Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons

L’objectif global de cette technique est de cultiver des embryons de poussins ex ovo pour une imagerie en accéléré en les maintenant entièrement immergés dans un milieu de culture liquide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans une étude des événements morphogénétiques au cours de l’embryogenèse précoce, tels que la neurulation, la gastrulation, la somitogenèse, la formation du cœur et du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’il n’est pas nécessaire d’installer une chambre climatique autour du microscope.

Une couche d’huile minérale légère empêche l’évaporation du milieu de culture. Pour commencer, préparez 50 millilitres de milieu de culture en combinant 30 millilitres de solution saline Pannett-Compton fraîchement préparée avec 20 millilitres d’albumen fin. Mélangez doucement les composants en retournant le tube plusieurs fois.

Ensuite, placez deux petits anneaux en acier inoxydable aussi éloignés que possible dans une boîte de Pétri en plastique fraîche de six centimètres et utilisez une pipette en plastique de 25 millilitres pour la remplir de 22 millilitres de milieu de culture. Assurez-vous que les débris accumulés sur le dessus du fluide restent dans le tube de centrifugation. Ensuite, utilisez une pipette de transfert en plastique pour enlever tous les débris ou bulles du milieu dans la boîte de Pétri.

Ensuite, remplissez une boîte de Pétri de 10 centimètres avec 75 millilitres de solution saline Pannett-Compton à utiliser dans une étape ultérieure. Après le temps d’incubation souhaité, retirez un œuf de l’incubateur et laissez-le reposer sur le banc sur le côté pendant une minute pour laisser l’embryon remonter au sommet du jaune. Ensuite, cassez soigneusement l’œuf dans une boîte de Pétri et trempez le bord d’un morceau de papier de soie fin dans l’albumen épais.

Utilisez le papier de soie pour centrer le blastoderme en le tirant en position. Ensuite, coupez la pointe d’une pipette de transfert et utilisez-la pour retirer la majeure partie de l’albumen fin et épais de la boîte de Pétri. Une fois la majeure partie de l’albumen épais enlevée, utilisez un morceau de papier de soie pour essuyer doucement l’albumen épais restant autour de l’embryon afin de créer une fenêtre.

Veillez à ce que le papier de soie ne se fixe pas à la membrane vitelline. À l’aide d’une pince à épiler, placez soigneusement un support de papier filtre sur la membrane vitelline autour de l’embryon de sorte que l’axe le plus long de l’ouverture elliptique soit parallèle à l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Ensuite, pincez une pointe des ciseaux à ongles à travers la membrane vitelline près du support de papier filtre, et coupez rapidement autour de tout le support de papier filtre.

À l’aide d’une pince à épiler, soulevez le support de papier filtre pour l’éloigner du jaune dans une direction oblique parallèle à l’axe antéro-postérieur de l’embryon, puis retournez le support de papier filtre pour avoir la face ventrale de l’embryon sur le dessus et immergez-le dans la solution saline Pannett-Compton. Immergez le support en papier filtre le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon dans une direction oblique. Ensuite, débarrassez-vous de tout le jaune qui est encore attaché à la fois à la membrane vitelline et au blastoderme en le rinçant doucement avec une solution saline Pannett-Compton à partir d’une pipette de transfert en plastique.

Travaillez rapidement pour minimiser le temps que l’embryon passe dans un bain salin. Dirigez toujours le jet salin loin de l’embryon et ne giclez jamais directement dessus. Retirez le support en papier filtre de la solution saline Pannett-Compton le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon dans une direction oblique, et débarrassez-vous de l’excès de liquide en tamponnant le bord du support en papier filtre sur un papier de soie.

Tenez le papier filtre horizontalement et, avec la face ventrale de l’embryon vers le haut, utilisez une deuxième pince à épiler pour placer un deuxième support de papier filtre sur le premier afin que leurs ouvertures s’alignent exactement, en prenant l’embryon en sandwich entre elles. Immergez immédiatement le sandwich de support en papier filtre dans le milieu de culture dans une direction oblique le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Placez-le dans la zone couvrant l’espace entre les deux anneaux en acier.

Ensuite, fixez le sandwich en papier filtre en place en plaçant deux autres anneaux en acier sur les deux autres, en vous assurant que l’ouverture avec l’embryon reste complètement découverte. Vérifiez le niveau du fluide et assurez-vous que l’entretoise supérieure est à peine immergée dans le fluide. Si nécessaire, ajoutez ou retirez de petites quantités de fluide.

La culture est maintenant prête à être placée dans le dispositif d’imagerie. Placez soigneusement la boîte de Pétri au centre du bain d’huile à température contrôlée et stabilisez la boîte latéralement en plaçant trois grands anneaux en acier inoxydable à côté du plat dans l’huile. Assurez-vous que les anneaux en acier touchent les côtés du plat.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, ajoutez lentement environ six millilitres d’huile minérale légère sur le milieu afin que celui-ci soit recouvert d’une couche continue d’huile minérale. Cette vidéo montre un time-lapse complet d’un embryon dans la culture bien établie de support de papier filtre appelée culture EC, cultivé face ventrale vers le haut. Cet embryon commence au stade sept somites et est imagé avec une résolution temporelle de quatre minutes.

Le développement ultérieur de l’embryon est entravé par un fort confinement dans la direction z. Contrairement à la culture EC, les embryons cultivés dans la configuration sandwich en papier filtre immergé ne sont pas limités dans leur expansion tridimensionnelle. Ils développent une bonne flexion crânienne et cervicale et une circulation sanguine fonctionnelle.

Le développement de l’embryon a été imagé consécutivement sur 46 heures, mais après environ 30 heures, l’accent sur le mésoderme segmentant s’est perdu en raison de l’épaississement et de la rotation globaux du tissu embryonnaire. Cet embryon est en cours de culture, côté dorsal vers le haut. Le panneau inférieur montre le gonflement local du tube neural, conduisant à la régionalisation du cerveau antérieur, du mésencéphale et du cerveau postérieur, qui se diviseront en cinq sous-régions du cerveau embryonnaire à des stades ultérieurs.

L’embryon meurt au stade 28 somite, également appelé stade 16 de Hamburger Hamilton. Une fois maîtrisé, il faut environ 10 à 15 minutes pour amener un embryon dans le sandwich de papier filtre immergé. Avant d’appliquer de l’huile minérale à la surface du milieu de culture, l’embryon est encore accessible aux micro-manipulations, telles que la microchirurgie ou l’implantation de billes.

En combinaison avec les objectifs émergents, le sandwich de papier filtre immergé sera très utile pour l’imagerie fluorescente basée sur la lumière laser, y compris la microscopie à feuillet de lumière.