Mise en place d'un programme d'installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des petites molécules capables de moduler les concentrations intracellulaires du second messager di-GMP cyclique chez l'agent pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, au moyen d'un criblage bio-reporteur à haut débit. Cette méthode peut aider à découvrir des petites molécules qui interfèrent avec la bioformation de Pseudomonas aeruginosa et d'autres particules par modulation du di-GMP cyclique. Le principal avantage de cette technique réside dans sa grande robustesse et sa polyvalence, permettant le criblage de plus de 3 500 composés en 48 heures.

Les implications de cette technique s'étendent au développement de nouvelles thérapies qui pourraient potentiellement sensibiliser Pseudomonas aeruginosa au système immunitaire ou aux antibiotiques existants, tout en exerçant une pression sélective moindre sur la bactérie. Inoculer cinq millilitres de bouillon de lysogénie, ou milieu LB, avec une colonie isolée de P. aeruginosa, à 37 degrés Celsius, sous agitation à 200 tr/min. Ensuite, transférer deux millilitres de la culture de nuit dans 200 millilitres de milieu LB frais dans un flacon d'un litre, et incuber à 37 degrés Celsius sous agitation à 200 tr/min.

Surveillez la densité optique à 600 nanomètres (OD 600) toutes les 30 minutes en prélevant un échantillon de 1 millilitre à partir du flacon et en l'analysant à l'aide d'un spectrophotomètre. Lorsque l'OD 600 atteint une valeur comprise entre 0,3 et 0,5, transférez 40 millilitres de la culture dans un tube conique de centrifugation de 50 millilitres. Récupérez les cellules sous forme de culot par centrifugation à 8000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 40 millilitres de solution stérile de saccharose à 300 millimolaire, froide sur glace. Après une deuxième centrifugation des cellules, resuspendez-les dans 20 millilitres de solution stérile de saccharose à 300 millimolaire, froide sur glace. Centrifugez à nouveau les cellules et resuspendez-les dans 400 microlitres de la solution de saccharose à 300 millimolaire. Refroidissez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes, après quoi elles sont prêtes pour l'électroporation.

Ensuite, ajoutez un microlitre d'une solution à 0,2 microgramme par microlitre de plasmide codant pour le promoteur CdrA au gène codant pour la protéine fluorescente verte, dans 40 microlitres de cellules électro-compétentes de P. aeruginosa préparées, dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre préalablement refroidi sur de la glace. Mélangez la suspension et transférez-la dans une cuvette d'électroporation à entrefer de 2 millimètres préalablement refroidie. Retirez l'humidité présente à l'extérieur de la cuvette à l'aide d'un papier absorbant et placez la cuvette dans la chambre d'échantillonnage de l'électroporateur.

Impulser la solution avec une tension de 2,5 kilovolts, une capacité de 25 microfarads et une résistance de 200 ohms. Retirer la cuvette et ajouter un millilitre de milieu LB. Ensuite, transférer les cellules dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius sous agitation à 200 tr/min.

Après incubation, étaler des aliquots de 10 microlitres, 50 microlitres et 100 microlitres de la culture sur des boîtes de gélose LB stériles supplémentées en ampicilline et incuber les boîtes à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Confirmer l'expression de la GFP en examinant la boîte au microscope à fluorescence avec un canal GFP standard. Prélever une colonie isolée et l'ensemencer dans cinq millilitres de LB. Après incubation nocturne, mélanger 0,5 millilitre de la culture de nuit avec 0,5 millilitre de glycérol à 50 % dans un tube de 2 millilitres à vis et conserver à moins 80 degrés Celsius.

Deux jours avant l'analyse, ensemencer la souche de P.aeruginosa préparée provenant du stock à moins 80 degrés Celsius sur une boîte de gélose LB en étalant délicatement les bactéries sur la boîte à l’aide d’un anneau d’inoculation stérile. Incuber la boîte pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le soir précédant l’analyse, inoculer une colonie unique de P.aeruginosa provenant de la boîte dans 10 millilitres de milieu LB dans un tube.

Incuber la pré-culture toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation à 200 tr/min. Le jour de l'analyse, préparer une sous-culture à partir de la pré-culture de nuit en la diluant d'abord avec du milieu LB frais jusqu'à une DO 600 de 1,0, puis en la diluant davantage avec du LB à 5 % jusqu'à une DO 600 de 0,4. Ajouter une barrette magnétique stérile dans le récipient et agiter la culture à vitesse minimale sur un agitateur magnétique pendant 30 minutes à température ambiante.

Cela permet aux bactéries de s'acclimater au milieu avant leur distribution dans des plaques de 384 puits. Pour préparer le témoin positif, ajouter 20 microlitres de sulfate de tobramycine à 10 millilitres de la sous-culture préparée et mélanger délicatement. Prélever à la pipette 40 microlitres de la culture témoin positif et les déposer dans les puits A23 à P23.

Pour préparer le témoin négatif, ajouter 30 microlitres de diméthylsulfoxyde à 10 millilitres de la sous-culture préparée et mélanger délicatement. Prélever 40 microlitres de la culture témoin négatif à l’aide d’une pipette et les déposer dans les puits A24 à P24. Pour chacune des plaques traitées avec les petites molécules, inoculer un volume de 40 microlitres des cultures diluées de la nuit dans les puits A1 à P22.

Sceller les plaques avec un film perméable à l'air et incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius. Environ 30 minutes avant la mesure spectrophotométrique, préchauffer le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius afin d'éviter la condensation. Retirer délicatement le film perméable à l'air de la plaque avant la lecture.

Ensuite, mesurez la densité optique à une longueur d'onde de 600 nanomètres avec un réglage de 10 impulsions par puits et un temps de stabilisation de 0,2 seconde. Avant de mesurer la fluorescence, effectuez un réglage automatique du gain et du foyer en vous basant sur le témoin négatif du puits A24 et réglez la valeur cible du gain à 75 %. Sélectionnez le réglage de mise au point et le canal A à droite de la fenêtre. Mesurez la fluorescence du rapporteur GFP à un maximum d'excitation de 485 nanomètres et un maximum d'émission de 520 nanomètres avec un réglage de 10 impulsions par puits et un temps de stabilisation de 0,2 seconde.

Recueillir les données provenant de toutes les plaques examinées. Les relevés de données sont automatiquement enregistrés par défaut par le logiciel de contrôle du lecteur de plaques. Pour analyser les données, afficher les relevés en cliquant sur l'icône Mars dans le logiciel de contrôle afin d'ouvrir le module d'analyse statistique.

Récupérez les données en double-cliquant sur le numéro de la plaque d'intérêt pour accéder aux données à analyser. Évaluez l'uniformité et la reproductibilité du test à l'aide d'une analyse robuste du Z prime. Ensuite, calculez le pourcentage d'inhibition de la croissance et évaluez le pourcentage d'inhibition du niveau intracellulaire de c-di-GMP, comme indiqué dans le protocole textuel.

Cette figure présente des données brutes représentatives d'OD 600 et de GFP issues du criblage à haut débit. Une carte thermique en dégradé de couleurs, allant des teintes chaudes aux teintes froides pour indiquer des valeurs croissantes, a été appliquée aux valeurs des puits. Les données obtenues sont analysées en pourcentage d'inhibition et sont représentées ici pour les deux lectures, OD 600 et GFP.

Les petites molécules qui pourraient inhiber la croissance et les niveaux intracellulaires de c-di-GMP apparaissent généralement en vert, tandis que celles qui pourraient favoriser la croissance et les concentrations intracellulaires de c-di-GMP apparaissent généralement en rouge. Des graphiques de dispersion sont utilisés pour comparer le pourcentage d'inhibition obtenu pour chaque petite molécule testée. Chaque petite molécule est représentée par un petit point, et la distribution du pourcentage d'inhibition pour les mesures de densité optique à 600 nm et de GFP est indiquée.

Une marge de ± 50 % est choisie comme seuil pour l'identification des hits. Les hits potentiels sont mis en évidence en rouge. Des tests de réponse en fonction de la dose sont réalisés pour chaque composé intéressant.

Ici, deux composés identifiés sont testés dans un dosage de réponse à 10 concentrations avec une concentration maximale de deux millimolaires et une série de dilutions deux fois consécutives. L'ajustement d'une fonction logistique à quatre paramètres aux données a permis d'obtenir des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale pour chaque composé de 158 micromolaires et 193 micromolaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler plus de 3 500 composés en moins de 48 heures.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cribler de façon robuste Pseudomonas aeruginosa pour identifier des composés interférant avec la signalisation du cyclique-di-GMP. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de veiller à maintenir des conditions de criblage comparables lorsque celui-ci s'étend sur plusieurs jours. Après un criblage ponctuel, la réalisation d'un criblage de réponse en milieu liquide en utilisant le même protocole peut permettre de valider les composés actifs.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour identifier des petites molécules capables d'interférer avec la formation de biofilms de Pseudomonas aeruginosa et avec sa résistance aux antibiotiques. Importamment, cette méthode peut être adaptée pour être utilisée avec n'importe quelle bactérie d'intérêt et peut être modifiée afin d'analyser d'autres paramètres entrants ou sortants, comme l'impact sur la viabilité bactérienne. Enfin, n'oubliez pas que le travail avec Pseudomonas aeruginosa peut présenter des risques.

Et des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.