Name: Production, Cristallisation et structure Détermination de C. difficile PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez la méthode de microseeding pour cristalliser PPEP-1 de Clostridium difficile et obtenir des cristaux de haute qualité pour la diffraction aux rayons X. Cette technique améliore l'étude structurale des protéines.

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Nous remercions le personnel du X06DA de ligne de lumière à la Source de Lumière Suisse, Paul-Scherrer Institut, Villigen, en Suisse pour le soutien lors de la collecte de données de synchrotron. Nous sommes reconnaissants à Monika Gompert pour un excellent support technique. Le projet a été soutenu par l&#39;Université de Cologne et accorder INST 216 / 682-1 FUGG du Conseil de recherche allemand. Une bourse de doctorat de la Graduate School internationale en santé et développement des maladies à CP est reconnu. Les recherches menant à ces résultats ont reçu un financement du septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de la convention de subvention n ° 283570 (BioSTRUCT-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cristallographie aux rayons X est encore la méthode la plus rapide et la plus précise pour déterminer trois dimensions des structures de résolution quasi atomique de protéines 28. Cependant, il nécessite la croissance de monocristaux bien ordonnées. Ceux-ci sont souvent difficiles à obtenir et l&#39;état cristallin est artificiel. Toutefois, une comparaison des structures protéiques déterminées par cristallographie aux rayons X avec celles déterminées par d&#39;autres méthodes, en particulier RMN, montre géné...

Clostridium difficile est l&#39; une des principales causes de diarrhées infections associées aux antibiotiques nosocomiales 1. Cette bactérie anaérobie à Gram positif est transmis par sa forme de spores par voie fécale-orale. Dans la dernière décennie, le nouveau &#39;&#39; épidémie &#39;&#39; ou &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; souches (par exemple BI / NAP1 / 027) a provoqué une augmentation drastique des nouvelles infections et des taux de mortalité en Amérique du Nord et en Europe 2. C. maladie -Associated difficile (DACD) est un danger pour la vie du côlon inflammation avec des taux de létalité élevés 3. Les symptômes vont de la diarrhée 4 à la colite pseudomembraneuse 5 et le mégacôlon toxique souvent mortelle 6. Le traitement de la DACD est difficile , car les souches virulentes sont multirésistante et le taux de récidive est élevé 7. A la thérapie de couple comprend le métronidazole antibiotiques, fidaxomicine ou vancomycine, ou repetiticas récurrents de transplantation fécale vement du microbiote. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires d&#39; urgence 8. Certains progrès sont enregistrés en tant que thérapeutique anticorps monoclonal Bezlotoxumab, ciblant la toxine C. difficile B 9, a récemment passé avec succès la phase III des essais cliniques et a été soumis à l&#39; approbation de la FDA et de l&#39; EMA. En outre, les nouveaux antibiotiques sont testées à l&#39;heure actuelle à différents stades d&#39;essais cliniques 10. Pour développer un traitement efficace de nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiés. Récemment découvert C. protease difficile endopeptidase-1 proline-proline (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; CE 3.4.24.89) est une cible prometteuse, comme le manque de PPEP-1 dans une souche de knock-out diminue la virulence de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 sécrété est une métalloprotéase 12,13 cliver deux adhésines de C. difficile à leur extrémité C-terminale 13 libérant ainsi l&#39;adhérence bacterentre autres de l&#39;épithélium de l&#39;intestin humain. Par conséquent, il est impliqué dans le maintien de l&#39;équilibre entre le phénotype et sessiles motiles de C. difficile. Pour développer des inhibiteurs sélectifs contre PPEP-1 et de comprendre comment il reconnaît ses substrats connaissance intime de sa structure tridimensionnelle est indispensable. Nous avons résolu la première structure cristalline de PPEP-1 seul ou en complexe avec un peptide substrat 14. PPEP-1 est la première protéase connue qui clive sélectivement les liaisons peptidiques entre les deux résidus de proline 15. Elle lie le substrat d&#39;une manière double entortillé et stabilise via un réseau étendu aliphatique-aromatique de résidus situés dans le S-boucle qui couvre le site actif de la protéase 14. Ce mode de liaison au substrat est unique à PPEP-1 et ne trouve pas dans les protéases humaines à ce jour. Cela en fait une cible de médicament prometteur, et les effets hors-cible des inhibiteurs très improbables. Pour développer et écran sélective PPEP-1 inhibitors à l&#39;avenir, une grande quantité de pur et monodisperse PPEP-1 protéine est nécessaire. En outre, pour déterminer le mode de liaison des premiers inhibiteurs, des structures co-cristallines avec PPEP-1 devra être déterminée. Dans nos mains PPEP-1 produit constamment cristaux enchevêtrés. Ainsi, nous avons mis au point une procédure d&#39;optimisation pour produire des cristaux simples Diffraction qualité de PPEP-1. Dans ce protocole , nous décrivons en détail la solution de PPEP-1 14 production, la purification, la cristallisation et de la structure. Nous utilisons l&#39; expression intracellulaire dans Escherichia coli d&#39;une variante PPEP-1 dépourvu de la séquence signal de sécrétion, une Chromatographie d&#39; affinité et Chromatographie d&#39;exclusion de taille avec l&#39; enlèvement de l&#39;étiquette de purification, suivie microseeding 16 dans un écran d&#39;optimisation et la détermination de la structure par l&#39; intermédiaire du zinc longueur d&#39; onde unique dispersion anormale (zinc-SAD) 17. Ce protocole peut être adapté pour la production et la détermination de la structure d&#39;autres protéines (par exemple &lt;/ Em&gt; métalloprotéases) et en particulier pour les protéines produisant des cristaux enchevêtrés. Sur demande, l&#39;ADN plasmidique de la construction (pET28a-NHis-rPPEP-1) Les données de diffraction et peut être fourni à des fins éducatives.

<table><tbody><tr><td>Vecteur Genes / Vecteurs / Souches cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Clivage de la thrombine N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli souche BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficient</td></tr><tr><td>Codon Gene (for E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>acides aminés personnalisés</td><td>27-220</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>n’importe quel</td> Tryptone n’importe quel <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimousse B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>émulsion aqueuse-silicone</td></tr><tr><td>Agar</td><td>n’importe quelle</td> Kanamycine n’importe quelle <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Grade</td></tr><tr><td>tampon NaCl</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>Grade</td></tr><tr><td>tampon DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Grade tampon</td></tr><tr><td>Thrombine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate d’ammonium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol 100 %</td><td></td><td></td> toute <td>qualité la plus pure</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquide azote</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour le stockage et le cryorefroidissement des cristaux</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment (general)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>fournissant des températures de 20 &deg ; C - 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Verrerie</td><td>tout</td><td></td><td>Erlenmeyer à chicanes Flacons (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour grands volumes de culture</td><td>toute</td><td></td><td>centrifugeuse pour le traitement de volumes jusqu’à 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>ou tout autre sonicateur / perturbateur de cellules</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>toute</td><td></td><td>centrifugeuse offrant des vitesses allant jusqu’à 150 000 x g</td></tr><tr><td>Résine NiNTA Superflow</td>, <td>Qiagen,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre vide, Econo-Column</td>, <td>Bio-Rad</td>, <td>7371007</td><td>ou toute autre colonne vide en verre ou en plastique</td></tr>, <tr><td>Colonne de chromatographie d’exclusion stérique, HiLoad, Superdex 200, 16/600</td>, <td>GE, Healthcare</td>, <td></td> 28989335 <td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie & Auml ; kta Purificateur</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>ou tout autre système de chromatographie</td></tr><tr><td>Tubes de dialyse Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Fermetures de tubes de dialyse</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td>Unités d’ultrafiltration</tr><tr><td>(concentrateurs) 10 000 NWCO</td><td>tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spectrophotomètre UV-Vis</td><td>tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment (cristallographie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette à faible volume 0.1-10 &micro ; l</td><td>toute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette à déplacement positif Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>robot de cristallisation</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaque de cristallisation à 96 puits, TTP IQ à trois puits de protéines,</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>ou toute autre plaque de cristallisation à 96 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>24 puits CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité cristallin</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture en verre siliconé</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Écrans de cristallisation commerciaux : SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>écrans de cristallisation commerciaux : Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (boucles en nylon)</td><td>Hampton Research</td><td>diverses</td><td>tailles de boucles 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Mousse cryogénique Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Mousse cryogénique Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Pince à flacons, droite</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand magnétique, droite</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Porte-flacons</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Codeur couleur - Blanc</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropince droite</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour la manipulation du ruban d’étanchéité. etc.</td></tr><tr><td>Aiguille d’acupuncture</td><td>n’importe lequel</td><td></td><td>par exemple d’une pharmacie</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour l’inspection des plaques de cristallisation et le montage des cristaux, grossissement jusqu’à 160X</td></tr></tbody></table>

production, cristallisation et structure détermination de<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 via microseeding et zinc-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

De nouvelles thérapies sont nécessaires pour traiter les infections à Clostridium difficile qui constituent une menace majeure pour la santé humaine. La métalloprotéase PPEP-1 de C. difficile est une cible pour le développement futur d’inhibiteurs visant à réduire la virulence de l’agent pathogène. Pour effectuer une caractérisation biophysique et structurale ainsi qu’un criblage d’inhibiteurs, de grandes quantités de protéines pures et actives seront nécessaires. Nous avons mis au point un protocole pour une production et une purification efficaces de PPEP-1 par l’utilisation d’E. coli comme hôte d’expression, produisant des quantités suffisantes et une pureté de protéines suffisantes pour la cristallisation et la détermination de la structure. De plus, en utilisant le microensemencement, des cristaux fortement intercalés de PPEP-1 peuvent être cultivés en cristaux bien ordonnés adaptés à l’analyse par diffraction des rayons X. Les méthodes pourraient également être utilisées pour produire d’autres protéines recombinantes et pour étudier les structures d’autres protéines produisant des cristaux intercalés.

rPPEP-1 est surexprimé dans plusieurs souches de E. coli, avec le rendement le plus élevé dans E. coli BL21 (DE3) étoile (figure 1C). Après la première étape de Chromatographie d&#39;affinité 6xHis-NiNTA le marqueur peut être clivé avec succès à partir de la plupart de la protéine et dans la deuxième étape NiNTA protéine non digérée peut être complètement séparée de la thrombine digérée par la protéine (figure 1D). Sur un S200 16/600 co...

La proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) est une métalloprotéase sécrétée et une cible médicamenteuse prometteuse de l’agent pathogène humain Clostridium difficile. Nous décrivons ici toutes les méthodes nécessaires à la production et à la détermination de la structure de cette protéine.

Production, Cristallisation et structure Détermination de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver efficacement des cristaux de qualité diffraction sur un seul réseau de la protéine recombinante proline proline endopeptidase-1, ou rPPEP-1. Sans cette méthode, rPPEP-1 produit instantanément des cristaux fortement intercalés qui ne conviennent pas à l’analyse par diffraction des rayons X. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de cristaux bien ordonnés et bien diffractant pour la détermination structurale de rPPEP-1 peut être produit dans un court laps de temps et avec un apport limité de matière.Cette procédure utilise la méthode des microcités et peut être adaptée à toutes les conditions de cristallisation initiale réussies du rPPEP-1 ainsi que de ses complexes peptidiques de substrat. Cette méthode peut être adaptée pour produire des cristaux bien ordonnés de pratiquement toutes les protéines qui produisent des cristaux intercalés. Il peut également être utilisé dans des expériences d’ensemencement croisé, de variance de protéines ou dans des expériences de cocristallisation avec de petites molécules.La démonstration visuelle de la manipulation des méthodes de cristallisation est cruciale, car même de petites variations peuvent avoir un impact significatif sur la qualité de diffraction des cristaux. Effectuer des essais de cristallisation au format goutte assise à l’aide d’écrans standard disponibles dans le commerce et d’un robot de cristallisation. Tout d’abord, concentrez la protéine purifiée à 12 milligrammes par millilitre à l’aide d’un appareil d’ultrafiltration centrifuge à des intervalles de cinq minutes à 4000 fois g et quatre degrés Celsius.Mélangez les protéines après chaque intervalle pour éviter les précipitations et l’aggravation. Déterminez la concentration en protéines à 280 nanomètres en utilisant le coefficient d’extinction de 25,900 par centimètre molaire. Après avoir équilibré la protéine à 20 degrés Celsius, éliminez toutes les particules et la poussière par centrifugation pendant 10 minutes à 16000 fois g et 20 degrés Celsius.Pour réaliser des écrans de cristal, utilisez des plaques de cristallisation préremplies scellées et stockées à quatre degrés Celsius. Lors de la mise en place d’essais, travaillez rapidement, car les petits volumes sèchent rapidement. Utilisez également une chambre d’humidité autour de la station d’accueil du robot si possible.Après avoir équilibré toutes les plaques de cristallisation à 20 degrés Celsius, installez le tamis en pipetant le réservoir d’entl de protéines dans deux à quatre sous-puits. Utilisez un volume de goutte de 300 nanolitres. Utilisez des rapports protéines/réservoir de 200:100 pour le sous-puits deux, de 150:150 pour le sous-puits trois et de 100:200 pour le sous-puits quatre.Fermez immédiatement la plaque et placez-la dans une chambre à 20 degrés Celsius. Inspectez les plateaux après l’installation tous les jours pendant la première semaine, puis effectuez une inspection hebdomadaire. Pour une cocristallisation des complexes peptidiques de substrat rPPEP-1, mélanger rPPEP-1 à 24 milligrammes par millilitre dans un rapport de 1:1 avec un excès molaire de sept fois plus de solution peptidique de poudre lyophilisée solubilisée dans une solution saline tamponnée tris.Après une incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius, éliminez toutes les particules et poussières par centrifugation pendant 10 minutes à 16000 fois g et 20 degrés Celsius. Procéder à la cristallisation en utilisant la même procédure de micro-ensemencement que pour la protéine rPPEP-1 non liée. Des cristaux fortement intercalés de rPPEP-1 sont apparus après deux jours dans un état contenant 2,4 molaires de phosphate d’ammonium dibasique et 0,1 molaire de pH trisapseal de 8,5.Pour optimiser la condition initiale, utilisez un logiciel pour calculer les volumes et le schéma de pipetage afin d’obtenir deux millilitres de chaque condition qui permet 10 écrans d’optimisation. Les conditions comprennent 1,8 à 2,55 molaires de phosphate d’ammonium dibasique par pas de 0,15 molaire ainsi que 0,1 molaire de pH trisapseal de 7,5 à 9,0 par pas de 0,5 unité de pH. Préparez un écran en grille comprenant 24 conditions à partir de solutions mères.Utilisez le schéma de pipetage pour composer les conditions individuelles. Pipetez 200 microlitres de chaque solution de tamisage de grille dans les puits d’une plaque de 24 puits et équilibrez la plaque à 20 degrés Celsius. Réglez manuellement la plaque de cristallisation.Utilisez un volume de goutte de trois microlitres et un rapport protéines/réservoir de 2:1, 1,5:1:5 et 1:2. Ici, utilisez une pipette à déplacement positif pour éviter la formation de bulles d’air. Scellez immédiatement la plaque.Placez ensuite l’assiette dans une chambre à 20 degrés Celsius. Après un à quatre jours, des cristaux fortement intercalés de rPPEP-1 apparaissent dans les quatre conditions, contenant 2,55 molaires de phosphate d’ammonium dibasique et 0,1 molaire de trisapseal pH de 7,5 à 9,0, tandis qu’aucun cristal ne se forme dans les 20 autres conditions. Effectuez la procédure de micro-ensemencement pour obtenir des monocristaux de rPPEP-1 dans ces conditions.Pour préparer un stock de micrograines, choisissez d’abord un seul cristal intercalé dans l’une des conditions de réussite. Ensuite, transférez 50 microlitres de la liqueur mère respective dans un tube de 1,5 millilitre contenant une petite perle de verre hautement polie et un microlitre de liqueur mère sur la lame du couvercle en verre. À l’aide d’un lubrifiant en nylon monté, pêchez le cristal et transférez-le dans la goutte sur la glissière du couvercle en verre.Transférez ensuite le liquide contenant le cristal dans le tube et faites un vortex à grande vitesse pendant 30 secondes, en vous assurant que la perle de verre tourbillonne. Faites une dilution de 1:1000 du stock de graines dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant le même état fraîchement préparé et remuez soigneusement pendant cinq secondes. Ensuite, retirez le joint de la plaque couvrant les 20 conditions avec des gouttes claires.Pipeter 0,5 microlitre de semence dans les puits. Fermez l’assiette et placez-la dans une chambre à 20 degrés Celsius. Après l’application de cette technique de micro-ensemencement, des monocristaux de haute qualité de diffraction apparaissent plusieurs heures à plusieurs jours après leur installation dans diverses conditions, contenant 1,8 à 2,4 molaires de phosphate d’ammonium et 0,1 molaire de tris pH 7,5 à neuf.Les cristaux atteignent une taille de 100 à 200 microns dans la plus grande dimension. Choisissez la taille optimale de boucle en nylon pour la longueur maximale des cristaux choisis en plaçant la boucle sur le ruban d’étanchéité juste au-dessus du cristal et en faisant la mise au point de haut en bas. L’accès le plus long typique des cristaux de rPPEP-1 est d’environ 100 à 200 microns.Préparez également la cryocondition appropriée. Remplissez les glaces en mousse d’azote liquide. Chargez ensuite la pince à flacon avec un flacon et prérefroidissez-la dans la rosée en mousse de 800 millilitres remplie d’azote liquide.Placez un support de cryocanne marqué d’un identifiant approprié et un manchon cryogénique dans la rosée en mousse de deux litres remplie d’azote liquide. Chargez ensuite la baguette magnétique avec la boucle en nylon montée de la bonne taille. Ensuite, ouvrez le ruban d’étanchéité sur la plaque de cristallisation avec un scalpel bien aiguisé et retirez-le avec une pince.Pipetez un microlitre de cryocondition sur la lame de couverture. Il est particulièrement important de travailler rapidement à cette étape, car l’assèchement du cristal ou le minuscule volume de cryosolution dans la boucle pourrait entraîner des fluctuations de la qualité des cristaux, voire une perte complète de diffraction. Toutes les étapes de manipulation des cristaux doivent être effectuées au stéréomicroscope.Si le cristal colle à la surface en plastique, détachez-le du sol en déformant le plastique environnant avec une aiguille d’acupuncture. Retirez le cristal de la goutte en le pêchant avec la boucle en nylon montée. Transférez rapidement le cristal à la goutte de cryocondition et laissez-le s’équilibrer pendant une seconde.Ensuite, pêchez le cristal hors de la goutte avec la boucle en nylon montée le plus rapidement possible. Plonger immédiatement le cristal récupéré dans de l’azote liquide. Lorsque l’azote liquide autour de la boucle montée cesse de bouillir, placez la boucle dans le flacon.Placez le flacon sur le support de cryocanne. Une fois que le support est chargé de six flacons, placez un manchon cryogénique autour du support. Conservez les cristaux dans un réservoir rempli d’azote liquide jusqu’à utilisation.Pour effectuer la collecte de données, récupérez soigneusement le cristal monté de la cryocanne à l’aide d’une pince et rangez-le dans une feuillette en mousse pour le transport. Déplacez la butée de faisceau et le détecteur en position de stationnement et déplacez la cryobuse vers le haut de quelques millimètres. Montez la base du cryocap sur la tête du goniomètre en retenant la base avec vos doigts tout en retirant rapidement le flacon.Ensuite, remettez la cryobuse et la butée de faisceau en place et centrez le cristal. À tout moment, veillez à ne pas toucher la butée de faisceau ou le détecteur. Procédez à la collecte de l’ensemble de données à 180 degrés avec un angle d’oscillation de 0,1 degré, comme indiqué ici.On voit ici des cristaux de rPPEP-1 fortement intercalés obtenus à partir d’un criblage initial à l’aide de tamis de cristallisation commerciaux dans du citrate de sodium tribasique dihydraté de 1,4, de l’HEPES sodique de 0,1 molaire, un pH de 7,5. On voit ici des cristaux obtenus à partir d’un criblage initial avec 60 % de tacsimate en volume, pH 7,0, 0,1 molaire BIS-TRIS propane, pH 7,0. Des cristaux sont également apparus dans le phosphate d’ammonium dibasique de 2,4 molaires, le tris de 0,1 molaire, le pH de 8,5.Après l’application de la procédure d’optimisation du microensemencement, les monocristaux étaient contenus dans plusieurs conditions, notamment 2,1 molaires de phosphate d’ammonium dibasique, 0,1 molaire de phosphate dibasique, pH 8 et 2,25 molaires de phosphate d’ammonium dibasique, 0,1 molaire de phosphate dibasique, pH 8. Les cristaux montés dans des boucles en nylon ont une taille de 100 à 200 microns et semblent avoir un seul réseau d’après l’inspection microscopique. L’analyse par diffraction des rayons X montre que ces cristaux présentent en effet un seul réseau et diffractent les rayons X à une résolution proche de l’atome.La résolution de la structure cristalline du complexe peptidique du substrat recombinant PPEP-1 donne un aperçu du mode de liaison du substrat PPEP-1. Le peptide de substrat pourrait se diffuser dans le groupe de liaison du substrat PPEP-1 lors de sa confirmation ouverte. Ensuite, lors de la fermeture de la boucle, le substrat interagit avec PPEP-1 via des liaisons hydrogène et le réseau unique de chaînes latérales aliphatiques-aromatiques situé sur la boucle S.Le substrat se lie dans une conformation unique à double pli avec des plis au niveau de la liaison peptidique grésillante et de la liaison peptidique P2 prime à P3 prime. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des cristaux de diffractant de PPEP-1 recombinant pour les études structurales. Des approches similaires peuvent être utilisées avec d’autres protéines, ce qui permet d’obtenir des cristaux fortement intercalés et une température d’incubation et une dilution du stock C encore plus variables.En raison de sa polyvalence et de sa simplicité d’utilisation, cette technique simple doit être essayée dans chaque processus d’optimisation des cristaux.

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