Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

L'objectif général de cette procédure est de développer des lignées cellulaires de production pour les produits biologiques présentant une clonalité et une productivité élevées. Cela est réalisé en transfectant d'abord la cellule hôte avec de l'ADN codant pour le gène d'intérêt. L'étape suivante consiste à isoler les clones à forte production par tri cellulaire, suivie de la documentation de la formation de colonies à l'aide de l'imagerie Clone Select.

La dernière étape consiste à cribler et sélectionner les clones hautement productifs. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant la production d'anticorps en cultures continues et en mode fed-batch, grâce à la chromatographie liquide à phase inverse HPLC. Vidéo. La démonstration de cette méthode est essentielle, car les étapes de tri et de pcan 80 dgl sont difficiles à apprendre en raison de la configuration complexe requise pour ces procédures. Les scientifiques suivants d'un laboratoire démontreront ces procédures : transfection pour l'effet sur la cellule hôte, tri effectué par Jason Sanders pour la documentation de la formation de colonies, et échantillonnage effectué par Russell Kan sur le Tecan.

Et Eliza Pour commencer cette procédure, un jour avant la transfection, ensemencez les cellules hôtes dans un flacon de culture cellulaire contenant 15 millilitres de milieu de croissance. Incubez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 7,5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, préparez d'abord les complexes de transfection : diluez huit microgrammes d'ADN dans 800 microlitres de milieu de croissance sans sérum dans un tube stérile de microcentrifugeuse, puis mélangez délicatement. Ensuite, diluez 40 microlitres de lipide dans 800 microlitres de milieu de croissance sans sérum dans un tube en polystyrène.

Ajouter l'ADN dilué au Lipofectamine dilué. Mélanger doucement et incuber 30 minutes à température ambiante pour préparer les cellules hôtes à la transfection. Retirer le milieu de croissance des cellules et le remplacer par 6,4 millilitres de milieu de croissance sans sérum.

Ajoutez 1,6 millilitre des complexes de transfection au flacon. Mélangez délicatement en balançant le flacon. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant six heures.

Après six heures, ajouter huit millilitres de milieu de croissance au flacon et incuber à 37 degrés Celsius dans une étuve à dioxyde de carbone pendant la nuit, le jour suivant. Retirer le milieu par aspiration et ajouter du milieu de croissance frais au flacon. Incuber les cellules une nouvelle fois toute la nuit après l'incubation nocturne.

Remplacer le milieu de croissance par le milieu de sélection. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une incubateur à dioxyde de carbone pendant deux à trois semaines. Deux à trois semaines après la transfection, les cellules sont prêtes pour le clonage par tri cellulaire activé par cytométrie en flux : détacher les cellules du flacon et les centrifuger à 800 tr/min pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.

Ressuspendre les cellules dans le milieu de sélection, supplémenté avec 2 % d'albumine de sérum bovin. Ajouter ensuite un anticorps anti-IgG humaine marqué par un fluorochrome. Ajouter une dilution de un à 20, incuber sur glace pendant 15 à 30 minutes, puis laver deux fois avec du PBS froid et ressuspendre les cellules dans un volume de PBS 1× dans un tube en polypropylène.

Un exemple de cellules colorées est montré sur cette image pour un tri aseptique sur un BD FACS Aria. Préparez une plaque de culture cellulaire de 96 puits contenant 200 microlitres de milieu de sélection dans chaque puits. Chargez aseptiquement le tube contenant les cellules et analysez sur le BD FACS Aria. Enregistrez les résultats respectivement pour les cellules colorées et non colorées.

Régler les seuils et les paramètres pour trier les cellules uniques présentant le profil de marquage fluorescent souhaité dans la plaque 96 puits, puis incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux semaines. Documenter la formation de colonies dans la plaque 96 puits à l’aide d’un cloneur d’images aux jours 0, 3, 7 et 13 après le tri afin de s’assurer de la sélection de clones issus d’une seule cellule, puis procéder au criblage et à la sélection des clones hautement productifs. En premier lieu, enregistrer la position de l’échantillon dans la plaque d’analyse 96 puits réceptrice. Ensuite, utiliser un système robotisé de manipulation liquide pour transférer des aliquotes de 20 microlitres de surnageant dans chaque puits de la plaque d’analyse 96 puits. La production d’anticorps dans les échantillons est analysée par une méthode de type sandwich.

ELISA de détection de l'IgG humain sur le système de manipulation liquide de la manière suivante. Premièrement, les échantillons et un étalon sont chargés sur des plaques d'analyse précodées recouvertes d'anticorps anti-IgG humain. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant deux heures, puis soumises à trois lavages au PBS.

Ensuite, l'immunopure de l'anticorps de chèvre anti-IgG humaine conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) est ajouté aux puits à une dilution de un à 2000, et les puits sont incubés pendant une heure à température ambiante. Après une heure, les puits sont lavés trois fois avec du PBS, puis le substrat A BTS est ajouté.

Enfin, les plaques sont lues sur un lecteur de plaques en utilisant l'absorbance à 405 nanomètres pour la détection. À l’aide de cette plateforme automatisée, il a été observé que le niveau d’anticorps à la surface, reflété par la coloration avec un anti-IgG humain marqué par un fluorochrome, corrélait avec la productivité en anticorps de la cellule. Comme illustré ici pour les deux meilleurs clones issus de la population cellulaire présentant une forte expression d’anticorps à la surface, la productivité spécifique variait entre 50 et 70 picogrammes par cellule et par jour.

En revanche, la productivité en anticorps était d'environ 20 picogrammes par cellule et par jour pour les deux meilleurs clones issus de la population cellulaire présentant une faible expression membranaire d'anticorps. De plus, les lignées cellulaires développées par tri factiel sont plus stables en ce qui concerne la production d'anticorps que celles obtenues par dilution limitante manuelle. La productivité spécifique du meilleur clone, clone un, obtenu par dilution limitante manuelle, est passée d'environ 30 PCD à environ 10 PCD après 80 duplications cellulaires en culture.

En revanche, le meilleur sous-clone généré par tri FACS du clone deux a été capable de maintenir une productivité spécifique d’environ 20 PCD pendant au moins 100 doubles cellulaires. L’identification du site d’intégration du transgène dans le chromosome cellulaire par hybridation in situ fluorescente a démontré que le clone un est une population mixte de phénotype A et de phénotype B. En revanche, le clone trié par FACS semblait être une population plus homogène, avec 99,5 % des cellules présentant le phénotype A. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de développer des lignées cellulaires de production pour la fabrication de protéines thérapeutiques.