Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d'imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

L’objectif global de ce protocole histologique et d’imagerie est de présenter un système robuste qui préserve l’antigénicité de l’épitole et l’intégrité structurelle de la peau, ce qui permet d’exploiter pleinement les modalités d’imagerie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés lorsqu’il est nécessaire d’examiner la nature de tout type de cellule dans une architecture tissulaire tridimensionnelle complexe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques histologiques classiques est qu’elle est robuste et facile à réaliser.

De plus, le protocole complète parfaitement l’analyse tridimensionnelle en microscopie confocale. Commencez par couper la peau prélevée dans la région médiale dorsale d’une souris en morceaux rectangulaires. Chaque pièce doit être dimensionnée pour tenir dans le fond d’un cryomoule.

Une zone d’un centimètre carré de peau dorsale qui s’insère dans un cryomoule de 22 millimètres sur 30 millimètres sur 20 millimètres est démontrée ici. Après la fixation, poussez la peau lavée au fond du moule rempli d’OCT afin qu’elle affleure le fond. Marquez l’orientation du follicule pileux sur le cryomoule, car cela détermine l’orientation de la coupe cryo.

Transférez les blocs cryogéniques sur une plaque métallique dans un congélateur à moins 80 degrés pour éviter de flotter et de disloquer les tissus. Surveillez le processus de congélation pour maintenir l’orientation de la peau au fond du cryomoule, car des bulles d’air invisibles peuvent faire remonter la peau à la surface du cryomoule. Commencez par fixer un cryobloc congelé à l’étage d’un cryostat avec l’orientation du follicule pileux, comme indiqué sur le cryomoule le long du plan de section.

Il est essentiel d’ajuster correctement l’orientation exacte du follicule pileux sur le cryostat, car cette étape détermine le plan de coupe qui génère des tranches de peau avec toute la longueur des follicules pileux intacte. Utilisez le cryostat pour couper une section de 100 microns. Saisissez l’OCT autour du morceau de peau incrusté à l’aide d’une pince et transférez la section hors du cryostat dans la culture de 100 millimètres remplie de PBS.

À température ambiante, le PBS dissoudra l’OCT, laissant des tranches de peau faciles à manipuler avec des pinces. Après la section, utilisez une pince pour transférer les sections de peau flottantes dans le puits d’une plaque de 12 puits contenant 2,5 millilitres de PBS. Commencez le marquage immunofluorescent en ajoutant d’abord 500 microlitres de tampon PB dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre marqués.

Utilisez soigneusement une pince pour transférer les tranches de peau de la plaque à 12 puits dans les tubes à bloquer. Assurez-vous que toutes les tranches de peau sont complètement immergées. Placez les tubes de la microcentrifugeuse sur une bascule à 10 oscillations par minute ou moins, pendant une heure à température ambiante.

Étiquetez des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre séparés pour chaque tranche de peau et ajoutez 500 microlitres de tampon PB contenant la quantité appropriée d’anticorps primaires. Après une heure de blocage, transférez les tranches de peau dans les tubes fraîchement préparés contenant les anticorps. Incuber les tranches à quatre degrés Celsius pendant la nuit à basse vitesse sur une bascule.

Le lendemain, transférez les tranches dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS et lavez-les pendant une heure à température ambiante sur une bascule. Ensuite, transférez les tranches dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de tampon PB avec la concentration appropriée d’anticorps secondaires et de DAPI. Incuber à température ambiante pendant une heure avec balancement, si vous le souhaitez, les échantillons peuvent être conservés jusqu’à quatre jours à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur.

Avant l’imagerie, transférez les tranches de peau dans des tubes de microcentrifugation séparés contenant 500 microlitres de PBS pour laver les anticorps secondaires et le DAPI. Placez ensuite une lamelle de 22 millilitres sur 50 millilitres sur un fond sombre sous un microscope à dissection. Ensuite, utilisez une pipette de 1 000 microlitres avec l’extrémité de l’embout coupée, pour ajouter une gouttelette de glycérol à 100 % sur la lamelle.

Transférez la tranche de peau du tube de microcentrifugation sur la gouttelette de glycérol. Ensuite, tout en regardant à travers le microscope de dissection, utilisez des pinces pointues pour dérouler soigneusement les tranches de peau qui sont recroquevillées en les cajolant pour leur redonner leur forme naturelle tout en flottant dans du glycérol. Ne forcez pas le redressement non naturel de la tranche, car cela pourrait endommager les tissus.

Une fois que toute la longueur de la section est correctement orientée et aplatie sur la lamelle. Montez le tissu sur une lame de microscope ordinaire, cette étape redressera davantage la tranche de peau. Imagez les coupes de peau montées au glycérol dans les deux prochains jours.

Cette image montre une cryosection cutanée de 10 microns d’épaisseur obtenue classiquement, marquée avec de l’intégrine alpha six et de l’intégrine alpha huit, pour visualiser respectivement le compartiment épidermique et les muscles pili directeurs. Cette coupe transversale de tissu 3D de 100 microns d’épaisseur a été étiquetée de la même manière. L’image présentée est les projections maximales d’une grande pile z.

Les détails des deux images sont comparés côte à côte ici, dans les sections congelées classiques, la plupart des follicules pileux visualisés avec l’intégrine alpha six n’ont pas été sectionnés sur toute la longueur, générant principalement des follicules pileux incomplets par section, par rapport aux montures entières horizontales. Les follicules pileux intacts et les muscles pili arrecteurs intacts ont été quantifiés dans les sections classiques et horizontales. Une section pour la réplication biologique a été quantifiée, comme on le voit ici, la section entière du mont a une proportion plus élevée de follicules intacts et de muscles pili arrecteurs.

Une fois maîtrisée, cette technique de cryosectionnement peut être réalisée à des vitesses de plus de 15 sections par minute, tout en réalisant des échantillons parfaitement orientés si le montage a été effectué correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter et d’analyser des coupes transversales de tissus épais dans un environnement tridimensionnel.