Name: Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Apprenez la culture d'embryons de poulet ex ovo par la méthode du filtre papier submergé pour l'imagerie time-lapse. Cette technique permet d'observer en temps réel la neurulation et la gastrulation sans chambre climatique.

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Les auteurs reconnaissent le soutien financier d&#39;une subvention ZonMW-VICI 918.11.635 (Pays-Bas). Les auteurs tiennent à remercier le magasin d&#39;outils de la Vrije Universiteit Amsterdam pour leurs suggestions pratiques et pour la fabrication des composants d&#39;installation et Jarno Voortman de Carl Zeiss Pays-Bas pour des conseils utiles sur la microscopie. Marjolein Blaauboer était d&#39;un grand soutien en commentant de façon critique sur plusieurs versions du manuscrit.

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les expériences néerlandaises sur Animals Act. REMARQUE: Le filtre méthode papier sandwich immergée est modifiée à partir de 1. 1. Filtre Submergé Papier Sandwich Préparation <ol><li> Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 <ol><li> Préparer des solutions mères (1 L de ultrapure H 2 O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl 2 · H 2 O et 12,7 g de MgCl 2 .6H 2 O) et B (1 L d' ultrapure H 2 O, 2,365 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,188 g de NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) à nettoyer les bouteilles de 1 L. Conservez-les à 4 ° C. </li><li> Préparer 1 L de PC-saline en mélangeant 900 ml de ultrapure H 2 O avec 40 ml de solution mère A et 60 ml de solution mère B (dans cet ordre pour éviter la précipitation). Préparer PC-saline fraîchement from solutions mères A et B chaque semaine. NOTE: Les solutions mères peuvent être conservées à 4 ° C pendant plusieurs mois. Autoclavage et / ou en ajoutant des antibiotiques ou des antimycosiques ne sont pas nécessaires. </li></ol></li><li> L'incubation des œufs de poule fécondés <ol><li> Dans un incubateur humidifié, jeter les oeufs de leur côté et les incuber à 37,5 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge désiré. NOTE: oeufs Stocker pas plus de deux semaines (de préférence à 12-15 ° C) avant l'expérience, que le taux d'éclosion diminuera considérablement </li></ol></li><li> Des supports de papier filtre (adapté de 1) <ol><li> Si possible, utilisez une machine de découpe laser pour découper des supports en papier filtre en forme de sablier à partir de papier de filtration d'épaisseur (28 mm x 22 mm). Taper la largeur au milieu de 22 mm à 10,4 mm. Découper une ouverture elliptique centrale (10,6 mm x 5,5 mm), avec l'axe plus long de l'ellipse orientée parallèlement au grand côté du support de papier filtre (Figure 1-M). <ol><li> Le cas échéant, de préparer un gabarit en carton avec les dimensions correctes et à transférer son contour et celui de l'ouverture centrale du papier de filtration d'épaisseur à l'aide d'un crayon. Découpez le support de papier filtre à l'aide de ciseaux fins. </li></ol></li><li> Coupez deux supports de papier filtre identiques pour chaque embryon à explantées. Préparer des supports de papier filtre supplémentaires comme la sauvegarde en cas d'un embryon se perd lors de l'explantation. </li></ol></li><li> température contrôlée du bain d'huile (le jour de l'expérience) <ol><li> Placer le bécher à température contrôlée dans le centre de la xy-platine motorisée du zoom microscope droit et connecter le bécher à son contrôleur de température. </li><li> Mettez quatre grands anneaux en acier inoxydable (de diamètre extérieur de 30 mm, 4 mm de hauteur, 1,5 épaisseur de paroi mm) dans un plat de 6 cm de Pétri pour agir en tant que poids et placez le plat dans le milieu du bécher à température contrôlée. NOTE: Cette boîte de Pétri sert juste comme un espace réservé pour ajuster le leve d'huilel. </li><li> Remplir le récipient à température contrôlée avec 130 ml d'huile minérale légère. Ajustez le niveau d'huile si nécessaire pour qu'il se termine environ 3 mm en dessous du bord supérieur du plat 6 cm de Pétri. </li><li> Retirez le 6 cm boîte de Pétri du bêcher à température contrôlée et régler la température à 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtre Submergé Paper Sandwich production <ol><li> Le milieu de culture (le jour de l'expérience) <ol><li> Verser 30 ml de PC-solution saline (telle que préparée dans les étapes 1.1.1 à 1.1.2) dans un tube centrifuge de 50 ml. Préparer une tube de centrifugation de 50 ml remplie de 30 ml d'une solution saline pour PC tous les deux embryons à explantées. </li><li> casser délicatement un œuf non-incubée dans un plat de 10 cm de Pétri. </li><li> Récolter albumen minces en déplaçant une pipette de transfert en plastique le long des parois de la boîte de Pétri et sucer dans l'albumen minces. Recueillir 30 ml d'albumine mince dans un tube de centrifugeuse de 50 ml pour chaque groupe de deux embryons à explantées. Assurez-vous d'obtenir seulement le thin albumen. NOTE: Habituellement 3 - 4 oeufs permettent la récolte d'environ 30 ml d'albumen minces. </li><li> Verser 20 ml d'albumen minces dans tous les PC-remplis de solution saline 50 ml tube de centrifugeuse (tel que préparé à l'étape 2.1.1). </li><li> Mélanger le PC-saline avec l'albumen minces en retournant doucement les tubes à plusieurs reprises. Laisser reposer pendant quelques minutes et vérifier si le mélange, appelé milieu de culture à partir d'ici, est clair. Si le milieu de culture est pas clair, préparer fraîche PC-saline de la solution de stock et la récolte albumen minces frais. </li></ol></li><li> Placez deux petits anneaux en acier inoxydable (diamètre extérieur de 20 mm, 4 mm en hauteur, épaisseur de paroi de 1,5 mm, 6,5 écart mm dans le ring) aussi éloignés que possible dans un 6 cm en plastique boîte de Petri frais et le remplir avec 22 ml de la culture moyen (tel que préparé dans les étapes 1.4.1 à 1.4.4) à l' aide d' une pipette en matière plastique de 25 ml (figure 1-H). Faire en sorte que les débris accumulés sur le dessus du milieu reste dans le tube de centrifugation. </li><li> Enlevez les débris or bulles dans le milieu à l'aide d'une pipette de transfert en plastique. </li><li> Remplir une boîte de Petri de 10 cm avec 75 ml de sérum physiologique PC (à utiliser à l'étape 2.15). </li><li> Retirer un œuf de l'incubateur et laisser reposer sur le banc de son côté pendant 1 min pour laisser l'embryon venir au sommet du jaune. </li><li> Casser délicatement l'oeuf dans une boîte de Pétri (Figure 1-A). Faire tremper le bord d'un morceau de papier de soie très bien dans l'albumen épais et centrer le blastoderme en tirant, si nécessaire. </li><li> Retirer la plupart des albumen minces et épaisses de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert en plastique (avec la pointe coupée pour faciliter l'absorption de l'albumen épais). </li><li> Créer une fenêtre dans l'albumen épais autour de l'embryon en essuyant doucement l'albumen épais avec un morceau de papier de soie, se déplaçant du centre (Figure 1-B). Empêcher le papier de soie de se fixer sur la membrane vitelline. </li><li> En utilisant des pinces, placer soigneusement un support de papier filtre sur le vitelline membrane autour de l'embryon, avec l'axe plus long de l'ouverture elliptique parallèlement à l'axe antéro-postérieur de l'embryon (Figure 1-C). </li><li> Pincez une pointe des ciseaux à ongles à travers la membrane vitelline à proximité du support de papier filtre et rapidement couper autour ensemble du support de papier filtre (Figure 1-D). </li><li> En utilisant des pinces, soulever le support de papier filtre à une distance à partir du jaune d' oeuf dans une direction oblique parallèle à l'axe antéro-postérieur de l'embryon (Figure 1-E). </li><li> Tournez le filtre papier support autour d'avoir la face ventrale de l'embryon sur le dessus et le plonger dans le PC-saline. Immerger le support de papier filtre le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon dans une direction oblique. </li><li> Débarrassez-vous de tout le jaune encore attaché la membrane vitelline et blastoderme en rinçant doucement avec PC-saline d'une pipette de transfert en plastique. Conserver l'intégralité du support de papier filtre immergé à unefois ll (Figure 1-F). </li><li> Retirer le support de papier filtre à partir du PC saline selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon dans une direction oblique et se débarrasser de l'excès de liquide en tamponnant le bord du papier filtre sur un support papier de soie. </li><li> Maintenir le papier filtre à l'horizontale, avec la face ventrale de l'embryon vers le haut et placer un autre support de papier filtre au-dessus de la première, en utilisant une deuxième paire de pinces à épiler. Leurs ouvertures doivent correspondre exactement, prenant ainsi en sandwich l'embryon entre les deux couches de papier filtre (figure 1-G). </li><li> immerger immédiatement le papier filtre support en sandwich dans le milieu de culture dans une direction oblique le long de l'axe postéro-antérieure de l'embryon. Placer dans la zone couvrant l'espace entre les deux bagues en acier (figure 1-H). </li><li> Fixer le sandwich de papier filtre en plaçant deux anneaux en acier au-dessus des deux autres, en veillant à ce que l'ouverture de l'embryo reste complètement découvert (Figure 1-I). </li><li> Vérifiez le niveau moyen et faire en sorte que l'entretoise supérieure est tout simplement immergé dans le milieu. Si nécessaire, ajouter ou supprimer de petites quantités de milieu. </li><li> Placez délicatement la boîte de Pétri dans le centre du bain d'huile à température contrôlée et à stabiliser le plat latéralement en plaçant trois grands anneaux en acier inoxydable (diamètre 30 mm extérieur, 4 mm de hauteur, 1,5 épaisseur de paroi mm) à côté de l'antenne dans l'huile . Assurez - vous que les anneaux en acier en contact avec les côtés de la cuvette (figure 1-J). </li><li> Pipeter lentement environ 6 ml d'huile minérale légère au - dessus du milieu avec une pipette de transfert en plastique, de sorte que le support est recouvert d'une couche continue d'huile minérale (figure 1-K). </li><li> Mettre en place l'acquisition time-lapse. NOTE: L'imagerie des embryons comme des panoramas horizontaux de cinq sous-images qui se chevauchent (tuiles) permet l'imagerie détaillée (objectif 5X), avec un overvi généralew de la morphologie 29-30. Intervalles d'imagerie entre 3 et 10 min permettent le suivi détaillé des changements morphologiques 31, et l'acquisition de petites z-piles (cinq à sept avions différents avec une distance de 30 um) compense une grande partie de l'épaississement et la rotation de l'embryon 30 . Z-plans avec le contraste le plus élevé peuvent être sélectionnés avant le traitement ultérieur 32 d'images uniques en films time-lapse (voir la section Résultats représentant pour des informations détaillées sur l' acquisition de l' image). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg"> Figure 1: Configuration du sandwich Filtre en papier Submergé. (A) Un œuf est fissuré dans une boîte de Pétri. (B) La plupart des albumen épaisses et minces est retiré de la boîte de Pétri avec une pipette de transfert en matière plastique (non représenté). Ensuite, une fenêtre dans l'albumen d'épaisseur est créé unautour de l'embryon en essuyant doucement l'albumen épais avec un papier de soie. Papier (C) un filtre transporteur est placé autour du blastoderme au - dessus du jaune d' oeuf. (D) Le filtre de papier support est découpé en vrac à partir de la membrane vitelline environnante et (E) sont retirés de la partie supérieure du jaune d' oeuf. (F) Le jaune restante a été soigneusement lavé dans un bain de PC-solution saline. (G) L'embryon est pris en sandwich avec un second support identique papier filtre. (H) Le filtre en papier sandwich est immergé dans le milieu et positionné sur des bagues en acier inoxydable à deux métalliques (face dorsale embryonnaire ou face ventrale). (I) deux anneaux stabilisent le sandwich à partir du haut. (J) La boîte de Pétri contenant l'embryon est transféré dans le bain d'huile à température contrôlée. anneaux en acier inoxydable stabilisent la boîte de Pétri latéralement. (K) Le milieu de culture est recouvert d'une couche d'huile minérale.(L) Schéma du sandwich filtrant immergé. (M) Les dimensions des supports en papier filtre utilisé pour le sandwich de papier filtrant immergé. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf</a> (2014).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Protoc.+Vol.+I%22%5BJournal%5D)">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Comme une nouvelle variante de la culture CE bien établie 1, le sandwich de papier filtre immergé facilite l&#39;acquisition de fond clair et darkfield time-lapse films à long terme du début d&#39; embryon de poulet ex ovo en faisant un température et humidité contrôlée incubateur autour le microscope dispensable. Plutôt que d&#39;être cultivées sur un fond agar-albumen semi-solide, les embryons sont maintenus complètement immergés dans un milieu de culture simple constitué de PC-solution saline et albumen minces. L&#39;évaporation et la perte de chaleur sont réduits au minimum par une couche d&#39;huile minérale flottant au-dessus du milieu de culture. Les embryons peuvent être cultivées facilement, soit dorsale ou ventrale vers le haut, sans différences visibles dans la qualité. Comme le montre ici, les embryons dans le papier filtre en sandwich submergée sont accessibles à des interventions de microchirurgie, comme l&#39;application de perles de morphogènes imbibés. Les applications futures comprennent la fluorescence en direct imagerie, microinjections et électroporation, et Gene Silencing à manipulate et étudier un large éventail d&#39;événements morphogénétiques pendant ventral (par exemple, le cœur précoce et somitogenèse) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation, la fermeture du tube neural, et au début du cerveau) développement. Un traitement médicamenteux en fonction du temps est possible si la boîte de Pétri contenant le sandwich papier-filtre est remplacée par une chambre de perfusion, permettant l&#39;échange du milieu de culture en dessous de la couche d&#39;huile minérale. Le papier filtre en sandwich submergé va développer son potentiel d&#39;imagerie complète en combinaison avec l&#39;imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie) et les objectifs d&#39;immersion. Quelques difficultés avec la préparation du papier filtre en sandwich submergé seront abordés dans les paragraphes suivants. Bien qu&#39;il ne nécessite qu&#39;une quantité modérée de formation pour transférer un embryon à partir du jaune dans le papier filtre en sandwich, plusieurs étapes peuvent encore influencer de manière significative la qualité de l&#39;embryon dans la culture. Avant que le support de papier filtre estplacé sur le jaune d&#39;œuf, la membrane vitelline autour de l&#39;embryon doit être libéré de toute albumen épais. Alors seulement, la connexion entre le papier filtre et la membrane vitelline être suffisamment solide pour résister à la laver dans PC-saline. Le papier filtre portant l&#39;embryon doit traverser l&#39;interface liquide / air aussi peu que possible pour réduire au minimum la tension sur les membranes. Une fois introduit dans le PC-solution saline pour le lavage, le filtre entier papier support doit rester complètement immergé en tout temps. Le temps dans le bain de PC-solution saline doit être limitée à environ 30 - 60 s, comme la membrane vitelline va commencer à libérer du papier filtre. Pourtant, le nettoyage de l&#39;embryon doit être exécuté très soigneusement, comme les restes de jaune seront plus tard obscurcir la vue de l&#39;embryon. Pendant le lavage, ne jamais pointer le courant de la pipette de transfert directement sur l&#39;embryon, mais toujours radialement loin de lui. Après avoir retiré l&#39;embryon à partir du PC-saline, assurez-vous de tenir le papier filtre horizontalement pour minimisertension sur les membranes embryonnaires. Ensuite, stabiliser l&#39;embryon avec le second support de papier filtre. Une fois que le second support de papier filtre est placé, éviter de créer une tension latérale, ce qui peut décaler les supports de papier filtre par rapport à l&#39;autre et déchirer les membranes embryonnaires. Lorsque le sandwich papier-filtre est introduit dans le milieu de culture, il faut aussi traverser l&#39;interface air / liquide, une seule fois pour réduire la tension sur les membranes. La deuxième paire d&#39;anneaux en acier inoxydable utilisés pour stabiliser le sandwich papier-filtre à partir de la partie supérieure doit être placé très lentement et sans aucune pression pour minimiser la compression des membranes embryonnaires. Les petites ruptures de la zone opaca de l&#39;embryon guérissent habituellement pendant la première heure de la culture, mais un embryon endommagé peuvent et doivent toujours être remplacés par un nouvel échantillon avant que la couche d&#39;huile est pipeté au-dessus du milieu de culture. Pour l&#39;image d&#39;un embryon entier ou plusieurs échantillons pour haute résolution des films time-lapse, le microroscope doit être équipé d&#39;un étage XY motorisé, commandé par le logiciel du microscope. Il est d&#39;une importance cruciale pour que le mouvement xy-scène avec une vitesse minimale pour éviter d&#39;endommager les embryons et les turbulences dans le milieu de la culture et de l&#39;huile, ce qui va diminuer la qualité d&#39;image. Pour l&#39;acquisition des films time-lapse présentés ici, le xy-platine motorisée déplacé avec une vitesse d&#39;environ 1,75 mm / sec. Dans l&#39;avenir, l&#39;imagerie pourrait être encore améliorée en premier déplacement de la platine à la position désirée et l&#39;acquisition de l&#39;image après une courte période de repos pour laisser les vibrations et les turbulences disparaissent. Comme une limitation, les utilisateurs potentiels doivent être conscients de la distance relativement longue de travail (environ 1 cm) nécessaire pour cette méthode de culture si un microscope droit sans objectifs d&#39;immersion est utilisé. Cette distance de travail résulte de la couche de support et d&#39;huile minérale au-dessus de l&#39;embryon. Dans la boîte de Petri de 6 cm, la couche d&#39;huile a une epaisseurs d&#39;environ 1 à 1,5 mm, et l&#39;embryon est submergée d&#39;environ 4 mm de profondeur dans le milieu de culture. En fonction du diamètre de l&#39;objectif, le bord supérieur de la boîte de Petri de 6 cm pourrait également limiter l&#39;accès à l&#39;embryon. Cela pourrait être contourné en utilisant un plat plus grand. La distance de travail du haut pourrait être légèrement réduite en minimisant les épaisseurs des couches liquides. En outre, la distance de travail du bas peut être réduite au minimum en mettant l&#39;embryon plus bas au fond de la boîte de Petri et en réduisant l&#39;épaisseur de la fenêtre en verre du récipient chauffé. Alors que le protocole a été optimisé pour fonctionner avec une longue travail zoom à distance microscope droit, il pourrait être monté sur un microscope inversé ainsi. Les futurs utilisateurs doivent garder à l&#39; esprit que submergeant l&#39;embryon trop profondément dans le milieu de culture pourrait conduire à O 2 -Diffusion problèmes, bien que des expériences préliminaires suggèrent que la diffusion limitée ne semble pas être un problem, aussi longtemps que l&#39;embryon est entouré d&#39;un nombre suffisamment grand-réservoir de milieu de culture et le papier filtre pris en sandwich n&#39;a pas été pressée sur le fond de la boîte de Petri. Une autre limitation est le contrôle de la température. En réglant la température du dispositif de commande pour le récipient chauffé à 40 ° C, la température dans le milieu équilibrant à 37,5 ° C autour des embryons lorsque le support est recouvert d&#39;une huile minérale. Cela montre qu&#39;une certaine perte d&#39;énergie entre le fond du récipient, dans lequel se trouvent les éléments de chauffage et le capteur de température, et l&#39;emplacement des embryons. Le contrôle de la température pourrait être optimisée en déplaçant le capteur et redistribuant les éléments chauffants.

Embryogenèse a fasciné l&#39;homme depuis le début de l&#39;histoire. Comment la structure et la morphologie de l&#39;embryon se développent de manière spatiale et temporelle bien définie? L&#39;embryon de poulet est devenu l&#39;un des modèles animaux vertébrés classiques pour embryogenèse pour plusieurs raisons: Il est facilement disponible, peu coûteux, transparent à ses débuts, et accessible pour des manipulations expérimentales, comme elle se développe en dehors de la mère. De plus, il a une géométrie presque plat lors d&#39; événements morphogénétiques début, comme le cœur et la formation du cerveau, gastrulation, neurulation et somitogenèse 15. processus morphogénétiques peuvent être comprises mieux si elles sont étudiées de manière dynamique, par exemple par l&#39;acquisition d&#39;images en accéléré. L&#39;embryon de poulet peut être visualisé in ovo 16 mais avec une faible accessibilité pour les manipulations expérimentales et la visibilité limitée pour l&#39; imagerie par microscopie optique de transmission. Par conséquent, several techniques ont été proposées pour la culture d&#39; embryons de poulet ex ovo, que ce soit dans des systèmes de culture de 13,17 jaune d&#39; oeuf entier - 19 ou sous forme de cultures d&#39;explants 1,20 - 23. Dans les systèmes de culture de jaune d&#39;oeuf entier, l&#39;embryon reste au-dessus du jaune d&#39;oeuf intact, et la totalité du contenu de l&#39;œuf est transféré dans un autre récipient pour l&#39;incubation. Ce conteneur peut être une coquille d&#39;oeuf de substitution 17, une boîte de Pétri 19, ou un hamac en plastique étirable wrap 13,18. Embryons dans les cultures de jaune entières peuvent idéalement être cultivées jusqu&#39;à l&#39;éclosion et sont accessibles à micromanipulations. Ces techniques sont particulièrement utiles pour étudier le développement d&#39;embryons après le début de la circulation sanguine (ce qui augmente le contraste), tandis que les jeunes embryons restent difficiles à visualiser. Ces embryons précoces peuvent être imagées mieux si elles sont excisées du jaune et cultivés comme explants in vitro. Les explants sont facilement accessibles pour l&#39;expériencemanipulations al et nécessitent moins d&#39;espace pour la culture. Pendant de nombreuses années, une technique mise au point par Denis Nouvelle en 1955 et ses variations ont été les normes d&#39; or des explants méthodes de culture pour les embryons de poulet, ce qui rend l&#39;embryon accessible pour la microscopie time-lapse et les interventions de microchirurgie 20,21. Malgré son grand succès, la technique de la Nouvelle est relativement exigeante et prend du temps. Le blastoderm détache souvent lorsque la membrane vitelline, portant le blastoderme, est tendue autour d&#39; un anneau de verre pour obtenir la bonne tension 1. En outre, l&#39;embryon ne peut être mis en culture avec sa face ventrale vers le haut. La culture CE (Chick précoce), une technique plus récente développée par Chapman et Collignon 1, évite l&#39;étirage de la membrane vitelline à l&#39;aide d&#39; un filtre papier support avec une ouverture centrale. Le papier filtre attache à la membrane vitelline, maintenant ainsi sa tension naturelle, et entoure l&#39;embryon comme un cadre photo 1.Embryons sont ensuite cultivées sur un fond agar-albumen, généralement avec leur face ventrale. La culture dorsale vers le haut ne semble possible que pour les embryons à HH8 15 ans et plus. De nombreux groupes ont adapté le filtre papier support à leurs besoins, par exemple en remplaçant le fond d&#39; agar-albumen avec un support en fibres de suture chirurgicale 24 ou un collagène enduit membrane 25. Souvent, les embryons cultivés avec la technique de nouvelles ou avec la culture CE sont exposés, avec leur dorsale ou surface ventrale à l&#39; air pour faciliter la diffusion de l&#39; oxygène 1,20. Ces cultures explants doivent être conservés dans une atmosphère humidifiée pour éviter l&#39;évaporation du milieu et pour empêcher l&#39;embryon de se dessécher. Ceci est réalisé en incubant le plat avec la culture d&#39;expiant dans un plat plus grand de Pétri contenant du papier de soie humide 1. L&#39;acquisition d&#39;images en accéléré de ces embryons nécessite soit l&#39;utilisation d&#39;un incubateur à température contrôlée autour de l&#39;ensemble microscope ou un tempéramentature contrôlé récipient avec un couvercle chauffé pour empêcher la condensation dans le trajet de la lumière 14. Cependant, les embryons de poulet peuvent également développer ex ovo complètement immergé dans un milieu de culture en tant que cultures de papier filtre 25, pris en sandwich entre une couche d&#39;huile et de l&#39; albumine de minéraux lourds dans adaptions de la technique de New 2,21, ou comme explants de blastoderme pliées dans le &quot;Cornish Pasty Culture &quot;23,26, sans contact direct avec l&#39;air. Le sandwich de papier filtre immergé est une nouvelle variante de la technique du papier filtre de support. En combinant la connaissance antérieure sur la culture des embryons de poulet ex ovo, il fait l&#39;incubateur à température contrôlée et le couvercle chauffant dispensable. L&#39;embryon est pris en sandwich entre deux supports de papier identique (découpé au laser) filtre 24 et cultivé entièrement immergé dans un milieu de culture simple (Pannett-Compton saline 27,28 et albumen minces dans un rapport de 3: 2) dans une température contrôlée contiennenter. Une couche de lumière de l&#39; huile minérale flottant au - dessus du milieu empêche l&#39; évaporation 2,21 et minimise la perte de chaleur dans l&#39;environnement. Le fond du récipient a une fenêtre de verre, et l&#39;ensemble du programme d&#39;installation est effectuée sur une longue distance de travail zoom microscope droit. Cette configuration permet l&#39;acquisition de haute résolution clair et darkfield time-lapse films d&#39;environ 30 h du développement embryonnaire, allant du stade de la ligne primitive précoce au stade 28 somites (équivalent à Hamburger Hamilton stades 5 à 16, HH5-16 ) 15. Les embryons peuvent être cultivées aussi bien avec leur ventrale ou dorsale vers le haut. Par conséquent, les embryons sont accessibles à l&#39; observation et la manipulation de ventral (par exemple, cardiaque précoce 7,8 et somitogenèse 6) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation 2, le tube neural fermeture 3-5, et au début de cerveau 9-13) développement. Le filtre immergé papier sandwich à provides un environnement simple et stable pour la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et les études d&#39;électroporation. Son potentiel d&#39;imagerie peut être poussé beaucoup plus loin en utilisant l&#39;imagerie à base de laser (y compris la microscopie optique-feuille) et les objectifs d&#39;immersion.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&nbsp ; Système de purification d’eau de référence</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&nbsp ; flacons de laboratoire, avec bouchons, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183 ; H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#183 ; 6H2O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183 ; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#183 ; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Whatman, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Machine de découpe laser MLS-90120-C130, CO2-laser, 130&nbsp ; W, longueur d’onde 10,6&nbsp ; et micro ; m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Gants en latex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Contrôleur</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques en plastique, 25&nbsp ; ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Pochettes</td><td></td><td></td><td></td>pour documents en plastique</tr><tr><td>Incubateur d’œufs - Incubateur mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oeufs de poule fécondés (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de culture tissulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Boîtes de Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes à centrifuger, tubes à centrifuger Greiner ou tubes Cellstar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Anneaux en acier inoxydable, sur mesure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Larges, 30 mm de diamètre extérieur, 4 mm de hauteur, 1,5 mm d’épaisseur</td><td></td><td></td><td></td>de paroi</tr><tr><td>Petits anneaux, 20 mm de diamètre extérieur, 4 mm de hauteur, 1,5 mm d’épaisseur de paroi, 6,5 mm d’espace dans l’anneau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ongles Pince à ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins et très tranchants pour la coupe du papier filtre</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&nbsp ; Huile minérale Sigma-Aldrich</td><td>Numéro CAS Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; 8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td><Nom>strong</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Agars bottoms for EC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp ; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp ; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Implantation de microbilles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’échantillonnage de billes de polybilles III (45 &micro ; millions de billes ont été utilisées)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles d’accupuncture : type J, n° 02, 0,12 x 30 mm</td><td>SEIRIN&</td><td>nbsp ; type J, n° 02, 0,12 x 30 mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Beaker à température contrôlée</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Capteur de température RTD avec boîtier fileté M4 RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>RTD hermétiquement scellé Capteurs HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistance et fil d’extension RTD EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>Mini connecteurs 3 broches pour thermocouples, RTD 3 fils et thermistances MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (film polyimide) Résistances flexibles isolées KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température/process CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Bécher en aluminium sur mesure, isolé avec du polyacétal (dessins voir feuille 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Configuration du microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 avec ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objectif PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&nbsp ; mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Commande rotative manuelle MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de transillumination 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Platine de mesure motorisée S 150x100 mot ; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’insertion S, verre 237x157x3&nbsp ; mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Panneau de commande du système SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Caméra Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Hamamatsu</td><td></td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie Station de travail haut de gamme Xeon Quad-Core multilingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Paquet linguistique Windows 7 x64 Ultimate Anglais US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur LCD TFT HP ZR2440w 24"</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>n’est plus disponible ZEN</td></tr><tr><td>pro 2012 Clé de licence matérielle</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>n’est plus disponible</td></tr><tr><td>Pilote logiciel ZEN Hamamatsu Cameras Clé de licence matérielle</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>Module ZEN Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>Module ZEN Tuiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>Module ZEN Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Clé de licence matérielle</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>n’est plus disponible</td></tr></tbody></table>

un filtre sandwich de papier submergé long terme ovo ex time-lapse imaging of early chick embryons

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En raison de sa disponibilité, à faible coût, la géométrie plane, et la transparence, l&#39;ex ovo embryon de poulet est devenu un modèle majeur des animaux vertébrés pour l&#39;étude des événements morphogénétiques, tels que gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenèse 6, coeur de pliage 7, 8, et le cerveau formation 9-13, au cours de l&#39; embryogenèse précoce. La clé de la compréhension des processus morphogénétiques est de les suivre dynamiquement par imagerie time-lapse. L&#39;acquisition de films time-lapse de poussin embryogenèse ex ovo a été limitée soit à court fenêtres de temps ou à la nécessité d&#39;un incubateur pour contrôler la température et l&#39; humidité autour de l&#39;embryon 14. Ici, nous présentons une nouvelle technique pour la culture embryons de poulet ex ovo pour imagerie à haute résolution time-lapse en utilisant la microscopie lumière transmise. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante du filtre support papier techn bien établieique (EC-culture) 1 et permet la mise en culture des embryons de poulet sans la nécessité d&#39;une chambre climatique. L&#39;embryon est prise en sandwich entre deux supports en papier filtre identique et est maintenu totalement immergé dans un milieu simple, à température contrôlée recouverte par une couche d&#39;huile minérale légère. A partir de la scène primitive de série (stade Hamburger-Hamilton 5, HH5) 15 jusqu&#39;à au moins le stade 28 somites (HH16) 15, les embryons peuvent être cultivées avec soit leur ventrale ou dorsale vers le haut. Cela permet à l&#39;acquisition de films time-lapse couvrant environ 30 h du développement embryonnaire. Représentant des cadres et des films time-lapse sont présentés. Embryons sont comparés morphologiquement à un embryon cultivé dans les CE-culture standard. Le sandwich de papier filtre immergé fournit un environnement stable à l&#39;étude dorsale précoce et les processus morphogénétiques ventrales. Il permet également d&#39;imagerie et micromanipulations de fluorescence en direct, tels que la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et l&#39;électroporation, et a un fort potentiel pour être combinés avec des objectifs d&#39;immersion pour l&#39;imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie).

Ici, nous présentons une nouvelle technique de culture d’embryons de poussin ex ovo pour l’imagerie en accéléré à l’aide de la lumière transmise et de la microscopie à fluorescence. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante de la technique bien établie du support de papier filtre1 qui permet de cultiver des embryons de poussins entièrement immergés dans un milieu de culture liquide.

Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

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Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Ce protocole décrit trois méthodes sur la façon d’obtenir et d’utiliser des embryons de poulet âgés de 5 à 8 jours et leur membrane chorio-allantoïdienne (CAM) comme modèle in vivo pour étudier l’imagerie par ultrasons à contraste amélioré et l’administration de médicaments médiée par microbulles.

La préparation d’embryons ex ovo de poulet et de vaisseaux membranaires chorio-allantoïdiens comme modèle in vivo pour l’imagerie par ultrasons à contraste amélioré et les études d’administration de médicaments médiées par microbulles

Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.

Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Apprenez la culture d'embryons de poulet ex ovo par la méthode du filtre papier submergé pour l'imagerie time-lapse. Cette technique permet d'observer en temps réel la neurulation et la gastrulation sans chambre climatique.

Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons

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