Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

L’objectif global de cette procédure est de développer la fabrication de lignées cellulaires pour des produits biologiques avec une clonalité et une productivité élevée. Ceci est accompli en transectant d’abord la cellule hôte avec de l’ADN, codant pour le gène d’intérêt. L’étape suivante de la procédure consiste à isoler les clones à haut rendement par des faits, puis à documenter la formation des colonies par l’imageur de sélection de clones.

La dernière étape consiste à filtrer et à sélectionner des clones très productifs. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la production d’anticorps dans des cultures continues et alimentées par lots par HPLC en phase inverse. Vidéo. La démonstration de cette méthode est essentielle car le tri des faits et les étapes pcan 80 dgl sont difficiles à apprendre en raison d’une configuration complexe impliquée dans ces procédures, les scientifiques suivants d’un laboratoire démontreront ces procédures pour la transfection de l’effet de la cellule hôte, en triant Jason Sanders pour la documentation de la formation de la colonie et Russell Kan pour l’échantillonnage de tecan.

Et Eliza : Pour commencer cette procédure un jour avant la transfection, ensemencez les cellules hôtes dans un flacon de culture cellulaire dans 15 millilitres de croissance. Douleur moyenne. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 7,5 % de dioxyde de carbone le lendemain, préparer les complexes de transfection diluer d’abord huit microgrammes, ADN dans 800 microlitres de milieu de croissance sans sérum dans un micro tube à centrifuger stérile mélangé doucement. Ensuite, diluez 40 microlitres de lèvre dans 800 microlitres de milieu de croissance sans sérum dans un tube en polystyrène.

Ajoutez l’ADN dilué à la lipofectamine diluée. Mélangez doucement et incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour préparer les cellules hôtes à la transfection. Retirez le milieu de croissance des cellules et remplacez-le par 6,4 millilitres de milieu de croissance sans sérum.

Ajouter 1,6 millilitre des complexes de transfection dans la fiole. Mélangez délicatement en balançant la fiole. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant six heures.

Après six heures, ajoutez huit millilitres de milieu de culture dans le ballon et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant la nuit le lendemain. Prélever le milieu par aspiration et ajouter le milieu de croissance frais dans la fiole. Incuber à nouveau les cellules pendant la nuit après l’incubation pendant la nuit.

Remplacez le milieu de culture par la sélection. Douleur moyenne. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux à trois semaines. Deux à trois semaines après avoir été transfectées, les cellules sont prêtes pour le clonage par cytométrie en flux, le tri cellulaire activé et le centrifugation à 800 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Remettre les cellules en suspension dans un milieu de sélection, complété par 2 % d’albumine sérique bovine. Ajoutez ensuite des anticorps IgG anti-humains marqués par fluorescence. Ajouter une dilution de un à 20 incuber sur de la glace pendant 15 à 30 minutes, puis laver deux fois avec du PBS froid pour remettre en suspension les cellules dans un XPBS dans un tube en polypropylène.

Un exemple de cellules colorées est montré dans cette image pour le tri aseptique sur un fax BD aria préparer une plaque de culture cellulaire de 96 puits qui contient 200 microlitres de milieu de sélection dans chaque puits. Chargez aseptiquement le tube avec des cellules et analysez les faits BD. Aria, enregistrez les résultats pour les cellules colorées et non colorées respectivement.

Réglez les portes et les paramètres pour trier les cellules individuelles du profil de coloration fluorescente souhaité dans la plaque à 96 puits Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux semaines au jour zéro, au troisième jour, au septième jour et au 13e jour après coup Tri de la formation de la colonie de documents dans la plaque à 96 puits sur un clone Sélectionnez l’imageur pour assurer la sélection des clones dérivés d’une seule cellule à cribler et à sélectionner pour une productivité élevée. Clones. Documentez d’abord la position de l’échantillon dans la plaque d’analyse réceptrice à 96 puits. Ensuite, utilisez un système robotisé de manipulation de liquides pour transférer des aliquotes de 20 microlitres de surnageant dans chaque puits de la plaque de test de 96 puits, la production d’anticorps dans les échantillons est analysée par un sandwich.

Détection humaine des IgG ELI SA sur le système de manipulation des liquides de la manière suivante. Tout d’abord, les échantillons et un étalon sont chargés sur des plaques de dosage anti-IgG humaines précodées. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant deux heures, suivies de trois lavages PBS.

Prochaine immuno chèvre pure anti-IgG humaine. Le HRP est ajouté aux plaques à une dilution de un à 2000 et les plaques sont incubées pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, les plaques sont lavées trois fois avec du PBS, puis le substrat A BTS est ajouté.

Enfin, les plaques sont rouges sur un lecteur de plaques en utilisant l’absorbance à 405 nanomètres pour la détection. À l’aide de cette plate-forme automatisée, il a été constaté que le niveau d’anticorps de surface réfléchi par la coloration avec des IgG anti-humaines marquées fluorescentes est corrélé à la productivité des anticorps de la cellule. Comme le montre ici pour les deux clones supérieurs générés à partir de la population cellulaire avec une expression élevée des anticorps de surface, la productivité spécifique variait de 50 à 70 picogrammes par cellule et par jour.

En revanche, la productivité des anticorps était d’environ 20 picogrammes par cellule et par jour pour les deux clones supérieurs générés à partir de la population cellulaire à faible expression d’anticorps de surface. De plus, les lignées cellulaires développées par tri des faits sont plus stables en ce qui concerne la production d’anticorps que celles qui ont été clonées par dilution manuelle limitante. La productivité spécifique du clone supérieur, généré par la dilution limite manuelle, est passée d’environ 30 PCD à environ 10 PCD après la culture pour 80 doublages de cellules.

D’autre part, le sous-clone supérieur généré par le clone de tri de fax deux a été capable de maintenir la productivité spécifique autour de 20 PCD pour au moins 100 doublages de cellules. L’identification du site d’intégration du transgène dans le chromosome cellulaire par hybridation in situ fluorescente a démontré que le clone un est une population mixte de phénotype A et de phénotype B.In contraste, le clone trié semblait être une population plus homogène avec 99,5 % des cellules du phénotype A.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer des lignées cellulaires de fabrication pour la protection des protéines thérapeutiques.