Name: Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Apprenez l'imagerie cardiaque longitudinale chez Drosophila par microscopie à cohérence optique. Cette méthode non invasive quantifie le diamètre cardiaque, la fréquence et l'activité pendant la métamorphose.

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Ce travail a été soutenu par le Lehigh University Start-Up Fund, le NIH (R00EB010071 à C.Z., R15EB019704 à C.Z. et A.L., R03AR063271 à A.L., et R01AG014713 et R01MH060009 à R.E.T.), la NSF (1455613 à C.Z. et A.L.), le Cure Alzheimer’s Fund (à R.E.T.) et le Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award à A.L.). M.C. et Y.M. a été soutenu par le National Key Basic Research Program de la Chine (programme 973) au titre de la subvention n° 2014CB340404.

1. Préparation du système d&#39;imagerie optique OCM de la drosophile 16 <ol><li> Sélectionnez un spectromètre et d&#39; une caméra de balayage ligne à grande vitesse qui fournit un débit d&#39;au moins 80 images / sec cadre de sorte que le système d&#39;OCM sera en mesure de résoudre le battement de coeur de la drosophile. </li><li> Utiliser une source de lumière à large bande afin d&#39; assurer la résolution axiale de 2 um pour identifier la structure du coeur de la drosophile. </li><li> Utilisez un objectif 10X pour obtenir une résolution transversale élevée. </li><li> Utilisez un miroir à 45 ° de la tige pour réfléchir le faisceau de lumière du bras de référence et pour générer un faisceau de lumière de bras d&#39;échantillon annulaire pour étendre la profondeur de champ dans les échantillons. </li><li> Élaborer un programme informatique personnalisé pour contrôler le système et effectuer des mesures OCM. </li></ol> 2. Drosophila Culture <ol><li> Norme Fly Préparation des aliments <ol><li> Mettre ~ 5 ml de la formule instantanée drosophile dans un flacon en polystyrènele tube à l&#39;aide d&#39;une goulotte à papier. </li><li> Versez ~ 8 ml d&#39;eau dans la formule pour saturer correctement la nourriture. </li><li> Ajouter différents suppléments à la nourriture de mouche standard pour différentes expériences. Lors de la préparation pour les tout - -retinal (ATR) aliments trans pour la stimulation optogenetic expérience 35, utiliser une pipette pour extraire mM ATR 100 et dissoudre dans ~ 8 ml d&#39; eau pour obtenir la concentration ATR de 1 mM dans les aliments. Après avoir mélangé la solution uniformément, verser la solution dans la formule et remuer suffisamment. </li><li> Pour préparer une graisse alimentation riche pour l&#39; étude des dysfonctionnements cardiaques liées à l&#39;obésité chez la drosophile, 10,15 mélange ~ 10 ml formule avec 15 ml d&#39; eau dans une tasse et de la chaleur pendant 30 secondes dans un four à micro - ondes. Mettez un peu d&#39;huile de noix de coco extra vierge organique dans une autre tasse et chauffer pendant 90 secondes dans le four à micro-ondes. </li><li> Extrait 7,5 ml d&#39;huile de noix de coco et mélanger avec la formule préparée suffisamment pour rendre le rapport poids / volume d&#39;huile de noix de coco à la nourriture ~ 30/100, et een extrait ~ 2 ml mélangés nourriture et le mettre au fond d&#39;un tube. </li><li> Attendre 1 min jusqu&#39;à ce que le milieu est complètement saturé. Compacter la nourriture soigneusement avec une surface plane afin d&#39; optimiser les conditions de vie de la drosophile. Ajouter 6 - 8 grains de levure à la formule préparée, et branchez le tube avec une grappe de coton. </li></ol></li><li> Fruit Fly Croix et Culture <ol><li> Prenez un tube avec des aliments préparés à la mouche standard, et enlever le coton branché. Soigneusement transférer les mouches adultes (hommes et femmes) dans le tube, et branchez le tube avec du coton immédiatement. Vérifiez le coton pour vous assurer qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;écart entre le coton et la paroi du tube pour empêcher les mouches de sortir du tube. </li><li> Gardez les mouches des fruits dans l&#39;incubateur à 25 ° C pour les croisements. La plupart des gènes sont actifs et les protéines cellulaires sont synthétisés à 25 ° C 36-39. </li><li> Prenez le tube hors de l&#39;incubateur après 8 transfert de la main la unedult vole hors du tube pour obtenir les oeufs au même âge pour le contrôle expérimental. </li><li> Continuez à cultiver les oeufs dans l&#39;incubateur à 25 ° C, ce qui est la température standard pour le développement de Drosophila avec la période de développement de 8,5 jours 40,41. NOTE: La température influence la période de développement (de l&#39;œuf à l&#39;adulte) et le niveau de divers gènes d&#39;expression. </li></ol></li></ol> 3. Réalisation d&#39;imagerie optique avec OCM <ol><li> Mont Fly Larva pour l&#39; imagerie optique NOTE: L&#39;œuf de trappes de Drosophila en 22-24 heures à 25 ° C à la première stade larvaire (L1). Le deuxième stade larvaire émerge après l&#39;autre 24 heures. La plus grande forme larvaire est le troisième stade larvaire, qui mues après environ 24 heures. Les caractéristiques structurelles de larves peuvent être utilisés pour distinguer leurs différents stades de développement. La taille des pièces buccales entre le premier stade et le deuxième stade est différent. La bouchecrochets de la première larve de stade larvaire sont très petites et ressemblent à deux paires de minuscules taches noires, tandis que la bouche des crochets du second stade larvaire sont plus grandes et la structure est plus claire. Les stigmates sont généralement utilisés pour identifier le deuxième stade et du troisième stade larvaire. Le deuxième stade larvaire a matraqué stigmates antérieurs, tandis que, pour le troisième stade larvaire, les stigmates antérieurs sont ramifiés. Un anneau orange foncé commence à apparaître au bout des stigmates postérieurs au troisième stade larvaire. <ol><li> Appliquez un morceau de ruban adhésif double face à une lame de verre de microscope propre. Expulsez les bulles d&#39;air sous la bande pour éviter les réflexions causées par des bulles d&#39;air lors de l&#39;imagerie. </li><li> Prenez l&#39;un des tubes avec les mouches cultivées sur de l&#39;incubateur au stade larvaire. </li><li> Identifier la larve dans les médias, retirez-le de la presse avec une brosse douce et placer sur un tissu propre. Retirez tous les aliments collé à la larve avec une brosse douce humide et sécher sur le tissu. </li><li> Déplacez le cleaneD voler vers un tissu sous l&#39;objectif d&#39;un microscope à champ large. </li><li> Réglez la mise au point du microscope pour trouver une vision claire de la mouche. Identifier la scène droite développement de la larve par ses caractéristiques structurelles avec le microscope. </li><li> Positionner la volée en utilisant la brosse douce. Assurez-vous que le corps est droit avec la face dorsale vers le haut pour se préparer à monter sur la lame de verre par la face dorsale. Effectuez cette étape sous le microscope. </li><li> Veiller à la larve est complètement sec avant de monter sur la bande. Dans le cas contraire, la larve ne sera pas adhérer à la bande. </li><li> Collez la face dorsale de la mouche positionnée sur la bande double face sur la lame de verre avec une pression modérée. Notez que trop de pression peut tuer la mouche et trop peu de force conduira à voler le mouvement lors de l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> L&#39; imagerie optique de la drosophile aux stades larvaires (L2 et L3) avec OCM NOTE: Une large lumière du tube cardiaque peut être found situé dans les segments entre A5 à A8 aux stades larvaires (Figure 1). Les images en mode M OCM transversal (2D + temps) ont été acquises au niveau du segment A7 du tube de coeur pour chaque larve pour faciliter la tension artérielle systolique et diastolique d&#39;analyse. <ol><li> Placer la chenille montée sur la platine porte-échantillon ajustable du système BGC selon la direction y transversale à la face dorsale tournée vers le haut en dessous de la lentille d&#39;objectif. Un petit trou dans l&#39;étape d&#39;échantillonnage est nécessaire pour placer la chenille afin d&#39;éviter son contact avec le plan de la scène. </li><li> Ajuster la phase de l&#39;échantillon pour déplacer le tube de coeur de la drosophile au plan focal du faisceau d&#39;imagerie. Pour trouver facilement le segment A7, trouver la région postérieure du tube cardiaque avec le temps réel des images MCO en coupe transversale dans le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Ensuite, passez la scène vers l&#39;avant jusqu&#39;à le segment A7 est visible. </li><li> Définissez les paramètres du logiciel d&#39;acquisition d&#39;image à 100 A-scans par B-scan (cadre), 100 B-scans et le scannela tension r ~ couvrir 0,28 mm dans la direction transversale X et 0 V dans la direction y transversale. Cliquez sur le bouton &quot;start&quot; dans le logiciel pour acquérir les données de bruit de fond pour soustraction de fond en bloquant le trajet du faisceau d&#39;échantillon avec un tissu sombre. REMARQUE: 3 des 100 images peuvent être utilisées pour la soustraction de fond. </li><li> Régler les paramètres du logiciel d&#39;acquisition de données 128 A-scans par balayage B, 4096 B-scan et la tension de balayage pour couvrir ~ 0,28 mm dans la direction x-transversale, et 0 V dans la direction y transversale. Cliquez sur le bouton &quot;start&quot; dans le logiciel pour acquérir les images transversales en mode M à travers le segment A7 du tube cardiaque à la mouche sur une région couvrant 0,28 x 0,57 mm 2 pendant environ 30 secondes. </li><li> Bloquer le faisceau d&#39;imagerie utilisant un tissu sombre pendant le processus de sauvegarde des données pour éviter une exposition prolongée du coeur de la mouche à la lumière d&#39;imagerie. </li><li> Répétez la mesure pour 5 fois pour obtenir une mesure fiable de l&#39;amusement de coeurction. </li><li> Définissez les paramètres du logiciel d&#39;acquisition d&#39;image à 400 A-scans par B-scan, 800 B-scans, et la tension du scanner pour couvrir ~ 1,7 mm dans la direction x-transversale, et ~ 4 mm dans la direction y transverse. Déplacer la scène dans les deux directions pour assurer l&#39;ensemble de la mouche des fruits peut être imagée. Cliquez sur le bouton &quot;start&quot; dans le logiciel pour acquérir un ensemble de données pour obtenir des images de la mouche des fruits en 3 dimensions. Remarque: La structure de volée 3D peut être rendu à l&#39;aide du logiciel Amira 3D </li><li> Utilisez une brosse douce humide pour humidifier la volée mesurée et doucement le retirer de la lame de verre. Déplacez-le dans un tube séparé pour le développement continu. Etiqueter le tube pour l&#39;étude longitudinale à travers les prochaines étapes de développement. </li></ol></li><li> Image Drosophila aux étapes de nymphose REMARQUE: Tous les mouches des fruits ont été prélevés pour l&#39;imagerie de PD1 à PD5. Comme on le voit sur le schéma de la larve de la figure 1b, un large passage reste en A5 à A8 segments de thtube cardiaque e jusqu&#39;à ce que PD1. De PD2, une chambre conique commence à se développer entre A1 à A4 segments. Pour acquérir des images cohérentes et faciliter l&#39; analyse cardiaque, transversales images en mode M ont été obtenus à partir du segment de A7 à PD1, et du secteur A1 après PD2, tel qu&#39;indiqué dans la figure 1b. <ol><li> Image Drosophila à PD1 NOTE: Drosophila aura un puparium blanc pour une fenêtre de temps court (0-1 h) pendant PD1. Cette fenêtre de temps est idéal pour effectuer l&#39;imagerie optique de pupe tôt parce que la transparence élevée conduit à la pénétration de lumière plus élevée pour l&#39;imagerie de l&#39;OCM. <ol><li> Comme les mouches des fruits se trouvent sur la paroi du tube quand ils deviennent chrysalides, retirez la pupe de tubes individuels pour l&#39;imagerie à PD1 avec une brosse douce humide, et nettoyer la chrysalide avec la brosse, s&#39;il y a la nourriture collée au corps. </li><li> Monter la mouche des fruits sur une petite lame de verre directement avec la brosse humide et garder la face dorsale vers le haut (figure 1a </strong&gt;). Assurez-vous que la lame de verre est assez petit pour tenir dans le tube une fois l&#39;imagerie à ce stade est terminé. </li><li> Éliminer l&#39;excès d&#39;eau du côté du corps de mouche. </li><li> Mettez la lame de verre sur la scène du système OCM de l&#39;échantillon, en gardant la mouche des fruits sur le dessus. Trouver une image claire en temps réel du segment A7 du cœur à la mouche en utilisant la même stratégie décrite dans la mesure de la larve. </li><li> Définissez les mêmes paramètres du logiciel d&#39;acquisition de données dans la section 3.2, et l&#39;image les battements de coeur au segment A7 d&#39;acquérir M-mode transverse et des images 3D. </li><li> Après l&#39;imagerie, utilisez une pince pour placer la lame de verre avec pupe dans le tube pour la culture continue. </li></ol></li><li> Image Drosophila à PD2 aux stades Pd5 REMARQUE: Etant donné que l&#39;échantillon devient de plus en plus opaque au cours des étapes de nymphose, la profondeur du système d&#39;imagerie de pénétration sera réduite. <ol><li> Utilisez une pince à épiler pour retirer soigneusement le verre slide monté à la mouche à PD2 du tube pour l&#39;imagerie. À PD2, la coquille de l&#39; échantillon devient jaune et le corps devient moins transparent par rapport à PD1 (figure 1). </li><li> Mettre la lame sur la platine du système OCM de l&#39;échantillon. </li><li> Ajuster la phase de l&#39;échantillon à se déplacer à la volée dans le plan focal du faisceau d&#39;imagerie du système BGC. Trouver l&#39;extrémité antérieure du tube cardiaque en temps réel image MCO en coupe avec. Déplacer ~ 50 pm dans la direction postérieure pour trouver le segment A1 du tube cardiaque. NOTE: A ce stade du développement cardiaque (PD2), la chambre conique sera très faible et ne peut pas être battu. </li><li> Collecter des jeux de données transverses en mode M du segment A1 ainsi que des données 3D en utilisant la même méthode que celle des stades de développement précédents. </li><li> Replacer la lame sur le tube soigneusement pour la culture continue. NOTE: À PD3, la couleur de l&#39;échantillon dans la coquille est plus sombre que celle à l&#39;étape PD2. Au stade PD4, rayures noires can être observée à l&#39;intérieur de la coquille des spécimens. Certaines mouches vont se développer en adultes à partir de cette étape du lendemain, tandis que d&#39;autres vont évoluer vers PD5. Au stade PD5, des bandes noires sont encore plus évidemment vu dans les mouches des fruits. Ces mouches deviendront adultes dans le jour suivant. </li></ol></li></ol></li><li> Image Drosophila au stade adulte Remarque: Au stade adulte, les mouches mâles et femelles peuvent être distinguées par la taille du corps et de la couleur du bas-ventre. Les femelles adultes ont une plus grande taille, tandis que les mâles sont plus petits et de couleur foncée dans le bas ventre. <ol><li> Prenez le tube hors de l&#39;incubateur lorsque la mouche des fruits se développe en un adulte, et le transfert de l&#39;adulte voler à un ~ 45 ml flacon vide. </li><li> Trempez l&#39;extrémité absorbante (~ 1 cm de longueur, ~ 3 mm de diamètre) d&#39;une baguette dans l&#39;anesthésie, mettez la baguette dans le flacon, et branchez le tube avec une grappe de coton pour maintenir l&#39;extrémité anesthésique juste en dessous du coton branché et anesthetize la volée pendant 3 min. La durée de l&#39;anesthésie dépend de la taille de la mouche, et peut varier entre 02/05 à 03/05 min (par exemple, pendant 2,5 minutes mâle et femelle pour 3 ou 3,5 min). </li><li> Préparer une lame de verre avec un morceau de ruban adhésif double face. </li><li> Déplacer la volée anesthésiés sur la lame de verre avec face dorsale vers le haut en utilisant la brosse douce. </li><li> Séparer les ailes en utilisant une pince à épiler et coller les ailes sur la bande sous un microscope pour fixer la volée et d&#39;exposer la région du cœur pour l&#39;imagerie. </li><li> Image à la volée à partir du segment A1 du coeur de mouche (Figure 1). A la fin de l&#39;expérience, la mouche peut être sacrifiée. </li></ol></li></ol> 4. Imagerie Analyse 16 <ol><li> Développer des programmes Matlab pour convertir les fichiers binaires 2D et 3D collectées avec le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image pour les fichiers d&#39;image. </li><li> Utilisez ImageJ pour identifier la région du tube cardiaque dans les transversales images en mode M et un algorithme de baguette magique pour creatmasque ea de la région du cœur pour chaque image transversale M-mode. Segment de la région masquée et utiliser un algorithme de pointe trouver pour identifier les emplacements systolique et diastolique. Calculer les dépendants des changements de temps de diamètre du coeur des transversales images en mode M. </li><li> Sur la base des dépendants diamètres cardiaques de temps acquis, calculer les paramètres cardiaques tels que HR, période d&#39;activité cardiaque (CAP), fin diamètre diastole (EDD), fin diamètre systole (ESD), fin zone diastole (EDA), et mettre fin à la zone systole ( ESA). Calculer la fraction de raccourcissement (FS) avec <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> Utilisez ImageJ pour analyser les images 3D OCM pour visualiser l&#39;évolution structurelle du cœur à la mouche. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à la présente étude.

L&#39;accélération du rythme cardiaque de la drosophile, avec un HR maximum autour de 400 bpm à des stades larvaires et adultes, exige de la vitesse élevée d&#39;imagerie pour résoudre les diastole cardiaques et systole (pas moins de 80 images / s basé sur les expériences). En raison de la faible épaisseur de la taille de la chambre cardiaque et micron échelle paroi cardiaque (5-10 um), une résolution spatiale élevée (supérieure à 2 pm) est nécessaire pour résoudre les structures tubulaires de coeur. Dans cette...

Étude longitudinale du cœur chez les petits animaux contribue à la compréhension d&#39; une variété de maladies cardiovasculaires liées humaines, comme gènes liés à des malformations cardiaques congénitales 1,2. Au cours des dernières décennies, divers modèles animaux, tels que le 3,4 de la souris, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviaire 9, et Drosophila 10-16, ont été utilisées pour mener le cœur du développement humain recherche liée. Le modèle de souris a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque normal et anormal et phénotypes de défauts cardiaques en raison de ses similitudes avec le 3,4 cœur humain. L&#39;embryon de Xenopus est particulièrement utile dans l&#39;étude du développement cardiaque due à sa facilité de manipulation et partielle 5,6 transparence. La transparence de l&#39;embryon et larve début du modèle zebrafish permet l&#39; observation optique facile cardiaque 7,8 de développement. Le modèle aviaire est un sujet commun d&#39;études cardiaques développement because le cœur peut être facilement accessible après avoir retiré les coquilles et la similitude morphologique des coeurs aviaires aux humains 9. Le modèle drosophile a des caractéristiques uniques qui le rendent idéal pour la réalisation d&#39; études longitudinales du cœur. Tout d&#39; abord, le tube du coeur de la drosophile est d&#39; environ 200 um en dessous de la surface dorsale, qui fournit un accès facilité pour l&#39; observation optique et du coeur. En outre, de nombreux mécanismes moléculaires et les voies génétiques sont conservées entre la drosophile et les vertébrés. Les orthologues de plus de 75% des gènes de maladies humaines ont été trouvées chez la drosophile, qui ont fait largement utilisé dans les études transgéniques 11,13. En outre, il a un cycle de vie court et faibles coûts de maintenance, et a été couramment utilisé comme un modèle exemplaire pour la recherche sur la biologie du développement 14-16. Les rapports précédents ont décrit les protocoles de surveillance de la fonction cardiaque chez la drosophile comme le luiartbeat. Toutefois, les procédures de dissection ont été nécessaires 17,18. L&#39;imagerie optique fournit un moyen efficace pour visualiser le développement cardiaque chez les animaux en raison de sa nature non-invasive. Différentes modalités d&#39;imagerie optique ont été appliquées dans l&#39; exécution de l&#39; étude cardiaque des animaux, tels que la microscopie à deux photons 19, microscopie confocale 20,21, microscopie nappe de lumière 22, et tomographie par cohérence optique (OCT) 16,23-26. Comparativement, EAO est capable de fournir une grande profondeur d&#39;imagerie dans les petits coeurs des animaux sans l&#39;aide d&#39;agents de contraste, tout en conservant une haute résolution et une vitesse d&#39;imagerie ultravide, qui sont importants pour l&#39;imagerie des animaux vivants. En outre, le faible coût de développement d&#39;un système octobre a popularisé cette technique pour l&#39;imagerie optique de spécimens. Octobre a été utilisé avec succès pour l&#39;étude longitudinale de la drosophile. Utilisation de EAO, l&#39;imagerie morphologique et fonctionnelle cardiaque a été réalisée pour étudier les structures cardiaques, le foncrôles additionnelles de gènes, et les mécanismes de défauts cardiovasculaires dans les modèles mutants au cours du développement cardiaque. Par exemple, le déclin de la fonction cardiaque dépendant de l&#39; âge a été confirmée par conversion de l&#39; angiotensine liés enzyme (ACER) gène régulé à la baisse chez la drosophile avec le 27 octobre. Phénotypage du gène lié cardiomyopathie a été démontrée chez la drosophile en utilisant 28-33 octobre. Les recherches utilisant octobre a également révélé le rôle fonctionnel du gène SOX5 humain au cœur de Drosophila 34. Par rapport à octobre, OCM utilise un objectif avec une ouverture numérique supérieure pour fournir une meilleure résolution transversale. Dans le passé, le dysfonctionnement cardiaque causé par silençage un gène circadien humain orthologue dCry / dclock a été étudiée en utilisant un système de OCM personnalisé 15,16, ainsi que l&#39;effet de la haute teneur en graisses-alimentation sur cardiomyopathies chez la drosophile pour comprendre l&#39; obésité induite par l&#39; homme maladies cardiaques. 15 Ici, ee protocole expérimental est résumée pour l&#39; étude longitudinale des changements morphologiques et fonctionnels cardiaques chez la drosophile au deuxième stade (L2), troisième stade (L3), le jour de pupe 1 (PD1), le jour de pupe 2 (PD2), le jour de pupe 3 (PD3) , pupe jour 4 (PD4), le jour de pupe 5 (PD5) et adultes (Figure 1) à l&#39; aide OCM pour faciliter l&#39; étude des maladies cardiaques congénitales liées à l&#39; homme. paramètres fonctionnels cardiaques, tels que les RH et la PAC ont été analysés de façon quantitative à différents stades de développement des caractéristiques cardiaques développement révéler.

<table><tbody><tr><td>Système d’imagerie OCM personnalisé</td><td>Développé dans notre laboratoire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>my Temp Mini Digital Incubator</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Drosophila Formula</td><td>CAROLINA</td><td>formula 4-24</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>utilisé pour déplacer des échantillons</td></tr><tr><td>Logiciel Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>pour fixer le fruit ailes de mouche</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4 224 898</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Permanent Double Face Tape, 3 M</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pipette Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>Organic Extra Coconut Oil</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>CapitolBrand</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td> Drosophile Flacons</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique microscopie (ocm)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

L’étude longitudinale du rythme cardiaque chez les petits animaux contribue à comprendre les changements structurels et fonctionnels au cours du développement cardiaque. Il a été démontré que la microscopie à cohérence optique (MCO) est capable d’imager des cœurs de petits animaux avec une résolution spatiale élevée et une vitesse d’imagerie ultra-élevée. Le contraste d’image élevé et les propriétés non invasives rendent l’OCM idéal pour effectuer des études longitudinales sans nécessiter de dissections ou de coloration des tissus. La drosophile a été largement utilisée comme organisme modèle dans les études sur le développement cardiaque en raison de son grand nombre de gènes de maladies humaines orthologues, de la similitude de ses mécanismes moléculaires et de ses voies génétiques avec les vertébrés, de son cycle de vie court et de son faible coût de culture. Ici, les protocoles expérimentaux sont décrits pour la préparation de la drosophile et l’imagerie optique du rythme cardiaque avec un système OCM personnalisé tout au long du cycle de vie de l’échantillon. En suivant les étapes fournies dans ce rapport, des images transverses en mode M et en 3D OCM peuvent être acquises pour mener des études longitudinales de la morphologie et de la fonction cardiaques de la drosophile. Les images OCM en coupe frontale et axiale ainsi que les histogrammes de fréquence cardiaque (FC) et de période d’activité cardiaque (CAP) ont également permis d’analyser les changements structurels cardiaques et de quantifier la dynamique cardiaque pendant la métamorphose de la drosophile, combinés aux vidéos construites avec des images en mode M pour suivre intuitivement l’activité cardiaque. En raison de la similitude génétique entre la drosophile et les vertébrés, l’étude longitudinale de la morphologie et de la dynamique cardiaques chez les mouches des fruits pourrait aider à révéler les origines des maladies cardiaques humaines. Le protocole ici fournirait une méthode efficace pour effectuer un large éventail d’études afin de comprendre les mécanismes des maladies cardiaques chez l’homme.

L&#39;imagerie cardiaque longitudinale a été réalisée en utilisant les mouches des fruits avec le 24B-GAL4 / + déformation à température ambiante avec OCM. Les mesures ont été effectuées à L2, L3, et à des intervalles de 8 h de PD1 à PD4 et jour pour adultes 1 (AD1) pour suivre le processus de métamorphose (tableau 1). Larve, pupe tôt, fin pupe et les mouches adultes ont été montés sur les lames de verre comme on le voit sur la figure 1A. Les caractéristiques des segments du cœur pour l...

Ici, les protocoles expérimentaux sont décrits pour préparer la drosophile à différents stades de développement et effectuer une imagerie optique longitudinale des battements cardiaques de la drosophile à l’aide d’un système de microscopie à cohérence optique (OCM) personnalisé. Les changements morphologiques et dynamiques cardiaques peuvent être caractérisés quantitativement en analysant les paramètres structurels et fonctionnels du cœur à partir d’images OCM.

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

L’objectif général de cette procédure est d’imager longitudinalement la fonction cardiaque de la drosophile in vivo à l’aide d’une technique de microscopie à cohérence optique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement structurel et fonctionnel cardiaque de la drosophile en fournissant des mesures, telles que les changements de diamètre cardiaque, de fréquence cardiaque et la période d’activité cardiaque pendant la métamorphose de la drosophile. Le principal avantage de cette technique est que la microscopie à cohérence optique est capable d’imager des cœurs de petits animaux de manière non invasive avec une haute résolution spatiale et temporelle.Cette technique peut aider à révéler les mécanismes des maladies cardiaques humaines et la relation avec le développement cardiaque en raison des similitudes génétiques qui existent entre la drosophile et les vertébrés. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la stimulation optogénétique pour étudier ou traiter la fonction affaiblie du stimulateur cardiaque dans des modèles animaux. Lors de la production des mouches pour cette expérience, laissez les mouches

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La contractilité de l’actomyosine joue un rôle important dans la morphogenèse des cellules et des tissus. Cependant, il est difficile de manipuler la contractilité de l’actomyosine in vivo de manière aiguë. Ce protocole décrit un système optogénétique qui inhibe rapidement la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 dans les embryons de drosophile , révélant la perte immédiate de la tension épithéliale après l’inactivation de l’actomyosine in vivo.

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Le protocole de sectionnement cardiaque et d’imagerie par fluorescence de la drosophile simplifie l’étude de la structure et des pathologies cardiaques. Cette approche implique une section, une coloration et une imagerie simples, en contournant l’expertise technique nécessaire à la dissection traditionnelle. Il améliore l’accessibilité, faisant de la drosophile un modèle plus largement utilisable pour la recherche liée à la cardiologie au sein de la communauté scientifique au sens large.

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Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM) (Vidéo) | JoVE Journal

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

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