Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

L’objectif général de cette procédure est d’imager longitudinalement la fonction cardiaque de la drosophile in vivo à l’aide d’une technique de microscopie à cohérence optique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement structurel et fonctionnel cardiaque de la drosophile en fournissant des mesures, telles que les changements de diamètre cardiaque, de fréquence cardiaque et la période d’activité cardiaque pendant la métamorphose de la drosophile. Le principal avantage de cette technique est que la microscopie à cohérence optique est capable d’imager des cœurs de petits animaux de manière non invasive avec une haute résolution spatiale et temporelle.

Cette technique peut aider à révéler les mécanismes des maladies cardiaques humaines et la relation avec le développement cardiaque en raison des similitudes génétiques qui existent entre la drosophile et les vertébrés. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la stimulation optogénétique pour étudier ou traiter la fonction affaiblie du stimulateur cardiaque dans des modèles animaux. Lors de la production des mouches pour cette expérience, laissez les mouches parentales reproductrices s’accoupler et pondre des œufs dans un flacon frais pendant huit heures.

Ainsi, la couvée d’œufs pondus se développera en mouches du même âge. Pour monter une larve pour l’imagerie OCM, préparez d’abord un côté propre avec un morceau de ruban adhésif double face. Expulsez les bulles d’air emprisonnées sous le ruban.

Ensuite, utilisez une brosse douce pour retirer une larve de la bonne taille du flacon. Placez la larve sur un mouchoir propre. Retirez tous les aliments collés dessus à l’aide d’une brosse humidifiée, puis laissez-le sécher.

Maintenant, sous un microscope à grand champ, confirmez le stade de développement de la larve. Ensuite, positionnez la larve avec la face dorsale vers le haut pour le montage. Ensuite, abaissez la glissière collante sur la larve et utilisez une pression modérée pour la fixer au ruban.

Placez la larve montée sur la platine réglable du système OCM le long de la direction transversale en Y, le côté dorsal vers le haut. Un petit trou dans la scène maintient la larve hors de contact avec le plan de la scène. Une large lumière du tube cardiaque se trouve des segments A5 à A8. À l’aide des images en temps réel sur l’ordinateur, trouvez la région postérieure du tube cardiaque et avancez la platine jusqu’à ce que le segment A7 soit visible.

Maintenant, définissez les paramètres de l’acquisition d’image. Utilisez 100 A-scans par B-scan et utilisez 100 B-scans. Ensuite, réglez la tension du scanner pour qu’elle couvre environ 0,28 millimètre dans la direction transversale x et réglez-la sur 0 volt dans la direction transversale y.

Ensuite, bloquez le chemin du faisceau de l’échantillon avec un chiffon sombre et cliquez sur le bouton de démarrage dans le logiciel pour acquérir des données de bruit de fond pour la soustraction de l’arrière-plan. Pour collecter des images transversales en mode M, ajustez les paramètres à 128 A-scans par B-scan et utilisez 4 096 B-scans. Ensuite, réajustez la tension pour couvrir 0,28 millimètre dans la direction x et 0 volt dans la direction y comme précédemment.

Ensuite, acquérez des images en mode M transversal du segment A7 du tube cardiaque de la mouche. Pendant le processus d’enregistrement des données, bloquez le faisceau d’imagerie avec un chiffon sombre pour minimiser l’exposition à la lumière de l’échantillon. Imagez le cœur cinq fois pour obtenir une mesure fiable de la fonction cardiaque.

Pour collecter des images tridimensionnelles, utilisez 400 A-scans par B-scan, 800 B-scans, et utilisez une tension de 1,7 millimètre sur l’x-transversal et d’environ 4 millimètres sur l’y-transverse. Ensuite, déplacez la platine du microscope pour observer l’ensemble de la mouche et ajustez la mise au point pour voir des images claires. Pour enlever la larve, utilisez une brosse douce et humide pour la transférer dans un nouveau flacon avec de la nourriture fraîche pour un développement continu et une étude longitudinale.

La lumière large du tube cardiaque reste aux segments A5 à A8 au stade nymphal PD1. À PD1, essayez d’imager le segment A7, comme cela a été fait avec les larves des stades L2 et L3. Le stade nymphal PD1 est identifié par le pubarium blanc.

Cette fenêtre temporelle est idéale pour effectuer l’imagerie optique de la chrysalide précoce, car la transparence élevée conduit à une plus grande pénétration de la lumière pour l’imagerie OCM. Nettoyez la chrysalide avec la brosse s’il y a de la nourriture collée au corps. À l’aide d’une brosse humide, montez la chrysalide sur une petite lame de verre et gardez la face dorsale vers le haut.

La lame doit s’insérer dans un tube anti-mouches pour préserver le développement de l’animal dans sa propre chambre. Séchez tout excès d’eau de la nymphe, puis placez-la sur la scène avec la chrysalide vers le haut et procédez à l’imagerie du segment A7 comme fait avec la larve. Après l’imagerie, transférez la lame de verre avec la chrysalide dans le tube pour une culture continue.

Après l’étape PD1, à partir de la PD2, une chambre conique commence à se développer entre les segments A1 et A4. Comme les nymphes deviennent progressivement plus opaques, la profondeur de pénétration du système d’imagerie est réduite. À PD2, la coquille de la nymphe devient jaunâtre et le corps est moins transparent que PD1.

À PD3, la couleur de la chrysalide est encore un peu plus foncée que celle du stade PD2. Au stade PD4, des bandes noires peuvent être observées à l’intérieur de la coquille. Certains PD4 se développeront en adultes et d’autres entreront au stade PD5.

Dans l’étape PD5, les bandes noires sont encore plus évidentes. Prenez une chrysalide PD2 à l’aide d’une pince à épiler et montez-la sur une diapositive. Sur le système OCM, trouvez l’extrémité antérieure du tube cardiaque, puis déplacez-vous d’environ 50 microns vers la postérieure pour trouver le segment A1 du tube cardiaque.

Notez qu’au stade PD2, la cavité conique du cœur est très petite et peut ne pas encore battre. Procédez à l’imagerie comme décrit précédemment. Répétez la même procédure pour l’imagerie de la drosophile aux stades PD3, PD4 et PD5.

Pour commencer, transférez la mouche adulte dans un flacon vide d’un volume d’environ 45 millilitres. Ensuite, trempez un applicateur en coton dans la solution anesthésique et placez la baguette dans le flacon avec l’embout en coton juste en dessous du bouchon en coton. Attendez trois minutes.

La mouche adulte sera anesthésiée pendant deux minutes et demie à trois minutes et demie, selon sa taille. Préparez maintenant une lame de verre avec un morceau de ruban adhésif double face. Ensuite, à l’aide d’une brosse douce, déplacez la mouche anesthésiée sur la lame de verre avec la face dorsale vers le haut.

Sous un microscope à grand champ, séparez les ailes à l’aide d’une pince à épiler et collez-les sur le ruban, exposant ainsi la région du cœur pour l’imagerie. Maintenant, utilisez la technique d’imagerie décrite précédemment pour imager le segment A1 du cœur et sacrifiez la mouche à la fin de l’expérience. L’imagerie cardiaque longitudinale a été réalisée à l’aide de mouches souches avec une copie du pilote 24B-GAL4.

Aux stades larvaires, le tube cardiaque commence dans la région abdominale postérieure A8 avec une lumière plus large et se termine au segment dorsal antérieur A1 avec un diamètre plus étroit. Vers la fin de PD2, une chambre conique a commencé à se développer sur le segment A1 à A4. La fréquence cardiaque de la mouche a été quantifiée à partir des images transversales de l’OCM en mode M.

Curieusement, pendant les stades nymphaux, le cœur s’arrêtait de battre de temps en temps. Dans l’ensemble, le rythme cardiaque a ralenti de manière significative du stade larvaire au stade nymphal, puis a considérablement augmenté de la nymphe à l’adulte. Depuis ce développement, cette technique a donné aux chercheurs dans le domaine de la cardiologie du développement un nouvel outil pour explorer les effets de divers gènes sur le développement cardiaque dans des modèles de drosophile.

Lors de cette procédure, il est important de suivre attentivement le développement d’une drosophile afin de créer des images à chaque étape du développement.