Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les protéines de liaison de petites molécules à l’aide d’une sonde de photoaffinité, qui peut se lier à sa cible dans des cellules vivantes, permettant ainsi l’isolement et l’identification ultérieurs de la cible. Cette méthode peut être utilisée pour élucider le mécanisme d’action moléculaire de médicaments ou d’autres petites molécules. Le principal avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire natif, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Commencez cette procédure, en préparant des boîtes de culture cellulaire stériles de six centimètres, pour le nombre d’échantillons souhaité. En règle générale, une boîte de cellules est utilisée par condition de traitement. Trois boîtes de cellules seront préparées pour cette démonstration, et le contrôle négatif avec DMSO uniquement, étiqueté D, traitement par sonde uniquement, étiqueté P, et sonde plus concurrente, étiquetée C.To chaque boîte de culture, ajoute 3,5 millions de cellules T HEK 293 dans quatre millilitres de milieu de culture.

Incuber les cellules pendant la nuit. Avant de traiter les cellules, pré-aliquote les médicaments nécessaires dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pour le prétraitement du concurrent, ajoutez quatre microlitres de DMSO dans chacun des deux tubes, et quatre microlitres de 10 millimolaires dans un tube.

Pour le traitement par sonde, ajoutez 16 microlitres de DMSO dans un tube et 16 microlitres de sonde de photoaffinité micromolaire dans chacun des deux tubes. Amener les boîtes de culture cellulaire dans le capot de culture cellulaire pour l’ajout des médicaments pré-aliquotes. Aspirez un millilitre de milieu de culture de la boîte de traitement de compétition, transférez-le dans le tube de microcentrifugation qui contient le concurrent pré-aliquote et remettez le médicament en suspension dans le milieu.

Ajoutez délicatement le milieu et le mélange de médicament dans le plat. De la même manière, ajoutez du DMSO à la fois à la boîte de contrôle négatif et à la boîte de sonde. Remettez la vaisselle dans l’incubateur pendant 30 minutes.

Au bout de 30 minutes, ramenez les plats dans la hotte de culture et tamisez les lumières. Ajoutez le DMSO pré-aliquote dans la parabole de contrôle négatif et la sonde dans la sonde et les paraboles de compétition. Remettez la vaisselle dans l’incubateur pendant une heure.

Au bout d’une heure, placez la vaisselle sur de la glace. Lavez délicatement les cellules de chaque plat avec cinq millilitres de PBS glacé pour éliminer l’excès de sonde. Couvrez à nouveau les cellules avec quatre millilitres de PBS glacé.

Placez une parabole de cellules, centrée à trois centimètres sous la lampe UV sur un sac de glace, pour minimiser l’échauffement de la lampe, et irradiez pendant trois minutes. Retirez le plat et placez-le sur de la glace. De cette manière, irradiez tous les échantillons.

Après l’irradiation de tous les échantillons, aspirez le PBS des cellules et ajoutez 200 microlitres de PBS glacé avec des inhibiteurs de protéase dans chaque boîte. Détachez les cellules de la boîte à l’aide d’un grattoir en caoutchouc et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation pré-étiquetés sur de la glace. Ajouter des FDS à chaque échantillon jusqu’à une concentration finale de 0,4 %Lyser les cellules en sonifiant la suspension pendant 10 impulsions, en l’incubant sur de la glace pendant une minute, puis en la sonifiant pendant 10 autres impulsions.

Faites bouillir les échantillons sur un bloc chauffant réglé à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour terminer la lyse cellulaire et dénaturer toutes les protéines. Après avoir mesuré la concentration en protéines dans chaque échantillon, comme décrit dans le protocole textuel, normalisez la concentration en protéines à 2,5 milligrammes par millilitre, en ajoutant PBS PH 8,5 plus 0,4 % SDS au besoin. Pour commencer cette procédure, transférez 40 microlitres de chaque lysat cellulaire, préparé dans le segment précédent, dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ajoutez les réactifs suivants dans cet ordre, 0,2 microlitre de farine-azoture, 0,58 microlitre de TCEP et 3,38 microlitres de TBTA. Vortex à mélanger. Ajoutez 1,14 microlitre de sulfate de cuivre pentahydraté pour démarrer la réaction.

Agitez brièvement et incubez à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon 2X SDS pour éteindre la réaction. Analysez les échantillons sur un gel SDS-PAGE, et lorsque le front du colorant a atteint la fin du gel, continuez à faire fonctionner le gel pendant cinq minutes supplémentaires pour vous assurer que tout l’excès de farine-azoture n’ayant pas réagi est complètement sorti du gel.

Après avoir éliminé tout excès de farine, placez le gel sur une plaque de verre et scannez le gel à l’aide d’un scanner de gel fluorescent, selon les instructions du fabricant. Pour la fixation d’une étiquette de biotine, utilisez la quantité maximale de lysats cellulaires après la normalisation des protéines, de sorte que tous les échantillons aient le même volume. Pré-éclaircissez les lysats en ajoutant chaque échantillon dans un nouveau tube, contenant 50 microlitres de billes d’agarose streptavidine haute capacité prélavées.

Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec rotation. Granulez les billes par centrifugation. Retirez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation sur de la glace et jetez les billes.

Pour 500 microlitres de lysat, ajoutez les réactifs suivants, 1,38 microlitre de biotine-azoture, 5,5 microlitres de TCE et 32,5 microlitres de TBTA. Vortex à mélanger. Ajoutez 11 microlitres de sulfate de cuivre pentahydraté pour 500 microlitres de lysat et vortex brièvement.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez quatre volumes d’échantillons d’acétone, refroidis à 20 degrés Celsius, vortex les échantillons et incubez toute la nuit à 80 degrés Celsius, pour précipiter complètement les protéines et éliminer la biotine-azoture qui n’a pas réagi. Le lendemain, centrifugez les échantillons à 17 000 x g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les protéines précipitées.

Aspirez complètement le surnageant, ajoutez 150 microlitres de PBS PH 7.4 et 1 % SDS à chaque échantillon, et resolabilisez les protéines par sonication. Ajoutez 600 microlitres de PBS à chaque échantillon, pour diluer la concentration de SDS à 0,2 %, puis ajoutez l’échantillon dans un nouveau tube contenant 30 microlitres de billes d’agarose streptavidine haute capacité prélavées. Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec rotation.

Au bout d’une heure, granulez les billes par centrifugation à 1000 x g pendant trois minutes. Aspirez et jetez le surnageant, contenant des protéines non liées. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage aux billes et incubez pendant cinq minutes à température ambiante avec rotation.

Centrifugez, jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec un tampon de lavage. Après le lavage final, aspirez complètement le tampon de lavage des billes et ajoutez 30 microlitres de tampon d’échantillon 2X SDS. Incuber pendant cinq minutes dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius, pour libérer les protéines des billes.

Centrifugez les billes à 13000 x g à température ambiante pendant une minute. Pipetez soigneusement le tampon d’échantillon, contenant les protéines des billes, pour SDS-PAGE. La visualisation des protéines après marquage avec le marqueur fluorescent, est illustrée par ce gel scanné par fluorescence.

La principale bande de protéine de liaison spécifique, à environ 35 kilodaltons, n’est présente que dans la voie de la sonde et est concurrencée par l’excès de composé parent. La même bande de 35 kilodaltons a été visualisée par coloration à l’argent après extraction de la biotine, puis identifiée par spectrométrie de masse comme la protéine membranaire VDAC1. L’identité de la protéine a été validée à l’aide d’un anticorps spécifique de VDAC1.

Le signal est présent dans la voie de la sonde et diminué dans la voie de compétition. L’inclusion de la fraction d’entrée garantit que l’anticorps fonctionne et que la protéine d’intérêt peut être détectée dans le lysat. La légère augmentation du poids moléculaire des échantillons pulldown est due à la sonde judicieusement fixée.

Les conséquences d’une mauvaise exécution de certaines étapes du protocole sont illustrées. L’élimination incomplète de l’excès de fluorure entraîne de grandes taches noires au fond du gel balayé par fluorescence, tandis qu’une pré-clarification insuffisante des lysats et/ou un lavage des billes insuffisants entraînent un gel coloré à l’argent avec une coloration de fond très élevée. Du début à la fin, l’expérience de pulldown prend deux à trois jours.

Une fois que la protéine cible a été isolée et identifiée par spectrométrie de masse ou western blot, d’autres expériences de validation spécifiques à la cible doivent être effectuées pour évaluer la pertinence de la cible par rapport au phénotype induit par le médicament.