Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir des cellules de protoplastes de haute qualité à partir du soja afin d’examiner les mécanismes de régulation et de signalisation dans les cellules de soja vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les réseaux régulateurs tels que quel est leur gène cible immédiat, le facteur de transfusion ouvert, et quel est leur partenaire d’interaction, ouvrir une protéine. Le principal avantage de cette technique est l’art.

Il produit de grandes quantités de cellules de protoplastes de soja uniformes, et c’est simple et facile. En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est très difficile d’obtenir de beaux protoplastes à partir de feuilles de soja à moins d’unifolier à un stade spécifique. La sélection des feuilles à un stade de développement approprié est la clé du succès de la préparation des protoplastes de soja.

Coupez les feuilles unifoliées nouvellement développées des semis de soja âgés de 10 jours. Pour s’assurer que lorsqu’un échantillon donne un rendement élevé en protoplastes, prélevez au moins trois échantillons de feuilles unifoliées à des stades de développement légèrement différents. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, retirez la nervure médiane de chaque feuille unifoliée, puis coupez les restes en bandes de 0,5 à un millimètre.

À l’aide d’une paire de pinces, transférez délicatement les bandes de feuilles immédiatement dans 10 millilitres de solution enzymatique fraîchement préparée dans un tube de 15 millilitres. Infiltrez le vide dans les bandes de feuilles pendant 15 minutes à température ambiante. Incuber les bandes de feuilles dans la solution enzymatique en agitant doucement sous une faible lumière pendant quatre à six heures à température ambiante.

Au fur et à mesure que les protoplastes sont libérés, la solution enzymatique prend une couleur jaune-vert. Vérifiez la solution d’enzyme protoplast au microscope à un grossissement de 10x pour sélectionner l’échantillon avec la meilleure digestion de protoplaste. Les protoplastes libérés sont de forme sphérique, tandis que les cellules non digérées ont des formes irrégulières ou ovales.

Pour arrêter la digestion, versez doucement les 10 millilitres de solution d’enzyme protoplast avec la meilleure digestion de protoplast dans un tube de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de solution W5 à température ambiante. Retournez doucement le tube plusieurs fois. Ensuite, versez doucement la solution d’enzyme protoplast dans un filet de nylon propre de 75 microns placé sur un tube de 50 millilitres pour éliminer les tissus foliaires non digérés.

Ensuite, centrifugez la solution de protoplaste enzymatique à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, on retire délicatement le surnageant sans déranger la pastille de protoplaste. Suspendez à nouveau le protoplaste dans une solution W5 réfrigérée et maintenez le tube de 50 millilitres sur de la glace.

Après avoir compté le nombre de protoplastes sur un hémocytomètre au microscope, diluer à une concentration de deux fois 10 à la cinquième protoplaste par millilitre dans une solution W5 réfrigérée. Gardez le protoplast sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez la suspension à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante.

Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, prélever délicatement la solution W5 sans déranger la pastille de protoplaste. Remettre en suspension le protoplaste dans une solution de MMG à température ambiante à une concentration de deux fois 10 à la cinquième protoplaste par millilitre. Pour préparer le protoplaste à la transformation, utilisez des pointes de pipette non coupées de 200 microlitres pour fabriquer des aliquotes de 100 microlitres de protoplastes dans des tubes de microcentrifugation à faible adhérence de 1,5 millilitre.

Mettre de côté une aliquote pour servir de contrôle négatif. À l’aliquote restante des protoplastes, ajoutez 10 microlitres d’ADN plasmidique. Ajoutez lentement 110 microlitres de solution de cheville fraîchement préparée sur la paroi intérieure du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ensuite, retournez doucement et tournez le tube jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Incuber les mélanges de transformation pendant 15 minutes à température ambiante. Pour arrêter la transformation, ajoutez lentement 400 microlitres de solution W5 dans chaque tube de 1,5 millilitre à température ambiante, et retournez doucement le tube jusqu’à ce que la solution devienne homogène.

Centrifugez les tubes à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de solution WI dans chaque tube.

Enduisez la surface d’une plaque de culture tissulaire à six puits pour empêcher les protoplastes de coller à la plaque. Ajoutez un millilitre de sérum de veau stérile à cinq pour cent dans chaque puits et, après quelques secondes, retirez le sérum de veau à l’aide d’une pipette. Transférez les protoplastes remis en suspension dans les puits de la plaque de culture et couvrez la plaque avec un couvercle.

Avant la récolte, incubez les protoplastes à température ambiante pendant deux jours dans l’obscurité. Après deux jours, transférez la solution de protoplaste dans un tube de microcentrifugation à faible adhérence de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 100 fois G pendant une à deux minutes à température ambiante.

Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Transvasez 10 microlitres de protoplaste sur une lame de verre. Observez les signaux fluorescents sous fluorescence ou microscopie confocale en utilisant des protoplastes non transformés comme contrôle négatif.

Des cellules de protoplastes ont été préparées à partir de différents organes de soja âgé de 10 jours et observées au microscope. Les parois cellulaires de l’hypocaudale et de l’épicaudale étaient à peine digérées. Et certaines cellules sont restées attachées les unes aux autres.

Dans le plomb caudal et la racine, les parois cellulaires n’ont été enlevées que dans une petite partie des cellules. En revanche, un grand nombre de protoplastes ont été observés lors de l’utilisation d’unifolié. Les semis de cette photo de gauche à droite illustrent des feuilles unifoliées qui ne sont pas développées, juste étendues ou complètement développées.

Bien que les feuilles unifoliées non expansées et les feuilles unifoliées tout juste expansées aient donné des rendements élevés de protoplastes, la taille des protoplastes de l’unifolié nouvellement expansé était plus uniforme que celle de l’unifolié non expansé. Pour l’unifolié complètement expansé, les parois cellulaires étaient encore intactes dans la plupart des cellules. Le test d’une gamme de différentes quantités d’ADN plasmidique a suggéré que de plus grandes quantités d’ADN entraînaient une plus grande efficacité de transformation.

Des images confocales de protoplastes de soja transformés avec la construction qui exprime la GFP fusionnée au gène E1 spécifique de la légumineuse, ont montré une localisation nucléaire de la protéine de fusion E1 GFP, cohérente avec l’étude précédente utilisant le système protoplaste d’Arabidopsis. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser empiriquement chaque condition expérimentale, telle que la sélection de la bonne étape du matériel foliaire, la durée du temps de digestion de la paroi cellulaire, l’âge de concentration et la quantité d’ADN plasmidique pour la transformation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la réplication de l’ARN et des protéines peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels gènes ou quelles protéines sont régulés ou non régulés ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des cellules de protoplaste de soja de haute qualité.