Split-BioID — L’analyse protéomique des Complexes de protéines spécifiques au contexte dans leur environnement natif cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de sonder la composition de complexes protéiques qui s’assemblent spécifiquement autour d’une paire de protéines d’intérêt en interaction à l’aide de split-BioID, un test de complémentation de fragments de protéines qui induit la biotinylation des protéines dépendante de la proximité dans les cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que la façon dont les complexes protéiques se remodèlent dynamiquement pour réguler différentes fonctions cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier facilement des complexes protéiques spécifiques au contexte dans leurs environnements cellulaires natifs et avec une très haute résolution.

Pour l’analyse finale par spectrométrie de masse, les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions sans kératine et tous les matériaux et réactifs doivent être aussi exempts de kératine que possible. Après avoir cloné les ORF de deux protéines d’intérêt dans le plasmide split-BioID, effectué une transfection transitoire puis ajouté un milieu supplémenté en biotine selon le protocole de texte, utilisez le PBS pour laver les cellules deux fois. Ajoutez 1,5 millilitre de PBS dans chaque plaque et utilisez un grattoir pour récolter les cellules, puis transférez les cellules pour chaque condition dans un tube séparé de 15 millilitres et faites tourner les tubes à 1 200 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retirez les surnageants et congelez les granulés dans de l’azote liquide. Stockez ensuite les tubes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la suite du traitement. Pour préparer les lysats cellulaires, utilisez un millilitre de tampon de lyse RT pour remettre les pastilles en suspension.

Ensuite, passez les cellules dans une aiguille de calibre 25 10 à 20 fois. Ensuite, sonicez les échantillons. Ajoutez ensuite 100 microlitres de Triton X-100 à 20 % pour 900 microlitres de lysat soniqué récupéré pour une concentration finale de 2 % Ajoutez 2,3 millilitres de Tris à 50 millimolaires, pH 7,4, par millilitre de lysat pour ajuster la concentration de NaCl à 150 millimolaires pour la liaison aux billes de streptavidine.

Ensuite, répartissez les lysats ajustés dans des tubes de 1,5 millilitre et centrifugez-les à 16 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant dix minutes. Transférez les surnageants dans un tube de 15 millilitres et conservez 50 à 100 microlitres comme matière première. Pour effectuer une descente de la streptavidine, pour chaque condition, transférez 200 microlitres de suspension de billes magnétiques couplées à la streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre.

Placez les tubes sur une grille magnétique et attendez environ une minute avant de retirer la mémoire tampon de stockage. Avec un millilitre de tampon d’équilibrage, lavez les billes en mélangeant doucement. Ensuite, répartissez uniformément les billes équilibrées dans le nombre nécessaire de tubes et replacez-les sur le support magnétique.

Après avoir retiré le tampon d’équilibrage, remettez en suspension chaque ensemble de billes avec des quantités égales des lysats cellulaires correspondants. Ensuite, incubez les échantillons à quatre degrés Celsius sur une roue rotative pendant la nuit. Le lendemain, placez les tubes sur une grille magnétique.

Attendez que les billes collent sur le côté des tubes et transférez les surnageants dans un tube de 15 millilitres étiqueté comme étant à écoulement. Avec 200 microlitres de tampon de lavage, remettez les billes en suspension dans chaque tube et combinez chaque ensemble de billes remises en suspension correspondant à une condition dans des tubes de 1,5 millilitre. Utilisez un millilitre de tampon de lavage pour laver les perles deux fois sur une roue rotative pendant huit minutes.

Effectuez ensuite deux lavages chacun pour les tampons de lavage deux, trois et quatre. Pour vous assurer que le tampon de lavage est complètement éliminé après la dernière étape de lavage, après avoir retiré la plupart des surnageants, faites tourner les échantillons. Remettez-les ensuite sur la grille magnétique et retirez le tampon restant.

Ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution dans les billes, puis incubez les échantillons à 98 degrés Celsius pendant quinze minutes et déplacez immédiatement les tubes vers le support magnétique. Transférez l’échantillon élué dans un tube frais et stockez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit traité ultérieurement. Pour chaque échantillon d’entrée, préparez un échantillon PAGE en mélangeant des quantités égales de protéines avec le volume approprié de tampon de chargement 3X SDS dans un volume total de 28 microlitres.

Préparez ensuite les échantillons PAGE en mélangeant cinq microlitres de chaque échantillon d’élution avec 2,5 microlitres de tampon de chargement 3X SDS. Chargez les échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS. Procédez ensuite à l’électrophorèse et au western blot selon le protocole de texte.

Pour effectuer l’analyse SDS-PAGE pour MS, ajoutez 6,25 microlitres de tampon d’échantillon 4X à 18,75 microlitres de chaque échantillon d’élution et analysez les échantillons sur un gel SDS prémoulé de quatre à 20 % jusqu’à ce qu’ils migrent de deux à trois centimètres dans le gel. Dans une boîte de Pétri de 15 centimètres, colorez le gel avec la coloration colloïdale Coomassie Brilliant Blue G250. À l’aide d’un scalpel propre, exciser toutes les bandes de chaque échantillon, à l’exclusion de la bande de streptavidine, et transférer les bandes excisées dans des tubes de 1,5 millilitre pour l’analyse MS.

En plus des protéines biotinylées endogènes identifiées dans une expérience BioID, les bandes majeures supplémentaires observées par Western Blot sont les protéines de fusion qui se biotinylent elles-mêmes, ce qui indique que les deux protéines testées, dans cet exemple Ago2 et TNRC6C ou Ago2 et Dicer ont interagi dans les cellules. De plus, les résultats du western blot indiquent que le fait d’avoir une protéine de fusion NBirA*Ago2 appariée à des fusions de CBirA* à TNRC6C ou Dicer est plus efficace que les combinaisons opposées dans lesquelles CBirA*Ago2 est appariée à des fusions NBirA* des deux autres protéines. De plus, l’activation était spécifique, car aucune des fusions CBirA* n’a pu activer la protéine de fusion de contrôle NBirA*GFP à des niveaux appréciables.

Lors de la première réalisation de l’isolement, toutes les étapes de la purification doivent être analysées par western blot. Comme illustré ici, la liaison aux billes doit être presque quantitative et pratiquement aucune fuite ne doit être observée dans les lavages. Lorsque le matériau élué est analysé sur un gel coloré à Coomassie après l’expression de la protéine et la biotinylation induite, la bande la plus forte observée est d’environ 17 kilodaltons et correspond à la streptavidine monomère.

La zone de la voie d’échantillonnage au-dessus de la bande de streptavidine dans le puits de chargement est généralement excisée pour l’analyse MS. Lors de l’application de cette procédure à deux protéines données, il est important de tester différentes combinaisons de protéines de fusion. En effet, nous avons souvent observé que l’efficacité globale de la biotinylation peut dépendre étroitement de la protéine ajoutée aux fragments BirA terminaux N ou C.

Il est tout aussi important d’ajouter au moins une expérience de partage de contrôle négatif BioID. Par exemple, sur une paire de protéines en interaction qui ne sont pas liées à la paire de protéines d’intérêt. À la suite de cette procédure et de la spectrométrie de masse, une analyse informatique doit être appliquée pour évaluer les peptides identifiés par rapport aux expériences de contrôle négatif.

Nous utilisons, par exemple, les logiciels MaxQuant et Perseus qui ont été développés par les laboratoires Cox et Mann à Munich, en Allemagne.