치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

이 방법론의 전반적인 목표는 조직 공학 응용 분야를 위한 하이드로겔을 매우 쉽게 합성하는 것입니다. 이 방법은 3차원 세포 배양 시스템에서 높은 세포 생존율을 유지할 수 있는 가능성과 같은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠른 반응을 사용하여 하이드로겔 시스템을 쉽게 수정하여 세포 생존력을 유지하는 능력을 향상시킬 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 척수 손상 치료로 확장되는데, 그 이유는 골격 내에 적재된 세포가 손상된 조직을 재건할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 재생 의학으로서의 세포 치료와 많은 방법론에서 그 의미에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 뼈, 심장 및 연골과 같은 다른 여러 시스템에도 적용할 수 있습니다.

RGD-아지드 유도체를 합성하려면 1밀리리터의 수산화나트륨에 RGD 50mg을 용해시킵니다. 그런 다음 24mg의 4-아지도부타노일 클로라이드를 2밀리리터의 테트라하이드로푸란에 녹입니다. 모든 RGD 용액을 섭씨 0도에서 4-아지도부타노일 염화물 용액에 적가적으로 추가합니다.

실온으로 되돌리고 밤새 저어줍니다. 1 몰 HCL의 1 밀리리터를 추가합니다. 회전 증발기를 사용하여 감압 하에서 용매를 제거합니다.

양성자 핵 자기 공명 분광법으로 얻은 생성물을 특성화하고 샘플을 중수소 산화물 또는 D2O에 용해시킵니다. PAA 알카인 변형을 수행하려면 15ml의 증류수에 35% 중량의 PAA 용액 200mg을 용해시킵니다. 프로파르길아민 염산염 15.4mg을 추가합니다.

그런 다음 섭씨 50도까지 가열하여 1:1 비율의 아세토니트릴 증류수 용액 14ml에 42.8mg의 HOBt를 용해시킵니다. 실온에서 모든 HOBt 용액을 PAA 용액에 추가합니다. 다음으로, 반응 혼합물에 53.6mg의 EDC를 첨가합니다.

하나의 몰 HCL을 사용하여 PH를 5.5로 조정하고 실온에서 밤새 반응 시스템을 저어줍니다. 다음으로 염화나트륨 11.2g을 증류수 2리터에 녹입니다. 그런 다음 200 중량 기준 37 % 중량 HCL의 200 마이크로 리터를 첨가하십시오.

분자량 컷오프가 3.5 kilodaltons인 멤브레인을 사용하여 용액을 투석합니다. 3일 동안 투석을 수행합니다. 200 마이크로리터의 37중량 HCL을 함유한 갓 준비한 증류수 2리터로 투석 용액을 매일 교체하십시오.

최종 용액을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 양성자 핵 자기 공명 분광법(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy)으로 기능화된 고분자를 특성화하여 샘플을 D2O에 용해시킵니다. PAA-RGD 폴리머를 합성하려면 78mg의 PAA 변성 알카인을 10ml의 증류수에 용해시킵니다.

그런 다음 25mg의 RGD-아지드 유도체를 5ml의 테트라히드라푸란에 용해시킵니다. 모든 RGD 용액을 고분자 용액에 첨가합니다. 다음으로 요오드화 구리 2.2mg을 추가합니다.

그리고 아스코르브산나트륨 2.2mg. 생성된 혼합물을 교반하면서 섭씨 60도에서 밤새 환류시킵니다. 혼합물을 섭씨 25도로 식히십시오.

용액을 투석하려면 11.2g의 염화나트륨을 증류수 2리터에 녹이고 200중량 기준 37% HCL을 첨가합니다. 3일 동안 투석을 수행합니다. 200 마이크로리터의 37중량 HCL을 함유한 갓 준비한 증류수 2리터로 투석 용액을 매일 교체하십시오.

그런 다음 최종 용액을 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 생성된 PAA-RGD 폴리머를 성분에 대해 수행된 대로 특성화하고 저장합니다. 카보머 40mg과 기능화된 PAA 10mg을 실온에서 인산염 완충 식염수 9mg에 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.

용액에 PEG 400mg을 넣고 45분 동안 계속 저어줍니다. 교반을 멈추고 시스템이 30분 동안 안정될 때까지 기다립니다. 그런 다음 1 몰 수산화물을 사용하여 PH를 7.4로 조정합니다.

얻어진 혼합물 5 밀리리터에 아가로스 분말 25 밀리그램을 첨가한다. 끓을 때까지 30초에서 1분 동안 500와트의 마이크로파 방사선을 시스템에 조사합니다. 그리고 전자기적으로 용액을 섭씨 80도까지 가열합니다.

온도가 섭씨 50도까지 떨어질 때까지 혼합물을 실온에 노출시켜 두십시오. 그런 다음 5ml의 PBS를 첨가하여 1:1 부피 비율로 용액을 얻습니다. 직경 1.1cm의 강철 실린더가 들어있는 12-멀티웰 플레이트를 준비합니다.

용액에서 500마이크로리터 분취액을 꺼내 각 강철 실린더에 넣습니다. 시스템이 완전히 겔화될 때까지 플레이트를 45분 동안 그대로 두십시오. 하이드로겔을 얻기 위해 스테인리스 스틸 집게를 사용하여 실린더를 제거합니다.

RGD 기능성 하이드로겔의 물리화학적 특성을 특성화하기 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. Carbomer 974P, PAA-RDD 및 PEG는 아가로스와 함께 마이크로파 조사 후 통계적 무작위 중축합에 참여합니다. PEG 및 아가로스에 포함된 수산기는 Carbomer 947P 및 PAA-RGD에 존재하는 카르복실기와 반응하여 ACPEG-RGD 하이드로겔을 형성합니다.

유변학적 특성을 고려할 때, 저장 탄성률은 손실 탄성률보다 약 한 자릿수 높은 것으로 밝혀졌으며, 이는 점성 물질이 아닌 탄성을 나타냅니다. 또한, 하이드로겔 거동이 낮은 변형률 값에서 탄성 계수에 의해 지배된다는 것이 명확하게 보입니다. 주사 전자 현미경은 RGD 기능화된 하이드로겔 샘플과 기능화가 없는 하이드로겔의 형태를 보여줍니다.

두 하이드로겔 모두 서로 연결된 기공의 고도로 얽힌 구조를 가지고 있으며, 일부 더 큰 기공에는 작은 기공이 있고 일부 비골 네트워크는 기공 벽에 있는 것으로 나타났습니다. 유사한 특성은 RGD의 존재가 폴리머 네트워크를 변경하지 않음을 나타냅니다. 이 개발 이후, 이 기술은 다른 여러 질병에서 이러한 세포 배양 시스템의 안정성을 탐구하기 위한 조직 공학 분야의 연구의 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 하이드로겔을 기능화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 생존 가능한 줄기 세포를 유지하는 능력을 향상시킵니다.