Extension nanostructurées Substrats utilisant la technique de point pour Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

L’objectif global de cette procédure est de produire une grande surface de substrat nanopatterned à partir de petits moules nanopatterned en utilisant une technique de couture simple et abordable mais polyvalente. Cette méthode peut aider à étudier la modulation de la nanotopographie du substrat du phénotype et de la fonction cellulaire aux niveaux cellulaire et moléculaire, comme l’expression des protéines d’adhésion focale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et rentable.

Pour commencer, préparez le moule en silanisé dans le prépolymère PDMS, comme décrit dans le protocole texte. Mettez le moule en silicone silanisé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Versez le prépolymère PDMS sur le moule en silicone dans la boîte de Pétri.

Placez la boîte de Pétri dans un dessiccateur en plastique et dégazez pendant environ 10 minutes, jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent. Transférez la boîte de Pétri sur une plaque chauffante et durcissez le prépolymère PDMS à 70 degrés Celsius pendant quatre heures. Décollez soigneusement le moule PDMS du moule en silicone à l’aide d’une pince à épiler.

Déterminez l’orientation des nanomotifs PDMS anisotropes, tels que les nanoréseaux, au microscope optique, et marquez-la à l’arrière des moules PDMS à l’aide d’un marqueur. Nettoyez le substrat de silicium avec de l’éthanol dans une hotte, puis séchez-le à l’air comprimé. Coupez les zones non structurées de chaque moule PDMS à l’aide d’une lame.

Les moules PDMS doivent être alignés aussi près que possible, mais sans toucher le moule environnant, afin de minimiser la zone non structurée et d’éviter de toucher la déformation du nanomotif lorsque la force du compresseur est appliquée. Placez le moule PDMS garni avec le nanomotif face vers le bas sur le côté miroir du substrat de silicium, puis alignez les autres moules à proximité des moules environnants sans les toucher. Il est essentiel d’essayer de durcir le PDMS au niveau de la couche basale, car les PDMS non durcis peuvent s’écouler à travers l’espace entre les multiples moules et endommager les nanomotifs.

Cependant, le PDMS complètement durci ne peut pas lier les multiples moules ensemble. Pour préparer une couche adhésive PDMS, coulez un gramme de prépolymère PDMS dégazé sur une lame de verre propre pour former une couche de 0,5 millimètre d’épaisseur. Faites cuire la couche PDMS à 100 degrés Celsius sur une plaque chauffante pendant trois à cinq minutes.

Utilisez une aiguille pour toucher la couche et assurez-vous que la couche est partiellement mais pas complètement durcie. Placez la couche PDMS à l’arrière des moules PDMS alignés, inversez rapidement cet assemblage et transférez-le sur la plaque chauffante. Appliquez une force de compression à l’aide d’un bloc métallique sur le dessus de l’ensemble pour assurer un bon contact entre la couche adhésive PDMS et l’arrière des moules PDMS.

Faites durcir la couche adhésive PDMS à 100 degrés Celsius pendant une heure. Éteignez la plaque chauffante, retirez le bloc métallique et décollez le moule PDMS à couture unique du substrat en silicone. Pour nano-imprimer le moule PDMS cousu dans la plaque PS, placez la plaque PS dans une entretoise en aluminium posée sur une plaquette de silicium de trois pouces.

Chauffez la plaque PS sur une plaque chauffante à 250 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez le moule PDMS cousu, avec les nanomotifs face vers le bas, sur la plaque PS fondue. Ensuite, placez une plaque d’aluminium sur la glissière de verre du moule PDMS cousu.

Appliquez une pression de compression à l’aide de blocs métalliques sur la plaque d’aluminium et attendez trois minutes. Soulevez et replacez le bloc métallique de la plaque d’aluminium et augmentez la pression de compression à 25 kilopascals. Ensuite, répétez cette étape avec la pression augmentée à 50 kilopascals.

Maintenez la température de la plaque chauffante entre 240 et 250 degrés Celsius sous une pression constante de 50 kilopascals pendant 15 minutes. Éteignez la plaque chauffante et refroidissez l’ensemble de l’installation. Retirez les blocs métalliques une fois que la température est inférieure à 50 degrés Celsius et décollez soigneusement le moule PDMS cousu de la plaque PS.

Pour nano-imprimer le moule PDMS sur un film mince PS, placez le moule PDMS cousu avec nanotopographie face cachée sur le film mince PS, qui est placé sur une plaque chauffante. Appliquez une pression de compression de 12 kilopascals sur le moule PDMS en utilisant des blocs métalliques sur la lame de verre du moule PDMS. Augmentez la température de la plaque chauffante à 180 degrés Celsius et maintenez-la pendant 15 minutes.

Éteignez la plaque chauffante et refroidissez l’ensemble de l’installation. Retirez les blocs métalliques une fois que la température est descendue en dessous de 50 degrés Celsius et décollez soigneusement le moule PDMS cousu du film PS. À l’aide d’un poinçon en arc en acier creux, coupez les substrats PDMS nanostructurés en disques pour s’adapter à la configuration d’une plaque multipuits spécifique.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, placez les disques PDMS dans les puits de la plaque multipuits. Stérilisez les substrats PDMS en utilisant de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez l’éthanol et appliquez ensuite une exposition aux UV pendant 30 minutes.

Lavez trois fois les substrats PDMS avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate 1X. Ensuite, enduisez les substrats PDMS avec des protéines de matrice extracellulaire pendant 30 minutes à température ambiante. Rincez les substrats PDMS trois fois avec du PBS stérile, chacune pendant cinq minutes.

Suspendez des cellules humaines de cancer du poumon A549 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal, et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Plaquez les cellules à une densité d’ensemencement de 2 000 cellules par centimètre carré sur les substrats PDMS. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant une journée, puis observez-les par la suite.

Le nanomotif généré sur la plaque de PS et le film mince sont présentés ici. Les flèches indiquent l’élévation du polymère dans les interstices des moules PDMS cousus. Ces images MEB démontrent que les substrats fonctionnant sous PDMS sont fidèlement transférés à partir du nanomotif écrit par lithographie par faisceau d’électrons en appliquant la technique du point.

Des images MEB représentatives de cellules A549 cultivées sur des nanoréseaux et des nanopiliers sont présentées ici. Les cellules présentent une morphologie cellulaire alignée sur les nanoréseaux, tandis que les cellules se propagent de manière aléatoire sur les nanopiliers. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une grande surface de substrat à nanomotifs en cousant plusieurs petits moules à nanomotifs définis.

N’oubliez pas que travailler avec du toluène et du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux, et portez toujours un équipement de protection individuelle approprié lors de l’exécution des procédures.