-GMP chez l’agent pathogène opportuniste, Pseudomonas aeruginosa, au moyen d’un criblage bio-rapporteur à haut débit. Cette méthode peut aider à découvrir de petites molécules qui interfèrent avec la bioinformation de Pseudomonas aeruginosa et d’autres particules au moyen de la modulation cyclique-di-GMP. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très robuste et polyvalente, permettant le criblage de plus de 3 500 composés en 48 heures.

Les implications de cette technique s’étendent au développement de nouvelles thérapies qui pourraient sensibiliser à Pseudomonas aeruginosa, au système immunitaire ou aux antibiotiques existants tout en exerçant une pression sélective moindre sur les bactéries. Innoculez cinq millilitres de bouillon de lysogénie, ou milieu LB, avec une seule colonie de P. aeruginosa, sept degrés Celsius, en agitant à 200 tr/min. Ensuite, transférez deux millilitres de la culture de nuit dans 200 millilitres de milieu LB frais dans une fiole d’un litre, et incubez à 37 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min.

Surveiller la densité optique à 600 nanomètres ou OD 600, toutes les 30 minutes en prélevant un échantillon de 1 millilitre dans le ballon et en l’examinant à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque l’OD 600 atteint entre 0,3 et 0,5, placez 40 millilitres de la culture dans un tube de centrifugation conique de 50 millilitres. Granulez les cellules en les centrifugeant à 8000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 40 millilitres de solution de saccharose stérile glacée de 300 millimolaires. Après avoir centrifuger les cellules une deuxième fois, les remettre en suspension dans 20 millilitres de solution de saccharose stérile glacée de 300 millimolaires. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez-les en suspension dans 400 microlitres de la solution de saccharose de 300 millimolaires. Refroidissez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes, après quoi elles sont prêtes pour l’électroporation.

Ensuite, ajoutez un microlitre d’une solution de plasmide de 0,2 microgramme par microlitre codant pour le promoteur CdrA au gène codant pour la protéine fluorescente verte à 40 microlitres de cellules électrocompétentes de P. Aeruginosa préparées dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre qui a été pré-refroidi sur de la glace. Mélangez la suspension et transférez-la dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie de 2 millimètres à écartement d’électrodes. Enlevez l’humidité à l’extérieur de la cuvette avec du papier de soie et placez la cuvette dans la chambre d’échantillonnage de l’électroporateur.

Pulsez la solution avec une tension de 2,5 kilovolts, des condensants de 25 microfarads et une résistance de 200 ohms. Retirez la cuvette et ajoutez un millilitre de milieu LB. Ensuite, transférez les cellules dans un microtube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min.

Après l’incubation, étalez 10 microlitres, 50 microlitres et 100 microlitres aliquotes de la culture sur des plaques de gélose LB stériles remplies d’ampicilline et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Confirmez l’expression de la GFP en examinant la plaque sous un microscope à fluorescence avec un canal GFP standard. Choisissez une seule colonie et inoculez dans cinq millilitres de LB. Après une nuit d’incubation, mélangez 0,5 millilitre de la culture de nuit avec 0,5 millilitre de glycérol à 50 % dans un tube à vis de 2 millilitres et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.

Deux jours avant l’écran, déposer la souche préparée de P. aeruginosa à partir du bouillon de moins 80 degrés Celsius sur une plaque de gélose LB en répartissant doucement les bactéries sur la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile. Incuber l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius. La veille du dépistage, inoculez une seule colonie de P. aeruginosa de la plaque dans 10 millilitres de milieu LB dans un tube.

Incuber la pré-culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Le jour de l’écran, préparez une sous-culture à partir de la pré-culture de nuit en la diluant d’abord avec du milieu LB frais jusqu’à une DO 600 de 1,0, puis en diluant à nouveau avec 5 % de LB jusqu’à une DO 600 de 04. Ajoutez une barre d’agitation magnétique stérile dans le récipient et remuez la culture à vitesse minimale sur un agitateur magnétique pendant 30 minutes à température ambiante.

Cela permet aux bactéries de s’acclimater au milieu avant d’être distribuées dans des plaques de 384 puits. Pour préparer le contrôle positif, ajoutez 20 microlitres de sulfate de tobramycine à 10 millilitres de la sous-culture préparée et mélangez doucement. Pipeter 40 microlitres de la culture témoin positive dans les puits A23 à P23.

Pour préparer le contrôle négatif, ajoutez 30 microlitres de diméthylsulfoxyde à 10 millilitres de la sous-culture préparée et mélangez délicatement. Pipeter 40 microlitres de la culture témoin négative dans les puits A24 à P24. Pour chacune des plaques humidifiées avec les petites molécules, inoculez un volume de 40 microlitres de cultures diluées pendant la nuit dans les puits A1 à P22.

Scellez les plaques avec un couvercle perméable à l’air et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Environ 30 minutes avant la mesure spectrophotométrique, préchauffez le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius pour éviter la condensation. Retirez délicatement le joint de couvercle perméable à l’air de la plaque avant de lire.

Mesurez ensuite la densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres avec un réglage de 10 flashs par puits et un temps de stabilisation de 0,2 seconde. Avant de mesurer la fluorescence, effectuez un réglage automatique du gain et de la focale en fonction du puits de contrôle négatif A24 et réglez la valeur cible de gain à 75 %Sélectionnez le réglage de la mise au point et le canal A à droite de la fenêtre. Mesurez la fluorescence du rapporteur GFP à une excitation maximale de 485 nanomètres et une émission maximale de 520 nanomètres avec un réglage de 10 flashs par puits et un temps de stabilisation de 0,2 seconde.

Recueillir des données sur toutes les plaques examinées. Les relevés de données sont automatiquement enregistrés par défaut par le logiciel de contrôle du lecteur de plaques. Pour analyser les données, consultez les lectures en cliquant sur l’icône Mars dans le logiciel de contrôle pour ouvrir le package d’analyse statistique.

Récupérez les données en double-cliquant sur le numéro de plaque qui vous intéresse pour accéder aux données d’analyse. Évaluez l’uniformité et la reproductibilité du test à l’aide d’une analyse Z prime robuste. Ensuite, calculez le pourcentage d’inhibition de la croissance et évaluez le pourcentage d’inhibition du niveau intracellulaire de c-di-GMP comme détaillé dans le protocole texte.

Cette figure décrit les données brutes représentatives pour OD 600 et GFP à partir de l’écran à haut débit. Une carte thermique de dégradé de couleurs avec des couleurs chaudes à froides indiquant des valeurs faibles à élevées a été appliquée aux valeurs de puits. Les données générées sont analysées pour déterminer le pourcentage d’inhibition et sont représentées ici pour les lectures OD 600 et GFP.

Les petites molécules qui inhibent potentiellement la croissance et le c-di-GMP intracellulaire auront tendance à être en vert, tandis que les petites molécules qui favorisent potentiellement la croissance et les niveaux de c-di-GMP intracellulaire auront tendance à être en rouge. Des diagrammes de dispersion sont utilisés pour comparer le pourcentage d’inhibition obtenu à partir de chaque petite molécule testée. Chaque petite molécule est représentée par un petit point et la distribution du pourcentage d’inhibition pour chacune des lectures OD 600 et GFP est illustrée.

Une coupure de plus ou moins 50 % est sélectionnée pour l’identification de l’occurrence. Les résultats potentiels sont surlignés en rouge. Des dosages dose-réponse sont réalisés sur chaque composé intéressant.

Ici, deux composés identifiés sont testés dans un test dose-réponse en 10 points avec une concentration maximale de deux millimolaires et une série de dilution double. L’ajustement d’une fonction logistique à quatre paramètres aux données a permis d’obtenir des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximales pour chaque composé de 158 micromolaires et 193 micromolaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler plus de 3 500 composés en 48 heures.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cribler de manière robuste Pseudomonas aeruginosa pour les composés interférant avec la signalisation cyclique-di-GMP. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les conditions de dépistage comparables lors d’un dépistage sur plusieurs jours. Après un écran à point unique, l’exécution d’un écran de réponse dirsk utilisant le même protocole peut valider les résultats.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour identifier de petites molécules potentielles qui interfèrent avec les informations biologiques et la résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée pour être utilisée pour n’importe quelle bactérie d’intérêt et peut être modifiée pour examiner d’autres sorties ou entrées, telles qu’un impact sur la viabilité bactérienne. Enfin, n’oubliez pas que travailler avec Pseudomonas aeruginosa peut être dangereux.

Et des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.