Création de Génome édités cellules souches pluripotentes humaines Lines: De Ciblage Isolement

L’objectif global de cette procédure est de modifier génétiquement des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide de la technologie moderne d’édition du génome. Bien que cette procédure puisse donner un aperçu de la biologie des cellules souches, elle peut également être appliquée pour faciliter la modélisation des maladies humaines dans un cadre génétiquement défini. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode devront s’entraîner à isoler les colonies avant de devenir compétentes.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’identification et la cueillette des colonies peuvent être difficiles. Commencez par cultiver des cellules souches pluripotentes humaines dans un milieu hESC sur une plaque à six puits contenant des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés à la mitomycine C, ou des cellules nourricières MEF cultivées sur de la gélatine. Chaque jour suivant le placage, jusqu’à ce que les hPSC atteignent 50 % de confluence, utilisez une pipette en verre et mettez sous vide pour prélever tout le volume de support.

Remplacer par trois millilitres de média hESC chaud par puits. Un jour avant le ciblage, retirez le milieu hESC et ajoutez un nouveau milieu hESC préchauffé complété par 10 micromolaires Y-27632. Préparez également une à deux plaques à six puits de cellules nourricières MEF résistantes aux médicaments à partir de souris DR4.

Le jour du ciblage, préparez les solutions de transvection en pipetant cinq microgrammes des plasmides d’expression 1 et 2 des nucléases à doigts de zinc, des plasmides d’expression TALON 1 et 2, ou 15 microgrammes du plasmide codant CRISPR cas9 px330 dans un tube d’un point cinq millilitres. Ajoutez 30 microgrammes du plasmide donneur réparé, suivi d’une quantité suffisante de solution saline tamponnée au phosphate pour porter le volume à 300 microlitres. Inspectez les cellules au microscope pour vous assurer que la confluence est de 50 %.

Ensuite, utilisez une pipette en verre et passez l’aspirateur pour retirer le milieu de la plaque de hPFC, puis lavez les cellules avec 2 millilitres de 1x PBS chaud. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez zéro virgule cinq millimètres de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % directement sur les cellules. Placer dans l’incubateur de culture tissulaire pendant environ 10 minutes, ou jusqu’à ce que la couche nourricière commence à se détacher de la plaque.

Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de milieu de lavage ES chaud dans chaque puits pour arrêter la réaction de la trypsine. Collectez les cellules de chaque puits, en vous assurant que les cellules nourricières se détachent comme une feuille. Pipetez le contenu de chaque puits dans un seul tube conique de 50 millilitres, en combinant tous les puits et triturez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.

Ajoutez du produit de lavage ES pour porter la suspension cellulaire à 40 millilitres. Attendez une à deux minutes pour permettre aux gros morceaux de se déposer au fond du tube, puis retirez le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique et déposez-le dans un tube conique frais de 50 millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 190 fois g, aspirez le surnageant sans perturber la palette cellulaire.

Remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de 1x pbs. Combinez les cellules remises en suspension avec la solution de transsection plasma préparée précédemment. Pipetez les cellules et le mélange de transfection dans une cuvette d’électroporation de quatre millimètres et placez-les sur de la glace pendant trois à cinq minutes.

Réglez les paramètres du programme exponentiel sur le système d’électroporation à 250 volts, 500 microfarads, une résistance infinie et une taille de cuvette de quatre millimètres. Électroporez les cellules, puis replacez la cuvette sur de la glace pendant trois minutes. Remettez en suspension les cellules électroporées dans 18 millilitres de milieu hESC chaud, complété par 10 micromolaires d’Y-27632.

Inspectez les MEF DR4 au microscope. Plaquez trois millilitres de suspension à cellule unique dans chaque puits d’une plaque à six puits contenant des cellules nourricières DR4, et retournez dans l’incubateur. Le troisième jour après le placage, remplacez le milieu sur les cellules hESC sans Y-27632.

Le quatrième jour, remplacez le milieu non supplémenté par un milieu contenant l’antibiotique de sélection approprié. Puromycine est utilisé ici. La veille de la cueillette de la colonie, préparez une plaque de 12 puits de cellules d’alimentation MEF pour chaque colonie à cueillir.

Le 12e jour après le placage, examinez la plaque au microscope de dissection. Identifiez les colonies de 800 à 1 200 microns de diamètre qui sont prêtes à être cueillies. Assurez-vous que ces colonies ne contiennent pas de cellules qui commencent à se différencier, comme celle illustrée ici.

Assurez-vous également que les cellules expriment la GFP. Le jour de la cueillette, inspectez les MEF au microscope pour vous assurer qu’ils sont sains. Retirez tous les supports des plaques de cellule d’alimentation MEF et remplacez-les par un millilitre de support hESC.

Changez également le support hESC sur les plaques hPSC à six puits qui vont être prélevées. Ensuite, tirez des pipettes en verre pour cueillir les colonies. Pour prélever des colonies, placez d’abord les hPFC à plaque sur la platine du microscope de dissection dans le capot de culture tissulaire, assemblez le dispositif de prélèvement en plaçant l’extrémité de la pipette en verre dans la poire d’aspiration.

Identifiez la colonie à cueillir et placez la pointe de la pipette en verre tiré sur la colonie. Ensuite, compressez le bulbe de l’appareil de cueillette pour exciser doucement et couper une colonie individuelle en 10 à 20 morceaux de taille égale. Ensuite, aspirez les morceaux de colonie excisés dans la pipette en relâchant le bulbe.

Essayez d’emporter le moins de support possible lors du transfert. Comprimez le bulbe pour transférer la colonie maintenant brisée directement dans un puits d’une plaque de cellule d’alimentation MEF à 12 puits. Étiquetez chaque puits pour permettre l’identification unique des clones dérivés de cellules uniques.

Changez la pipette en verre et répétez la procédure pour la colonie suivante. Remettez les plaques dans l’incubateur et secouez doucement les plaques pour disperser les cellules dans le puits. Le lendemain, retirez tout le volume de support et remplacez-le par un virgule cinq millilitres de support hESC chaud.

Répétez l’opération pendant 10 à 12 jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 50 %. Après 10 à 12 jours, inspectez les CSEh sous le scope. Prélevez une à deux colonies dans chaque puits et transférez-les vers de nouvelles plaques de cellules d’alimentation MEF à 12 puits pour générer une réplique de la plaque.

Extraire l’ADN des colonies restantes dans chaque puits des plaques d’origine pour le génotypage par PCR ou transfert de Southern. Weber Trois cellules souches embryonnaires humaines ont été ciblées au locus AAVS1 à l’aide de nucléases spécifiques au site et d’un modèle de réparation pour introduire un rapporteur EFFP et une cassette de résistance à la puromycine. Ces images représentatives montrent des colonies modifiées avec des nucléases à doigts de zinc, des TALEN et des CRISPR/Cas9.

Ces résultats de génotypage PCR représentatifs montrent des clones ciblés non ciblés, hétérozygotes et homozygotes utilisant des nucléases à doigts de zinc, des TALEN et CRISPR/Cas9 en plus d’un contrôle de type sauvage. Ce tableau montre les intégrations vérifiées par PCR au locus AAVS1 pour chaque nucléase spécifique au site dans cette expérience, par rapport aux intégrations uniques vérifiées par Southern Blot dans les expériences précédentes. CRISPR-Cas9 a produit les clones les mieux ciblés, tandis que la plateforme TALEN a eu les clones les plus ciblés de manière homozygique.

Une fois maîtrisée, cette technique prend environ trois à cinq heures de temps pratique, et vous pouvez obtenir des cellules modifiées dans les trois semaines suivant le début des expériences. Il est vraiment important avec cette technique de travailler en toute sécurité et d’utiliser une technique stérile à tout moment. Après la manipulation génétique, vous pouvez voir comment elle affecte d’autres types de cellules en utilisant la différenciation des cellules souches en d’autres types de cellules, tels que les neurones.

Le développement de ce protocole a ouvert la voie aux chercheurs pour utiliser l’édition du génome dans des cellules souches pluripotentes humaines afin d’établir des modèles de maladies in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modifier le génome des cellules souches pluripotentes humaines.