Méthode rapide et simplifié Haut Isolation Grâce-put de miARN de hautement purifiées High Density Lipoprotein

L’objectif global de cette méthode est de développer une approche simplifiée pour isoler rapidement les lipoprotéines de haute densité purifiées du plasma sanguin humain pour l’analyse des micro-ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en hépatologie et en cardiologie, telles que la compréhension des mécanismes moléculaires et des fonctions protectrices des lipoprotéines de haute densité. L’un des principaux avantages de cette technique est que les micro-ARN HDL purifiés sont pré-isolés à partir d’un volume moindre d’échantillons dans un court laps de temps.

Dans ce protocole, le plasma est obtenu à partir d’échantillons de sang veineux périphérique à jeun par plusieurs étapes de centrifugation, comme décrit dans le texte du protocole. Transférez le plasma dans un nouveau tube. Et mesurez la masse volumique du plasma à l’aide d’un densitomètre à température ambiante, selon les instructions du fabricant.

Pour éliminer les exosomes circulants qui représentent une source de contamination par les micro-ARN, ajoutez 252 microlitres de solution de précipitation d’exosomes à un millilitre de plasma. Et incubez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez le mélange pendant 30 minutes pour éliminer les exosomes.

Transférez un millilitre du surnageant résultant dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse pour un traitement ultérieur, comme le montre le segment vidéo suivant. L’isolement des lipoprotéines de haute densité, ou HDL, est réalisé par un protocole d’ultracentrifugation à gradient de densité en trois étapes, qui implique un isolement séquentiel des lipoprotéines de très basse densité, ou VLDL, des lipoprotéines de basse densité, ou LDL, et du HDL. Les trois solutions de densité différentes, A, B et C, doivent être préparées fraîches, en suivant la procédure décrite dans le texte du protocole.

Dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate de 6,5 millilitres à paroi épaisse, mélangez un millilitre de plasma et 200 microlitres de Fat Red 7B sans nucléases. Ensuite, superposez soigneusement cinq millilitres de solution A sur le mélange. Si nécessaire, ajoutez du Fat Red 7B supplémentaire sur la solution A pour équilibrer le poids de chaque tube.

Chargez les tubes dans un rotor pré-refroidi. Placez le rotor dans une centrifugeuse au sol et centrifugez pendant deux heures. À la fin de la course, deux couches doivent être visibles.

Retirez 1,5 millilitre de la couche supérieure, représentant la fraction VLDL. Et stockez-le à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, transférez quatre millilitres du bas du tube vers un nouveau tube de 50 millilitres.

Celui-ci contient la fraction LDL et HDL. L’étape suivante est l’isolement du LDL. Mélangez deux millilitres de solution B et 100 microlitres de Fat Red 7B sans nucléases dans le tube contenant la fraction LDL et HDL.

Mettez sur de la glace pendant cinq à dix minutes. Transférez 6,5 millilitres de l’échantillon mélangé dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse. Chargez le tube dans un rotor pré-refroidi et centrifugez-le pendant trois heures.

Lorsque la centrifugation est terminée, retirez 1,5 millilitre de la couche supérieure, représentant la fraction LDL et maintenez-la à quatre degrés Celsius. Transférez quatre millilitres du bas du tube, contenant la fraction HDL, dans un tube stérile de 50 millilitres. La troisième étape est l’isolation du HDL.

Mélangez deux millilitres de solution C, 100 microlitres de Fat Red 7B sans nucléases et 15 microlitres de bêta-mercaptoéthanol à 98 % dans le tube, contenant la fraction HDL. Vérifiez la densité du mélange. Chargez le tube dans un rotor pré-refroidi et centrifugez-le pendant trois heures.

Après cela, retirez deux millilitres de la couche supérieure, représentant la fraction HDL, et maintenez-la à quatre degrés Celsius. L’excès de sel doit être éliminé des fractions de lipoprotéines pour éviter toute interférence avec l’électrophorèse sur gel d’agarose et la PCR ultérieures. Dans cette vidéo, le dessalage et la concentration seront démontrés uniquement pour la fraction HDL.

Ajoutez 13 millilitres de PBS froid à la fraction HDL et transférez-les dans un dispositif de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10K. Centrifuger dans un rotor à godets oscillants, à 4000 fois g, et quatre degrés Celsius, pendant 30 minutes. Dessaler la fraction HDL, une deuxième fois, à l’aide de 13 millilitres de PBS froid, et en centrifugeant comme précédemment.

Après la centrifugation, retirez la lipoprotéine contenant les solutés et maintenez-la à quatre degrés Celsius. Pour évaluer la qualité et la pureté des lipoprotéines isolées, une électrophorèse sur gel d’agarose a été réalisée avec des étalons de lipoprotéines humaines, inclus comme référence de taille. Les résultats représentatifs d’un isolement, sans bêta-mercaptoéthanol, ont montré que la fraction HDL est dépourvue de toute contamination par VLDL et présente une mobilité alpha typique.

Cependant, la fraction HDL présente également des traces de mobilité bêta dues à la contamination par des lipoprotéines. L’ajout de bêta-mercaptoéthanol à la solution C, lors de la dernière étape de centrifugation, élimine efficacement toutes les lipoprotéines contaminantes de la fraction HDL. Pour démontrer la faisabilité de la quantification des micro-ARN, transportés dans le HDL humain, purifiés avec cette méthode, deux micro-ARN différents ont été amplifiés par PCR quantitative en temps réel.

Dans ces graphiques d’amplification, les lignes horizontales représentent le seuil de détection. Des données PCR représentatives en temps réel provenant de HDL isolés, obtenues à partir de six échantillons, ont montré la détection cohérente des deux micro-ARN. Enfin, les analyses de la courbe de fusion montrent clairement un pic unique distinct pour les deux micro-ARN, ce qui correspond à une amplification spécifique dans la PCR précédente.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures, en même temps que les procédures de dessalage, si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de travailler à une température de quatre à huit degrés centigrades, en tout temps. Et d’ajuster la densité de chaque fraction de lipoprotéine avant l’ultracentrifugation.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que la microscopie électronique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la pureté du HDL. Après son développement, cette technique permettra aux chercheurs, dans le domaine du syndrome métabolique, d’explorer les microARN associés aux HDL en tant que biomarqueurs, chez l’homme suspecté d’être atteint d’une stéatose hépatique. Il peut également être utilisé pour mieux comprendre la fonction du HDL et les mécanismes moléculaires par lesquels il modifie la biologie cellulaire.