Name: Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et dimagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez un protocole de traitement et d'imagerie pour l'analyse de coupes épaisses tridimensionnelles de peau de souris. Cette méthode préserve l'antigénicité et permet une visualisation intacte des follicules pileux par microscopie confocale.

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Les auteurs reconnaissent le parrainage de Thermo-Fisher Scientific et remercier Nikon Imaging Center à Kings College London pour un soutien lors de l&#39;acquisition d&#39;images confocales.

Toutes les expériences sur les animaux ont fait l&#39;objet d&#39;une approbation éthique locale et ont été exécutées selon les termes d&#39;une licence de gouvernement du gouvernement du Royaume-Uni. 1. Récolte de la peau et cryoconservation <ol><li> Les préparatifs. <ol><li> Préparez un plat de culture de 100 mm avec 25 ml de PFA à 4% et deux plats de culture de 100 mm avec 25 ml de 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Remplir les cryomolds rectangulaires épluchés par deux tiers avec un composé de température de coupe optimal (OCT). </li><li> Placez une plaque métallique, sur laquelle les cryoblocs peuvent être placés dans une étape ultérieure, dans le congélateur -80 ° C. </li></ol></li><li> Récolte de la peau, fixation et cryoconservation. <ol><li> Accrochez la région dorsale du cadavre d&#39;animal avec un rasoir électrique sec. NOTE: Dans cet exemple, on utilisait des souris de type sauvage du jour 21 postnatal. </li><li> Récolte les zones d&#39;intérêt sur la peau. NOTE: La région dorsomedial de la peau de souris ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Figure 1a) contient le pourcentage le plus élevé de follicules capillaires espacés et alignés, ce qui permet une orientation optimale pour la section. L&#39;élimination du tissu non cutané sous-jacent n&#39;est pas nécessaire mais peut être effectuée si nécessaire. </li><li> Coupez la peau récoltée en morceaux rectangulaires de taille appropriée pour s&#39;adapter au fond du cryomold, en tenant compte de la croissance directionnelle du grain de follicule capillaire. REMARQUE: Des tranches de peau plus petites peuvent être plus faciles à manipuler pour les novices, car elles sont moins susceptibles d&#39;être enchevêtrées pendant le processus d&#39;incubation et de montage. L&#39;exemple montré ici est une surface de dorsale de ~ 1 cm 2 , qui s&#39;insère dans un cryomold de 22 x 30 x 20 mm ( Figure 2a ). </li><li> Réparez la peau à température ambiante dans 25 mL de PFA à 4% pendant 10 à 30 minutes, selon l&#39;épaisseur des échantillons de peau ( Figure 1b ). </li><li> Lavez les échantillons de peau deux fois dans 25 ml de PBSPendant au moins 5 min chacun ( figure 1b ). </li><li> Dab les échantillons de peau sur une serviette en papier pour égoutter soigneusement le tissu d&#39;excès de PBS, ce qui peut entraîner une cristallisation pendant le processus de congélation et peut affecter les résultats de la cryostatation. REMARQUE: Un gradient de saccharose standard n&#39;est pas nécessaire. Cependant, cela peut également être incorporé dans le protocole à la discrétion de l&#39;utilisateur. </li><li> Soyez conscient de l&#39;orientation des follicules pileux pour chaque échantillon de peau. Utilisez un microscope de dissection pour une assistance visuelle (en particulier toute personne qui effectue le protocole pour la première fois). Insérez l&#39;échantillon de peau dans le cryomold rempli d&#39;OCT et équilibrez toutes les zones de la peau avec OCT en éliminant les bulles d&#39;air attachées à la surface des cheveux coupés à l&#39;aide de pinces ( figures 2a et 2b ). </li><li> Poussez la peau vers le bas du bloc rempli OCT pour qu&#39;il soit au ras du fond. REMARQUE: la peau peut être orientée dans n&#39;importe quelle direction, uneTant que le grain du follicule capillaire est noté pour les procédures de coupe appropriées. Les cryomolds seront réorientés lorsque les blocs sont attachés au cryostat pour la cryotypie. Marquez l&#39;orientation du follicule pileux sur le cryomold, car cette étape détermine l&#39;orientation ultérieure de la coupe du cryostat. </li><li> Transférer les cryoblocs sur la plaque métallique dans le congélateur à -80 ° C pour éviter la flottation et la dislocation du tissu. </li><li> Surveillez le processus de congélation pour maintenir l&#39;orientation de la peau au fond du cryomold, car les bulles d&#39;air non visibles peuvent provoquer l&#39;apparition de la peau à la surface de la cellule cryogénique. REMARQUE: Cryomolds avec des tissus congelés peuvent être stockés pendant plus d&#39;un an à -80 ° C et peuvent être réutilisés pour des sections supplémentaires. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Figure 1. Récolte et fixation de la peau de la souris. </stroNg&gt; (A) les tissus de la peau a été récolté dans la région dorso du cadavre animal. Les follicules capillaires dans cette région sont uniformément espacés et alignés et permettent donc une orientation optimale lors de la coupe, comme l&#39;indiquent les flèches. ( B ) Après avoir coupé des carrés d&#39;une taille appropriée qui s&#39;insère dans le cryomold, le tissu cutané a été fixé dans 4% de PFA pendant 15 min et a été lavé deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 2. Tissus épais en coupe transversale <ol><li> Préparation et orientation tissulaire à monter sur le cryostat. <ol><li> Préparer un plat de culture de 100 mm avec 15 ml de PBS. Placez-le sur une zone facilement accessible sur le cryostat. En outre, préparer une plaque de 12 puits avec 2,5 ml de PBS par puits; Étiquette selon les échantillons pour le stockage à long terme de la seCations à 4 ° C. Utilisez des pinces pour gérer les sections. </li><li> Réglez la température du cryostat à -20 ° C. REMARQUE: La température peut affecter la section, mais un bon guide est de commencer à -20 ° C. </li><li> Pour obtenir des sections d&#39;environ deux follicules capillaires épais, ajustez le cryostat pour couper des sections de 150 μm d&#39;épaisseur. REMARQUE: l&#39;épaisseur de la section peut varier en fonction des besoins de l&#39;utilisateur et des limites du microscope qui seront utilisées pour l&#39;analyse. REMARQUE: L&#39;orientation de l&#39;échantillon est essentielle pour l&#39;obtention de sections cutanées avec des follicules capillaires dans l&#39;orientation appropriée. Ceci est réalisé en montant correctement sur le bloc cryostat. Assurez-vous que le plan de coupe est parallèle à l&#39;orientation du follicule pileux ( Figure 2c ). Comme mentionné précédemment, l&#39;orientation correcte du plan de coupe dans l&#39;échantillon de peau est une étape cruciale pour déterminer la qualité des images qui seront acquises dansUne étape ultérieure. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Figure 2. Incorporation, cryoconservation et sectionnement. (A) Le marquage de la direction du follicule pileux (HF) sur le cryomold, indiqué par les flèches noires, est important pour une orientation appropriée pendant la cryotypie. ( B ) Le plan de section doit être aligné avec l&#39;orientation du follicule capillaire pour générer des sections dans lesquelles la longueur totale des follicules capillaires reste intacte. ( C ) Les sections ont été coupées selon l&#39;orientation du follicule pileux qui a été indiqué par les flèches noires sur le Cryomold. ( D ) Les sections transversales épaisses de tissu ont été collectées avec des pinces métalliques et ( e ) transférées dans un plat de culture de 100 mm contenant 1x PBS. ( F ) À température ambiante, le PBS dissout l&#39;OC.T. Composé qui entoure les sections transversales épaisses des tissus, comme l&#39;indiquent les flèches blanches. Les sections flottent librement dans le PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol start="2"><li> Cryosection. <ol><li> Couper une section à l&#39;aide du cryostat. Utilisez une pince pour collecter l&#39;OCT qui contient la peau intégrée ( Figure 2d ). REMARQUE: Utilisez un cryostat qui permet un mouvement et un réglage indépendants le long des axes X, Y et Z pour un positionnement optimal de l&#39;échantillon. Cela permet de générer des sections transversales de tissu idéalement alignées. </li><li> Transférer la section du cryostat dans le plat de culture de 100 mm rempli de PBS et continuer avec la prochaine tranche. Ne pas collecter les échantillons sur une glissière ( Figure 2e ). NOTE: À température ambiante, le PBS se dissoudraL&#39;OCT, en laissant des tranches de peau faciles à manipuler avec des pinces ( figure 2f ). REMARQUE: Un PBS frais peut être nécessaire dans le plat de culture de 100 mm après avoir dissous de nombreuses sections de tissu de 100 μm d&#39;épaisseur et peut être changé en conséquence. </li><li> Utilisez une pince pour transférer les sections de peau flottante sur le puits correctement étiqueté dans une plaque de 12 puits remplie de 2,5 ml de PBS ( Figure 3a , à gauche). REMARQUE: à 4 ° C, les échantillons peuvent être conservés pendant au moins deux jours. Pour le stockage à long terme des blocs OCT contenant de la peau après séchage, sceller la surface de coupe avec une gouttelette d&#39;OCT frais. Après la congélation de la goutte OCT, enveloppez le bloc OCT utilisé dans le parafilm et remettez-le dans le congélateur -80 ° C . </li></ol></li></ol> 3. Étiquetage immunofluorescent. <ol><li> Préparer le tampon PB (PBS additionné de 0,5% de lait écrémé en poudre, 0,25% de gélatine pour peau de poisson et 0,5% de Triton X-100) au moinsT 2 h à l&#39;avance, comme décrit précédemment 5 . NOTE: L&#39;azide de sodium peut être ajouté au tampon PB pour la conservation des anticorps pour l&#39;utilisation répétée du tampon de coloration. </li><li> Étiquetez les tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL et ajoutez 500 μL de tampon PB par tube. Utilisez avec précaution des pinces pour transférer les tranches de peau du PBS dans des tubes séparés contenant le tampon PB pour le blocage ( Figure 3a , à droite). Assurez-vous que toutes les tranches de peau sont complètement immergées. Placez les tubes de microcentrifugeuse sur une bascule à scie à des vitesses supérieures à 10 oscillations par minute, ce qui ne doit pas perturber l&#39;intégrité du tissu, pendant 1 h à température ambiante. REMARQUE: Il est essentiel que la vitesse ne dépasse pas 10 oscillations par minute sur le basculeur à scie, puisqu&#39;elle induira l&#39;enchevêtrement. <ol><li> Bien qu&#39;il soit possible d&#39;ajouter plus d&#39;une tranche par tube de microcentrifugeuse, pour économiser les anticorps, ne collez qu&#39;une seule tranche par tube. Pour diminuer l&#39;utilisation des anticorps, utilisez un volumeDe 250 μL. REMARQUE: si nécessaire, remplacer les tubes à microcentrifugation par, par exemple, des plaques à 96 puits. Cependant, le placement des sections transversales des tissus épais dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml permet la pénétration d&#39;anticorps plus efficace dans le tissu en raison de la perturbation du liquide améliorée. </li></ol></li><li> Étiquetez séparément des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL pour chaque tranche de peau et ajoutez 500 μL de tampon de PB et la quantité appropriée d&#39;anticorps primaire. Après 1 heure de blocage, transférer les tranches de peau dans les tubes fraîchement préparés contenant les anticorps. Incuber les tranches à 4 ° C pendant la nuit. NOTE: Dans cet exemple, on a utilisé les anticorps primaires suivants: CD49f anti-humain de rat FITC à une concentration de 1: 50 et une intégrine de souris / rat anti-intégrine alpha 8 à une concentration de 1: 100. </li><li> Le lendemain, préparez deux tubes séparés de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant 500 μL de PBS par échantillon. Laver les tranches de peau deux fois pendant 1 h à température ambianteE. </li><li> Préparez des tubes séparés de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant 500 μl de tampon PB avec la concentration appropriée d&#39;anticorps secondaires applicables et 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). NOTE: Les anticorps secondaires utilisés dans cet exemple sont Alexa Fluor 488 IgG anti-rat et Alexa Fluor 555 IgG anti-chèvre à une concentration de 1: 500. DAPI a été utilisé à une concentration de 1: 100. </li><li> Transférer soigneusement les échantillons de peau dans le tampon PB, qui contient l&#39;anticorps secondaire et le DAPI, et incuber les tranches de peau à température ambiante pendant 1 h à faible vitesse sur un rotateur ou un agitateur. </li><li> Conservez les tranches à 4 ° C dans le tampon PB contenant l&#39;anticorps secondaire et le DAPI pendant jusqu&#39;à quatre jours, et peut-être plus longtemps si l&#39;azide de sodium est ajouté au PBS. </li></ol><img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Figure 3. ImmunofluorescEtiquetage et montage. (A) les sections transversales du tissu flottant peuvent être stockées dans des plaques à 12 puits pendant au moins deux jours à 4 ° C. Avant l&#39;étiquetage immunofluorescent (IF), transférez les sections de tissus intéressantes dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant un tampon PB pour le blocage, comme indiqué par la flèche 1. Pour l&#39;étiquetage IF, respecter la procédure multi-étapes élaborée à l&#39;étape 3. Chacun Une partie de l&#39;étape 3 nécessite le transfert minutieux des sections transversales des tissus dans des tubes de microcentrifugation fraîchement préparés contenant une solution d&#39;anticorps primaire, une solution d&#39;anticorps secondaire ou un tampon de lavage, ce qui est indiqué par la flèche 2. ( b ) Après l&#39;étiquetage IF, Les sections sont débrouillées et aplaties dans une gouttelette de glycérol, en utilisant l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. ( C ) Une fois que la section transversale du tissu est entièrement aplatie sur le fond d&#39;un patin de recouvrement, une glissière de microscope régulière sert à monter la section. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 4. Montage pour visualisation microscopique <ol><li> Avant l&#39;imagerie, transférez les tranches de peau pour séparer les tubes de microcentrifugation contenant 500 μL de PBS pour éliminer les anticorps secondaires et DAPI. </li><li> Utilisez une pipette de 1000 μL, mais coupez les premiers 0,5 cm de la pointe de la pipette pour permettre la bonne pipetage du glycérol très visqueux. Placez une lamelle de 22 x 50 mm sur un fond sombre sous un microscope de dissection ( figure 3b ). </li><li> Ajouter une gouttelette de glycérone à 100% sur la feuille de recouvrement ( Figure 3b ). Transférer la tranche de peau du tube de microcentrifugeuse sur la gouttelette de glycerol. Utilisez le microscope de dissection et la pince pointue pour décoller soigneusement les tranches de peau qui sont enroulées. REMARQUE: lorsque la tranche flotte dans le glyGouttelette de cérile, elle peut être démêlée en favorisant la propension naturelle du tissu à revenir à sa forme normale. Ne pas forcer le redressement non naturel de la tranche, car cela pourrait endommager le tissu. </li><li> Montez le tissu une fois que la longueur totale de la section de la peau est correctement orientée et aplatie sur le bordereau de couverture; Utilisez une lame de microscope régulière. Cette étape va encore redresser la tranche de peau. REMARQUE: Évitez le piégeage d&#39;air ( Figure 3c ). </li><li> Image dans les sections de peau montées au glycérol au cours des deux prochains jours. REMARQUE: un stockage prolongé aura une influence négative sur la qualité des tissus et de l&#39;imagerie. Dans cet exemple, toutes les images ont été acquises avec un microscope confocal vertical en utilisant un objectif 20x. </li></ol>

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs souhaitent divulguer que la publication de ce manuscrit a été financée par Thermo-Fisher Scientific Inc.

Nous vous présentons ici la technique du « montage horizontal entier », qui présente plusieurs avantages par rapport aux sections congelées classiques. L’un des avantages de notre technique est qu’elle peut facilement être réalisée avec un équipement d’histologie standard et un microscope confocal. Deuxièmement, l’intégrité des tissus est préservée d’une manière supérieure à celle des cryosections standard. Par exemple, les adipocytes de la couche hypodermique (c’est-à-dire les adipocytes blancs dermiques (DWAT))9 sont sévèrement perturbés lors des cryocoupes standard, ce qui rend impossible l’étude des tissus chargés de tissu adipeux. Notre technique permet une analyse complète des adipocytes dans cette couche et peut être adaptée à d’autres tissus à forte teneur en adipocytes. De plus, cela permet d’améliorer la détection des cellules mésenchymateuses dans les études de traçage de la lignée 2,10.
Les cryocoupes standard, de par leur nature même, ne peuvent jamais révéler les véritables aspects 3D d’un tissu par microscopie confocale. Cela signifie que des sections plus épaisses sont avantageuses dans l’analyse de la peau, car les follicules pileux, ainsi que leurs sous-structures, peuvent traverser une profondeur qui dépasse l’épaisseur standard de 10 μm utilisée dans les cristallosections classiques. Nous sommes intrigués par le fait que d’autres tissus, tels que l’intestin et le cerveau, par exemple, présentent des défis similaires en ce qui concerne la visualisation du tissu comme une structure 3D 2,7,11,12,13. Curieusement, notre technique s’est déjà avérée bénéfique pour une utilisation dans certaines applications dans les intestins14. Nous pensons que notre protocole horizontal de montage entier a le potentiel d’être appliqué à tout autre tissu nécessitant une analyse 3D.

La révolution de l&#39;équipement d&#39;imagerie microscopique fournit des instruments d&#39;imagerie sophistiqués et à haute résolution. Cependant, lors de l&#39;acquisition d&#39;une image microscopique d&#39;une section transversale en tissu tridimensionnelle complète (3D), la préparation des échantillons présente des défis considérables et peut être le facteur limitant de la définition de la qualité de l&#39;image. Chaque étape distincte mérite une attention particulière afin de préserver la morphologie des tissus et l&#39;antigenité des protéines cibles, de minimiser les artefacts induits par le traitement et de maximiser la qualité de l&#39;image finale. Par exemple, l&#39;analyse traditionnelle de la peau nécessite une image avec une vue de l&#39;épiderme et du derme, avec des follicules capillaires correctement orientés, permettant l&#39;analyse anatomique des contributions des cellules souches à l&#39;homéostasie de la peau 1 , 2 . Cela nécessite une concentration approfondie sur la façon dont la peau est intégrée et sectionnée. Fait important, les follicules capillaires peuvent être plus épaisQue 100 μm, ce qui surpasse largement l&#39;épaisseur standard de la paraffine ou de la section congelée, ce qui se traduit par un niveau d&#39;analyse inférieur par rapport aux supports entiers ou aux sections transversales épaisses 3 , 4 , 5 . Ensemble, chaque étape de la préparation des échantillons pour l&#39;analyse microscopique est un facteur déterminant qui affectera l&#39;analyse d&#39;image. Ici, un nouveau protocole de traitement pour l&#39;épaisseur, l&#39;analyse de la section transversale du tissu 3D, que nous appelons &quot;montage horizontal entier&quot;, est présentée. Le protocole préserve hautement l&#39;antigénicité et permet l&#39;exploitation complète de couches épaisses de la peau en utilisant un équipement d&#39;imagerie confocal standard. Il s&#39;agit d&#39;un guide complet pour l&#39;utilisation de la peau pour un traitement et une image en coupe transversale des tissus épais, y compris la récolte de récolte de tissus et de paraformaldéhyde (PFA) (étape 1), la génération de sections de tissu de 100 μm d&#39;épaisseur avec un cryostat (étape 2), Et l&#39;étiquetage et le montage immunofluorescent (étapes 3 et 4). Les résultats représentatifs comparent les images confocales de deux techniques distinctes de préparation histologique: la cryosection classique et l&#39;épaisseur, la coupe transversale de tissu 3D, mettant en évidence les avantages des «montures horizontales entières» pour l&#39;utilisateur potentiel de ce protocole.

<table><tbody><tr><td>Gélatine maison PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, à partir de peau de poisson d’eau froide</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>BDH Fournitures de laboratoire</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. composé</td><td>VWR produits chimiques</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moules d’encastrement</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Carré S-22</td></tr><tr><td>Lait en poudre écrémé</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrine alpha 8 Anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-rat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 âne anti-chèvre IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Plats</td><td></td><td></td><td></td>de culture</tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr>pince <td></td><td></td><td></td><td>métallique pointue</td></tr><tr><td>1,5 ml microtubes à centrifuger</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 Plaques</td> à puits <td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à dissection</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul et 1000 ul Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro ; l XL Pointe GraduéeUne pointe filtrante (stérile)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro ; l Pointe biseautéOne Filter Tip (stérile)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td><td></td><td></td><td></td>vibrante</tr><tr><td>à bascule Lames de microscope, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Lunettes de protection, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

horizontal whole mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Traiter un tissu d&#39;intérêt pour générer une image microscopique qui soutient un argument scientifique peut être difficile. L&#39;acquisition d&#39;images microscopiques de haute qualité ne dépend pas entièrement de la qualité du microscope, mais aussi des méthodes de traitement des tissus, qui impliquent souvent de multiples actions ou étapes critiques. En outre, les types de cellules mésenchymateuses dans la peau et d&#39;autres tissus représentent un nouveau défi pour la préparation et l&#39;imagerie des tissus. Ici, nous présentons un processus complet, de la récolte des tissus à la microscopie. Notre technique, appelée «montage horizontal entier», est celle dont les novices peuvent rapidement devenir compétents et qui permettent la préservation et la détection des antigènes dans des sections de 60 à 300 μm d&#39;épaisseur coupées avec un cryostat. Les sections de cette épaisseur fournissent une visualisation améliorée de la microarchitecture tissulaire dans un environnement tridimensionnel. En outre, le protocole préserve les cellules mésenchymateuses d&#39;une manière qui améliore la qualité de l&#39;image lorsquePar rapport aux sections de cryostat ou de paraffine standard, augmentant ainsi l&#39;efficacité et la fiabilité de l&#39;immunocoloration. Nous croyons que ce protocole profitera à tous les laboratoires qui visualisent la peau et éventuellement d&#39;autres tissus et organes.

Pour souligner les avantages de notre technique, nous avons comparé notre épaisseuse, la section transversale de tissu 3D, le «montage horizontal entier», aux sections classiques congelées. Les sections classiques congelées ont été coupées comme décrit précédemment 5 . Pour fournir une structure visuelle pour l&#39;épiderme dans les images microscopiques, nous avons été immunostained pour l&#39;intégrine alpha-6 (Itga6), qui est un composant qui ancre les cellules épidermiques à la membrane basale sous-jacente 6 . Nous avons également étiqueté le muscle pili (APM), qui est responsable de la piloération (également connu sous le nom de &quot;peau de poule&quot;), avec l&#39;intégrine alpha-8 7 . Dans les sections classiques congelées, la plupart des follicules capillaires visualisés avec Itga6 n&#39;ont pas été sectionnés sur toute la longueur, générant des follicules capillaires à prédominance incomplète par section, par rapport aux supports horizontaux entiers ( Figure 4a -4d </strong&gt;). Les sections transversales en tissu épais permettent d&#39;acquérir plus de couches d&#39;empilement Z par rapport aux sections classiques de 10 μm, ce qui permet une image 3D plus complète. Cela devient encore plus apparent lors de l&#39;étude de l&#39;intégrité des APM, qui sont associés aux follicules capillaires et à la membrane basale sus-jacente. Dans les criosections classiques, la grande partie des APM a été fractionnée ( Figure 4a -4d ). De plus, l&#39;intégrité tissulaire du compartiment hypodermal est conservée dans des supports horizontaux entiers, par rapport à la destruction des adipocytes lorsque des criosections sont attachées à des diapositives en verre chaud, ce qui est un artefact de congélation-décongélation bien connu ( Figure 4a -b , comparer hypoderme Régions) 8 . <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Figure 4. Mo entier horizontalNt par rapport à une cryosection classique. (A) la peau Classiquement obtenu cryosections 10 um d&#39; épaisseur et (b) de 100 pm d&#39;épaisseur de tissus 3D sections transversales ont été marquées avec de visualiser le compartiment épidermique et arrecteur muscles de pili intégrine alpha-6 (ITGA6) et l&#39; intégrine alpha-8 (Itga8) , respectivement. Les images des sections transversales épaisses de tissu sont représentées comme projections maximales d&#39;une grande pile Z. Les cadres blancs indiquent les zones agrandies, affichées dans ( c ) les sections classiques et ( d ) horizontales de montage complet. ( E ) les follicules capillaires intacts et ( f ) les muscles pili intact ont été quantifiés dans les sections classiques et horizontales de montage intégral. Les barres d&#39;échelle indiquent 100 μm. Les données sont représentées par la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Une section par réplication biologique ( n = 3) a été quantifiée. T-test non apparié * P &lt;0,05, *** P &lt;0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce travail présente un nouveau protocole de traitement et d&#39;imagerie pour une analyse transversale en tissu tridimensionnelle épaisse qui permet l&#39;exploitation complète des modalités d&#39;imagerie confocal. Ce protocole préserve l&#39;antigénicité et représente un système robuste pour analyser l&#39;histologie de la peau et potentiellement d&#39;autres types de tissus.

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

L'objectif général de ce protocole histologique et d'imagerie est de présenter un système fiable qui préserve l'antigénicité épithéliale et l'intégrité structurelle de la peau, permettant ainsi une exploitation complète des modalités d'imagerie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés lorsqu'il est nécessaire d'examiner la nature de tout type de cellule au sein d'une architecture tissulaire tridimensionnelle complexe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes histologiques classiques est qu'elle est robuste et facile à réaliser.En outre, ce protocole complète parfaitement l'analyse tridimensionnelle en microscopie confocale. Commencez par découper la peau prélevée sur la région médiane dorsale d'une souris en morceaux rectangulaires. Chaque morceau doit avoir une taille adaptée pour tenir au fond d'un cryomoule.Une zone de peau dorsale d'un centimètre carré, pouvant s'insérer dans un moule à cryogel de 22 millimètres sur 30 millimètres sur 20 millimètres, est présentée ici. Après la fixation, appuyer la peau lavée vers le fond du moule rempli d'OCT afin qu'elle soit bien à plat contre le fond. Indiquer l'orientation des follicules pileux sur le moule à cryogel, car cela détermine l'orientation de la coupe au cryostat.Transférez les blocs cryogéniques sur une plaque métallique dans un congélateur à moins 80 degrés pour éviter le flottement et le déplacement du tissu. Surveillez le processus de congélation afin de maintenir l'orientation de la peau au fond du moule cryogénique, car des bulles d'air invisibles peuvent provoquer la remontée de la peau à la surface du moule. Commencez par fixer un bloc cryogénique congelé sur la platine d'un cryostat en respectant l'orientation du follicule pileux, telle qu'indiquée sur le moule cryogénique selon le plan de coupe.Un réglage approprié de l'orientation exacte du follicule pileux sur le cryostat est essentiel, car cette étape détermine le plan de coupe permettant d'obtenir des tranches de peau conservant la longueur complète des follicules pileux. Utilisez le cryostat pour découper une section de 100 microns. Saisissez l’OCT entourant le fragment de peau inclus avec des pinces et transférez la section du cryostat vers la culture de 100 millimètres remplie de PBS.À température ambiante, le PBS dissoudra l’OCT, laissant des tranches de peau faciles à manipuler avec une pince. Après la coupe, utilisez une pince pour transférer les sections de peau flottantes dans une cavité d'une plaque de 12 puits contenant 2,5 millilitres de PBS. Commencez le marquage immunofluorescent en ajoutant d'abord 500 microlitres de tampon PB dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre préalablement étiquetés.Utilisez soigneusement une pince pour transférer les tranches de peau depuis la plaque 12 puits vers les tubes destinés au blocage. Assurez-vous que toutes les tranches de peau soient complètement immergées. Placez les tubes microcentrifuges sur un agitateur rotatif oscillant à 10 oscillations par minute ou moins, pendant une heure à température ambiante.Étiquetez des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre séparés pour chaque tranche de peau, et ajoutez 500 microlitres de tampon PB contenant la quantité appropriée d'anticorps primaire. Après une heure de blocage, transférez les tranches de peau dans les tubes fraîchement préparés contenant les anticorps. Incubez les tranches à quatre degrés Celsius toute la nuit à faible vitesse sur un agitateur rotatif.Le lendemain, transférez les tranches dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS et laissez-les incuber une heure à température ambiante sur un agitateur. Ensuite, transférez les tranches dans des tubes microcentrifuge séparés de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de tampon PB avec la concentration appropriée d'anticorps secondaires et de DAPI. Incubez une heure à température ambiante avec agitation ; si désiré, les échantillons peuvent être conservés jusqu'à quatre jours à quatre degrés Celsius avant un traitement ultérieur.Avant l’imagerie, transférez les tranches de peau dans des tubes microcentrifuges séparés contenant 500 microlitres de PBS afin de laver les anticorps secondaires et le DAPI. Ensuite, placez une lame de 22 millilitres par 50 millilitres sur un fond sombre sous un microscope stéréo. Puis, à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres dont l’extrémité de la pointe a été coupée, ajoutez une goutte de glycérol à 100 % sur la lame.Transférez la tranche de peau du tube microcentrifuge vers la goutte de glycérol. Ensuite, tout en observant au microscope stéréoscopique, utilisez une pince fine pour dérouler soigneusement les tranches de peau enroulées, en les ramenant délicatement à leur forme naturelle tout en flottant dans le glycérol. N'essayez pas d'imposer un redressement forcé de la tranche, car cela pourrait endommager le tissu.Une fois que toute la longueur de la section est correctement orientée et aplatie sur la lame. Monter le tissu sur une lame de microscope ordinaire ; cette étape redressera davantage la tranche de peau. Observer les sections de peau montées dans le glycérol au cours des deux jours suivants.Cette image montre une coupe cryogénique de peau classique de 10 micromètres d'épaisseur marquée avec l'intégrine alpha six et l'intégrine alpha huit, afin de visualiser respectivement le compartiment épidermique et les muscles des follicules pileux. Cette coupe transversale de tissu 3D de 100 micromètres d'épaisseur a été marquée de la même manière. L'image présentée correspond aux projections maximales d'un grand empilement en z.Détail provenant des deux images comparé côte à côte ici : dans les sections congelées classiques, la plupart des follicules pileux visualisés avec l'intégrine alpha six n'étaient pas sectionnés sur toute leur longueur, produisant principalement des follicules pileux incomplets par section, par rapport aux montages horizontaux entiers. Les follicules pileux intacts et les muscles arrecteurs des poils intacts ont été quantifiés dans les sections de montage classique et horizontale. Une section par réplicat biologique a été quantifiée ; comme on le voit ici, la section en montage entier présente une proportion plus élevée de follicules intacts et de muscles arrecteurs des poils intacts.Une fois maîtrisée, cette technique de cryocoupes peut être réalisée à une vitesse de plus de 15 coupes par minute, tout en obtenant des échantillons parfaitement orientés si le montage a été correctement effectué. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de traiter et d'analyser des coupes transversales de tissus épais dans un environnement tridimensionnel.

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JoVE Journal

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Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et dimagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel (Vidéo) | JoVE Journal

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d'imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

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