Name: Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez l'identification des protéines cibles de petites molécules par photoaffinité dans des cellules HEK 293 T vivantes. Cette méthode préserve l'environnement cellulaire natif pour étudier les mécanismes d'action des médicaments.

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Nous remercions le Dr Ben Nacev pour ses conseils sur la conception du protocole de marquage de photoaffinité, le Dr Wei Shi pour la synthèse de la sonde de photoaffinité de l’itraconazole, le Dr Yongjun Dang pour ses conseils sur les expériences de réduction d’affinité, et les autres membres du laboratoire J.O.L. pour leurs commentaires utiles et leur soutien. Ce travail a été soutenu en partie par une bourse de la Fondation PhRMA en pharmacologie/toxicologie (à S.A.H.) ; Subvention de l’Institut national du cancer R01CA184103 ; l’Institut de recherche médicale sur les agents de bord ; Fondation du cancer de la prostate (J.O.L.) ; et le Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, qui est financé en partie par la subvention UL1 TR 001079 du National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).

NOTE: Ce protocole a été adapté de MacKinnon et Taunton 10 pour une utilisation dans des cellules vivantes. 1. Préparation des cellules cultivées <ol><li> Préparer 6 cm des boîtes de culture de cellules stériles pour le nombre d&#39;échantillons souhaités (voir ci-dessous). NOTE: Un plat de cellules est utilisée par condition de traitement, mais si plus de protéines est nécessaire 2 ou 3 plats peuvent être préparés par condition et combinés après irradiation UV. <ol><li> Préparer au moins 3 plats de cellules; Contrôle négatif avec du DMSO seulement (D), le traitement de la sonde seulement (P), et de la sonde + concurrent (C). </li><li> Eventuellement, préparer un 4 ème plat comme aucun contrôle UV, à traiter avec la sonde mais non soumis à la lumière UV. Remarque: si des molécules multiples concurrents doivent être testés, tels que différents analogues de la petite molécule d&#39;intérêt, préparer des plaques concurrentes supplémentaires si nécessaire. </li></ol></li><li> Ajouter des cellules HEK293T à des boîtes de culture dans 4 milieux de culture ml. Utiliser 3,5 millions de caunes par plaque. REMARQUE: le nombre de cellules doit être déterminée pour chaque type de cellule de sorte que les cellules sont confluentes à près de 100% au début de l&#39;expérience, afin d&#39;obtenir le rendement maximal de protéine. Pour HUVEC, utiliser 0,3 millions de cellules par plaque. Une bonne approximation est de 1/10 des cellules dans un plat cm confluentes 15. des cellules HEK293T devraient être cultivées dans Dulbecco Modified Eagles Medium additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Remettre les cellules dans l&#39;incubateur de culture (37 ° C, 5% CO2) pendant une nuit. </li></ol> 2. Le traitement des cellules et photoréticulation <ol><li> Le lendemain, pré-aliquote les médicaments suivants dans 1,5 ml microtubes: <ol><li> Pour le premier traitement, ajouter 4 pl de DMSO à 2 tubes et 4 pl de 10 mM de concurrent ( par exemple, le composé parent non modifié) à 1 tube. </li><li> Pour le deuxième traitement, ajouter 16 pi de DMSO à 1 tube et 16 pi de 50 &amp;# 181; M photoaffinité sonde à 2 tubes. NOTE: La concentration optimale peut être différente pour les différentes sondes (voir la discussion), mais entre 200-500 nM est un bon point de départ (ici, nous utilisons 200 nM). La concentration du compétiteur doit être supérieure à celle de la sonde au moins 20 fois (ici, nous utilisons 10 uM). La concentration finale de DMSO ne doit être égale dans toutes les plaques et ne doit pas dépasser 0,5% (volume 20 ul). </li></ol></li><li> Apportez les plaques de cellules dans la hotte de culture cellulaire et ajouter les médicaments pré-aliquote de l&#39;étape 2.1.1 comme suit: Aspirer 1 ml de milieux de culture, la remise en suspension du médicament pré-aliquotés dans les médias, et en ajoutant le doucement à la chute de la plaque sage. Ajouter le DMSO à la (D) Plaque DMSO et la sonde (P) plaque, et ajouter le concurrent à la concurrence (C) plaque. Retourner les plaques dans l&#39;incubateur de culture pendant 30 min. </li><li> Avec les lumières de la hotte de culture estompés, ajouter la sonde pré-aliquotés de l&#39;étape 2.1.2 pour sonder (P) et de la concurrence (C) plaques et ajouter laDMSO à la plaque de DMSO (D), comme ci-dessus. Remettre les plaques à l&#39;incubateur de culture pendant 1 heure. </li><li> Pendant l&#39;incubation, préparer les éléments suivants; Un plateau de glace qui peuvent convenir à toutes les plaques; tampon de lyse glacé (PBS [pH 8,5] + inhibiteur de protéase 1x cocktail [complet EDTA libre, dilué de solution 50x stock faite dans l&#39;eau]; 200 pl / plaque); microtubes étiquetés D, P ou C pour chacune des différentes conditions de traitement sur de la glace. </li><li> 15 min avant la fin de l&#39;incubation de 1 h, mis en place la lampe UV (365 nm) dans la chambre froide et allumez-le pour réchauffer l&#39;ampoule. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation avec la sonde, placez les plats sur la glace. Laver les cellules doucement avec 5 ml PBS glacé (pH 7,4) pour éliminer l&#39;excès sonde. Re-couvrir les cellules avec 4 ml PBS glacé. </li><li> Placer le plat de cellules centrées 3 cm sous la lampe UV sur le dessus d&#39;un sac de glace pour réduire au minimum le chauffage de la lampe. Irradiation pendant 3 min. Retirer le plat sur le plateau de glace et de répéter pour tous les échantillons. </li><li> UNEirradiation près avoir, aspirer le PBS des cellules et ajouter 200 pi de PBS glacé (pH 8,5) avec des inhibiteurs de la protéase à chaque plaque. Détacher les cellules de la plaque à l&#39;aide d&#39;une raclette en caoutchouc et le transfert des tubes à centrifuger pré-étiquetés sur la glace. </li><li> Ajouter du SDS à une concentration finale de 0,4% (10 pl de SDS à 10% dans 250 ul de l&#39;échantillon). ATTENTION: la poudre SDS est dangereux. Éviter d&#39;inhaler la poudre SDS en portant un masque sur le nez et la bouche. </li><li> Lyse des cellules par sonication de la suspension pour 10 impulsions (sortie 1, cycle de service de 30%) et incuber sur la glace pendant 1 min avant une deuxième série de 10 impulsions. </li><li> Si nécessaire, retirez 2 pl de suspension et vérifier sous un microscope optique pour assurer la lyse cellulaire complète. </li><li> Faire bouillir les échantillons sur une plaque chauffante réglée à 95 ° C pendant 5 min pour terminer la lyse des cellules et dénaturer toutes les protéines. </li><li> Mesurer la concentration en protéine dans chaque échantillon en utilisant un dosage de protéines compatible avec les détergents spectrophotométrique, par exemple the Dc protéine test 19, selon les instructions du fabricant, avec un spectrophotomètre pour mesurer l&#39; absorbance à 750 nm. </li><li> Normaliser la concentration en protéine de 2,5 mg / ml (ou si les concentrations sont inférieures à 2,5 mg / ml, normalise l&#39;échantillon avec la concentration en protéines plus basse) en y ajoutant du PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS selon les besoins (par exemple, si les échantillons sont 5 mg / ml dans 250 ul, ajouter 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg / ml). </li></ol> 3. Fixation de Tag Fluorescent par Cliquez Chimie pour la visualisation des protéines marquées <ol><li> Enlever 40 pi de lysat cellulaire et le transfert à un nouveau microtube. Maintenir les lysats restants pour une réaction avec de la biotine-azide (étape 4). </li><li> Ajouter les réactifs suivants dans l&#39;ordre: 0,2 ul fluor-azoture (mM de solution 1 dans le DMSO), 0,58 ul PTCE (mM 100 dans de l&#39;eau avec 4 équivalents NaOH ajouté, préparé frais), et 3,38 ul TBTA (1.7 mM dans un rapport de 4: 1 de t-butanol au DMSO). Vortex pour mélanger. </li><li> Ajouter 1,14 ul CuSO 4 5H 2 O (50 mM dans l&#39; eau) pour démarrer la réaction. Vortex brièvement et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 50 pi de tampon d&#39;échantillon SDS 2x pour arrêter la réaction. À ce stade, exécutez les échantillons directement sur ​​un gel SDS-PAGE 20 pour obtenir les meilleurs résultats, ou conserver à -20 ° C pendant la nuit si nécessaire. </li><li> Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant le chargement sur le gel. REMARQUE: Etant donné que le poids moléculaire de la protéine cible est généralement pas connue à ce stade, il est recommandé de faire fonctionner 2 gels ayant des concentrations d&#39;acrylamide différentes ( par exemple, 8% et 15%), ou d&#39; un gel large gradient de plage de poids moléculaire ( à savoir, 4-15%), pour assurer une couverture complète du poids moléculaire. </li><li> Lorsque le front de colorant ait atteint la fin du gel, de continuer à exécuter le gel pendant 5 minutes pour assurer que tous les excès unreacted fluor-azoture a complètement quitté le gel. </li><li> Retirer le gel à un récipient avec ddH 2 O et incuber pendant 10 min avec agitation douce, pour laver tous les excès de fluor-azoture. </li><li> Placer le gel sur une plaque de verre et analyser le gel à l&#39;aide d&#39;un scanner de gel Typhoon fluorescent selon les instructions du fabricant. </li></ol> 4. Fixation de biotine Tag par Click Chemistry for Affinity Purification des protéines marquées <ol><li> Des lysats restants de l&#39;étape 3.1, en utilisant la quantité maximale après la protéine de normalisation de telle sorte que tous les échantillons sont le même volume (par exemple, si après normalisation à 2,5 mg / ml, les volumes d&#39;échantillons résultants sont 500, 550, et 600 ul, en utilisant 500 pi de chaque). </li><li> Pré-effacer les lysats en ajoutant 50 pi de billes streptavidine agarose à haute capacité, 2x pré-lavés avec du PBS (pH 7,4). Incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation. </li><li> Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Retirer til surnageant dans un nouveau tube sur la glace et jeter les perles. </li><li> Retirer 1-2% de l&#39;échantillon de DMSO dans un nouveau tube marqué &quot;entrée&quot;. Ajouter un volume équivalent de 2x SDS tampon d&#39;échantillon et conserver à -20 ° C. </li><li> Par 500 pi de lysat, ajouter les réactifs suivants: 1,38 ul biotine-azoture (10 mM dans du DMSO), 5,5 pi PTCE, et 32,5 ul TBTA. Vortex pour mélanger. </li><li> Ajouter 11 ul CuSO 4 5H 2 O par 500 pi de lysat et vortex brièvement. Incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter 4 volumes d&#39;échantillon d&#39;acétone refroidi à -20 ° C. Vortex les échantillons et incuber pendant la nuit à -80 ° C pour précipiter les protéines complètement et retirer la biotine qui n&#39;a pas réagi azide. </li><li> Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les protéines précipitées. </li><li> Aspirer le surnageant complètement, et resolubiliser les protéines par traitement aux ultrasons dans 150 pl de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS. </li><li&gt; Ajouter 600 pl de PBS (pH 7,4) pour diluer la concentration de SDS à 0,2%. </li><li> Ajouter les échantillons de 30 ul prélavés billes de streptavidine-agarose de haute capacité et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation. </li><li> Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant contenant les protéines non liées et défausse. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de lavage (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, 0,2% de SDS, pH 7,4) aux billes, et incuber pendant 5 minutes à température ambiante avec rotation. </li><li> Répétez les étapes 4.12 et 4.13 3 fois. </li><li> Aspirer le tampon de lavage complètement des perles, et d&#39;ajouter 30 ul de tampon d&#39;échantillon 2 x SDS. </li><li> Incuber pendant 5 min sur un bloc C à la chaleur à 95 ° pour libérer les protéines des perles. </li><li> Centrifuger les billes pendant 1 min à 13 000 xg à la température ambiante. NOTE: A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à ce que prêt à fonctionner SDS-PAGE. Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant utilisation. </li><li> Avec attentionpipetter le tampon d&#39;échantillon contenant des protéines hors des perles, et charger sur SDS-PAGE 20 (voir considérations importantes ci - dessous). Les perles peuvent être sauvegardés pour rebouillage plus tard si nécessaire. NOTE: Pour la détection des protéines par coloration à l&#39;argent, de meilleurs résultats sont obtenus en utilisant un gel épais de 1 mm. Si une bande doit être coupée du gel coloré à l&#39;argent pour la spectrométrie de masse (MS) analyse, préparer tous les réactifs frais à partir de solutions stériles et laisser un puits vide entre les deux échantillons sur le gel. Pour chaque bande découpée dans la voie de la sonde, une tranche parallèle devrait être prélevé sur la voie de DMSO de sorte que les protéines de fond peuvent être soustraites. Pour la validation de la protéine ID par western blot, il est essentiel de charger également l&#39;échantillon d&#39;entrée de l&#39;étape 4.4 lors de l&#39;exécution du gel SDS-PAGE. </li><li> Suivre un protocole standard pour l&#39;une ou l&#39; autre coloration à l&#39; argent ou 21 transfert de Western pour détecter la 22 protéine (s) cible. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Différentes approches de l&#39;identification des cibles de petites molécules peuvent être regroupées en deux catégories: de haut en bas, où le phénotype cellulaire du médicament est utilisé pour affiner ses cibles potentielles en fonction de leurs fonctions connues, ou bottom-up, où la cible est identifié directement par voie chimique ou génétique 3. Top-down ou les études phénotypiques peuvent identifier certains processus cellulaires affectés par le médicament (par exemple, la transcription / trad...

de petites molécules bioactives fonctionnent fondamentalement par interaction avec et en modifiant la fonction d&#39;une ou plusieurs molécules &quot;cibles&quot;, le plus souvent des protéines dans la cellule. Dans la découverte de médicaments, quand un composé actif est découvert par le dépistage phénotypique, l&#39;identification de la cible moléculaire (s) de ce composé est crucial, non seulement pour comprendre le mécanisme d&#39;action et les effets secondaires potentiels du composé, mais aussi pour éventuellement découvrir nouvelle biologie sous - tend le modèle de la maladie et ouvrant la voie pour le développement de nouvelles classes mécanistiques de la thérapeutique 1. Bien que l&#39;identification des cibles est pas nécessaire pour un médicament à être utilisé en thérapeutique, ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante que les nouveaux médicaments candidats sont plus susceptibles de réussir dans les essais cliniques, et donc d&#39;obtenir de meilleurs rendements sur investissement, si une cible validée est connue 2. Ainsi, il y a eu un intérêt croissant pour les méthodes d&#39;identification des petitsprotéines cibles molécule. Une expérience d&#39;identification de cible classique repose généralement sur ​​la purification par affinité, où la petite molécule d&#39;intérêt est immobilisée sur une résine et mis en incubation avec des lysats de cellules entières, après quoi les protéines non liées sont éliminées par lavage et les protéines restantes sont éluées et identifiés 3. Bien que cette technique a été utilisée pour identifier les cibles de nombreuses petites molécules 4, il ne convient pas comme procédé d&#39;identification cible universelle pour plusieurs raisons. Tout d&#39;abord, la protéine cible doit conserver sa conformation native lors de la lyse cellulaire, afin de conserver sa capacité à se lier à la petite molécule. Cela peut être particulièrement problématique pour les protéines membranaires, qui subissent souvent des changements conformationnels après avoir été retiré de son environnement d&#39;origine, ou simplement d&#39;agrégats et précipitent hors de la solution. D&#39;autre part, la petite molécule doit être chimiquement modifiée de façon à ce qu&#39;il puisse être immobilisé sur la résine tout en conservantsa capacité à se lier à la protéine cible. poches de liaison profondes peuvent donc devenir inaccessibles à une petite molécule, une fois qu&#39;il est fixé à la résine. En troisième lieu, l&#39;affinité de liaison doit être suffisamment élevée pour que l&#39;interaction soit maintenue pendant les étapes de lavage, ce qui rend l&#39;identification des interactions d&#39;affinité inférieurs difficiles. En quatrième lieu, les conditions environnementales telles que le pH, la concentration d&#39;ions, ou la présence d&#39;autres molécules endogènes peuvent varier dans l&#39;espace intérieur de la cellule et sont parfois des conditions préalables pour les interactions médicament-cible. Ainsi, trouver les bonnes conditions pour permettre et maintenir l&#39;extérieur de la cellule de liaison peut nécessiter une quantité importante d&#39;essais et d&#39;erreurs. Marquage photoaffinité évite ces problèmes en permettant la liaison d&#39;une petite molécule et sa cible dans le contexte natif d&#39;une cellule covalente. Plutôt que immobilisant la petite molécule dans une large résine volumineux, la molécule est plutôt modifiée chimiquement pour installer deux petits g fonctionnelleroupes: un groupement photoactivable qui permet une réticulation covalente à la protéine cible lors de l&#39;irradiation avec une longueur d&#39;onde particulière de la lumière, et un groupe rapporteur qui permet à la protéine cible à détecter et ensuite isolé. Les cellules vivantes sont traitées avec la sonde de photoaffinité, la sonde se lie de manière covalente et la réticulation de la protéine cible et le complexe sonde-protéine est ensuite isolée intacte. La spécificité de liaison à la cible sonde est mise en évidence en réalisant une expérience de compétition en parallèle, où un excès du composé parent est utilisé pour concourir à une distance de liaison de la sonde à la protéine cible. La conception et la synthèse des sondes de photoaffinité varie considérablement d&#39;une petite molécule à l&#39;autre, et ne seront pas couverts par ce protocole; cependant, plusieurs excellentes discussions sur le sujet ont été publiés 5-9. La considération principale est que la sonde conserve l&#39;activité biologique du composé parent, par conséquent presumabment de liaison à la même cible (s). Relation structure-activité (SAR) des études doivent être effectuées pour déterminer quelles parties de la molécule peuvent être modifiés sans perte de bioactivité. Une variété de différents groupes chimiques ont été utilisés comme agents de reticulation, y compris photoactivables diazirine, la benzophénone, l&#39; azide et aryle, qui présentent chacune des avantages et des inconvénients 10. De même, il y a plusieurs étiquettes de reporteurs qui ont été utilisées pour isoler des protéines de liaison à la sonde. Les groupes rapporteurs peuvent être fonctionnels eux - mêmes, tels que la biotine couramment utilisés ou des marqueurs fluorescents, ou peuvent être des précurseurs qui nécessitent une fonctionnalisation supplémentaire postérieure à l&#39;étape de photoréticulation, qui ont l&#39;avantage d&#39;être plus petite et donc moins susceptibles de compromettre l&#39; activité biologique 11. Dans ce protocole, nous avons utilisé une sonde de photoaffinité contenant un groupe diazirine de photoréticulation et un alcyne terminal pour la fixation d&#39;un groupe reporter par un Cu (I) -catalyzed Azide-Acétylène Sharpless-Huisgen cycloaddition (ou cliquez) Réaction 12-15. Les études SAR, sonder la conception et la synthèse, et les résultats de ces études ont été publiés ailleurs 16-18.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Rendre frais jour d’utilisation. Préparez 100 mM de bouillon dans de l’eau avec 4 eq NaOH.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl] amine (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp ;</td><td>Préparez un stock de 1,7 mM dans un rapport de 4:1 entre le t-butanol et le DMSO, stockez à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre (CuSO4&#8226 ; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>Préparez 50 mM de bouillon dans de l’eau, conservez-le à température ambiante.</td></tr><tr><td>Biotin-azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104-100</td><td>Préparez un stock de 10 mM dans du DMSO, stockez-le à -20&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azide&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>Préparer un stock de 1 mM dans DMSO, stocker à -20&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>Lampe UV 365 nm</td> Les lunettes anti-UV <td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>doivent être portées pendant le fonctionnement.</td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de protéase, sans EDTA</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Préparez une solution 50x dans l’eau et conservez-la à -20&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>Sonificateur sonificateur</td><td>Branson</td><td>250</td><td>réglé sur la sortie 1, service 30 %.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Scanner à gel fluorescent</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Utilisez le laser rouge pour détecter Alexa-fluor 647.</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Dc compatible avec les détergents</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>billes d’agarose streptavidine haute capacité.</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagles Moyenne, faible teneur en glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon SDS (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Référence LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des protéines de petites molécules de liaison dans un natif cellulaire environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

L’identification de la ou des cibles moléculaires des petites molécules est une étape difficile mais nécessaire vers la compréhension de leur mécanisme d’action. Bien que plusieurs méthodes d’identification de cibles aient été développées et utilisées pour élucider avec succès les protéines de liaison d’une variété de petites molécules, ces techniques présentent des inconvénients qui les rendent inadaptées à la détection de certains types d’interactions entre petites molécules et cibles. En particulier, les interactions non covalentes qui dépendent de conditions cellulaires natives, telles que celles des protéines membranaires dont les structures peuvent être perturbées lors de la lyse cellulaire, ne se prêtent souvent pas aux méthodes d’identification des cibles basées sur l’affinité. Ici, nous démontrons une méthode dans laquelle une sonde contenant un groupe photolabile est utilisée pour se réticuler de manière covalente à la protéine de liaison à la petite molécule dans l’environnement de la cellule vivante, permettant la détection et l’isolement de la protéine cible sans qu’il soit nécessaire de maintenir l’interaction après la lyse cellulaire. Cette technique est un outil précieux pour étudier de petites molécules biologiquement intéressantes dont les mécanismes sont inconnus, tant dans le contexte de la biologie fondamentale que de la découverte de médicaments.

Les résultats présentés ici ont été obtenus avec une sonde de photo-affinité de l&#39;itraconazole médicament antifongique, dont l&#39;utilisation a été précédemment publiée 16. Ces résultats démontrent l&#39;utilisation de la technique de marquage par photoaffinité des cellules vivantes afin d&#39;identifier avec succès une protéine de liaison à l&#39;itraconazole majeure de 35 kDa en tant que protéine de la membrane dépendant de la tension Anion canal 1 (VDAC1). <p class...

Nous décrivons ici une méthode d’identification des protéines de liaison aux petites molécules à l’aide du marquage par photoaffinité. L’avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire vivant, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les protéines cibles de petites molécules en utilisant une sonde de photoaffinité capable de se lier à sa cible dans des cellules vivantes, permettant ainsi l'isolement et l'identification ultérieures de cette cible. Cette méthode peut être utilisée pour élucider le mécanisme d'action moléculaire des médicaments ou d'autres petites molécules. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles ont lieu dans l'environnement cellulaire natif, éliminant ainsi le risque de perturbation de la structure native des protéines et des conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.Commencez cette procédure en préparant des boîtes de culture cellulaire stériles de six centimètres, en fonction du nombre d'échantillons souhaités. Généralement, une boîte de cellules est utilisée par condition de traitement. Trois boîtes de cellules seront préparées pour cette démonstration : une contrôle négatif avec seulement du DMSO, étiqueté D, un traitement avec la sonde uniquement, étiqueté P, et une sonde plus un compétiteur, étiqueté C. Ajoutez à chaque boîte de culture 3,5 millions de cellules HEK 293 T dans quatre millilitres de milieu de culture.Incuber les cellules toute la nuit. Avant de traiter les cellules, prélever les médicaments nécessaires en aliquotes dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre. Pour le prétraitement avec le compétiteur, ajouter quatre microlitres de DMSO à chacun des deux tubes, et quatre microlitres de compétiteur à 10 millimolaire à un tube.Pour le traitement par la sonde, ajouter 16 microlitres de DMSO dans un tube, et 16 microlitres de sonde de photoaffinité à 15 micromolaire dans chacun des deux autres tubes. Placer les boîtes de culture cellulaire dans la hotte de culture cellulaire pour l'ajout des médicaments préaliquotés. Aspirer un millilitre de milieu de culture à partir de la boîte de traitement de compétition, le transférer dans le tube microcentrifuge contenant le compétiteur préaliquoté, puis resuspendre le médicament dans le milieu.Ajouter délicatement le mélange de milieu et de médicament sous forme de gouttes dans la boîte. De la même manière, ajouter du DMSO dans la boîte de contrôle négatif et dans la boîte témoin. Remettre les boîtes dans l’incubateur pendant 30 minutes.Après 30 minutes, ramenez les boîtes dans le caisson de culture et baissez l'éclairage. Ajoutez le DMSO préaliquoté dans la boîte témoin négative, et le sondage aux boîtes de sondage et de compétition. Replacez les boîtes dans l'incubateur pendant une heure.Après une heure, placez les boîtes sur de la glace. Lavez délicatement les cellules de chaque boîte avec cinq millilitres de PBS glacé pour éliminer l'excès de sonde. Recouvrez à nouveau les cellules avec quatre millilitres de PBS glacé.Placer une boîte de cellules, centrée à trois centimètres sous la lampe UV et posée sur un bloc de glace, afin de minimiser le chauffage dû à la lampe, et irradier pendant trois minutes. Retirer la boîte et la placer sur de la glace. Irradier ainsi tous les échantillons.Après irradiation de tous les échantillons, aspirez le PBS des cellules et ajoutez 200 microlitres de PBS glacé contenant des inhibiteurs de protéases dans chaque boîte. Détachez les cellules de la boîte à l’aide d’un grattoir en caoutchouc et transférez-les dans des tubes microcentrifuge préétiquetés placés sur de la glace. Ajoutez du SDS à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,4 %. Lysis les cellules en soniquant la suspension pendant 10 impulsions, incubez sur glace pendant une minute, puis soniquez à nouveau pendant 10 impulsions.Faites bouillir les échantillons sur un bloc chauffant réglé à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de compléter la lyse cellulaire et de dénaturer toutes les protéines. Après avoir mesuré la concentration en protéines dans chaque échantillon, comme décrit dans le protocole écrit, normalisez la concentration en protéines à 2,5 milligrammes par millilitre en ajoutant du PBS pH 8,5 contenant 0,4 % de SDS selon les besoins. Pour commencer cette procédure, transférez 40 microlitres de chaque lysat cellulaire préparé dans le segment précédent dans un nouveau tube microcentrifuge.Ajouter les réactifs suivants dans cet ordre : 0,2 microlitre d'azoture de fluor, 0,58 microlitre de TCEP et 3,38 microlitres de TBTA. Vortexer pour homogénéiser. Ajouter 1,14 microlitre de sulfate de cuivre pentahydraté pour démarrer la réaction.Vortexez brièvement et incubez à température ambiante pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillonnage SDS 2X pour arrêter la réaction. Faites migrer les échantillons sur un gel SDS-PAGE, et lorsque le front de colorant a atteint l’extrémité du gel, poursuivez la migration pendant cinq minutes supplémentaires afin de garantir que tout l’excès d’azoture marqué au fluorophore non réagi ait complètement quitté le gel.Après avoir éliminé tout l'excès de fluorure d'azide, placer le gel sur une plaque de verre et analyser le gel à l'aide d'un scanner de gel fluorescent, conformément aux instructions du fabricant. Pour l'attachement d'une étiquette biotine, utiliser la quantité maximale de lysats cellulaires après la normalisation des protéines, de sorte que tous les échantillons aient le même volume. Pré-nettoyer les lysats en ajoutant chaque échantillon à un nouveau tube contenant 50 microlitres de billes d'agarose streptavidine à haute capacité préalablement lavées.Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec agitation rotative. Récupérer les billes par centrifugation. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge placé sur de la glace, puis jeter les billes.Pour 500 microlitres de lyzat, ajouter les réactifs suivants : 1,38 microlitre d'azoture de biotine, 5,5 microlitres de TCEP et 32,5 microlitres de TBTA. Vortexer pour homogénéiser. Ajouter 11 microlitres de sulfate de cuivre pentahydraté par 500 microlitres de lyzat et vortexer brièvement.Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter quatre volumes d’échantillon d’acétone refroidie à 20 degrés Celsius, vortexer les échantillons et incuber toute la nuit à 80 degrés Celsius afin de précipiter complètement les protéines et d’éliminer le biotine-azide non réagi. Le jour suivant, centrifuger les échantillons à 17 000 × g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour former un culot des protéines précipitées.Aspirez complètement le surnageant, ajoutez 150 microlitres de PBS pH 7,4 et 1 % SDS à chaque échantillon, puis resolubilisez les protéines par sonication. Ajoutez 600 microlitres de PBS à chaque échantillon afin de diluer la concentration de SDS à 0,2 %, puis ajoutez l'échantillon dans un nouveau tube contenant 30 microlitres de billes d'agarose streptavidine haute capacité préalablement lavées. Incubez une heure à quatre degrés Celsius sous agitation rotative.Après une heure, récupérez les billes par centrifugation à 1000 x g pendant trois minutes. Aspirez et jetez le surnageant, contenant les protéines non liées. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage aux billes, puis incubez cinq minutes à température ambiante sous agitation.Centrifuger, éliminer le surnageant et laver à nouveau avec le tampon de lavage. Après le dernier lavage, aspirer complètement le tampon de lavage des billes, puis ajouter 30 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 2X. Incuber pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius afin de libérer les protéines des billes.Centrifuger les billes à 13000 x g à température ambiante pendant une minute. Prélever soigneusement au pipetage le tampon d'échantillonnage, contenant les protéines, au-dessus des billes, pour le SDS-PAGE. La visualisation des protéines après marquage avec la sonde fluorescente est illustrée par ce gel analysé en fluorescence.La bande protéique spécifique majeure, d'environ 35 kilodaltons, est uniquement présente dans la piste de la sonde et est compétitivement éliminée par un excès de composé parent. La même bande de 35 kilodaltons a été visualisée par coloration argent après un tirage à l'avidine biotinylée, puis identifiée par spectrométrie de masse comme étant la protéine membranaire VDAC1. L'identité de cette protéine a été confirmée ultérieurement à l'aide d'un anticorps spécifique dirigé contre VDAC1.Le signal est présent dans la voie du sonde et diminue dans la voie de compétition. L'inclusion de la fraction d'entrée permet de s'assurer que l'anticorps fonctionne et que la protéine d'intérêt peut être détectée dans le lysat. L'augmentation légère du poids moléculaire des échantillons de pull-down est due à la sonde liée de manière covalente.Les conséquences d'une exécution incorrecte de certaines étapes du protocole sont illustrées. Un retrait incomplet de l'excès de fluor-azide entraîne de larges traînées noires au bas du gel analysé en fluorescence, tandis qu'un pré-nettoyage insuffisant des lysats et/ou un lavage insuffisant des billes produisent un gel coloré à l'argent présentant une coloration de fond très élevée. Du début à la fin, l'expérience de précipitation par affinité prend deux à trois jours pour être réalisée.Une fois la protéine cible isolée et identifiée par spectrométrie de masse ou par immunotransfert, des expériences supplémentaires de validation spécifiques à la cible doivent être réalisées afin d'évaluer la pertinence de cette cible par rapport au phénotype induit par le médicament.

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SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d'étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt dans les cellules vivantes. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau.

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