Production, Cristallisation et structure Détermination de C. difficile PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD

L’objectif global de cette procédure est de cultiver efficacement des cristaux de qualité diffraction sur un seul réseau de la protéine recombinante proline proline endopeptidase-1, ou rPPEP-1. Sans cette méthode, rPPEP-1 produit instantanément des cristaux fortement intercalés qui ne conviennent pas à l’analyse par diffraction des rayons X. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de cristaux bien ordonnés et bien diffractant pour la détermination structurale de rPPEP-1 peut être produit dans un court laps de temps et avec un apport limité de matière.

Cette procédure utilise la méthode des microcités et peut être adaptée à toutes les conditions de cristallisation initiale réussies du rPPEP-1 ainsi que de ses complexes peptidiques de substrat. Cette méthode peut être adaptée pour produire des cristaux bien ordonnés de pratiquement toutes les protéines qui produisent des cristaux intercalés. Il peut également être utilisé dans des expériences d’ensemencement croisé, de variance de protéines ou dans des expériences de cocristallisation avec de petites molécules.

La démonstration visuelle de la manipulation des méthodes de cristallisation est cruciale, car même de petites variations peuvent avoir un impact significatif sur la qualité de diffraction des cristaux. Effectuer des essais de cristallisation au format goutte assise à l’aide d’écrans standard disponibles dans le commerce et d’un robot de cristallisation. Tout d’abord, concentrez la protéine purifiée à 12 milligrammes par millilitre à l’aide d’un appareil d’ultrafiltration centrifuge à des intervalles de cinq minutes à 4000 fois g et quatre degrés Celsius.

Mélangez les protéines après chaque intervalle pour éviter les précipitations et l’aggravation. Déterminez la concentration en protéines à 280 nanomètres en utilisant le coefficient d’extinction de 25,900 par centimètre molaire. Après avoir équilibré la protéine à 20 degrés Celsius, éliminez toutes les particules et la poussière par centrifugation pendant 10 minutes à 16000 fois g et 20 degrés Celsius.

Pour réaliser des écrans de cristal, utilisez des plaques de cristallisation préremplies scellées et stockées à quatre degrés Celsius. Lors de la mise en place d’essais, travaillez rapidement, car les petits volumes sèchent rapidement. Utilisez également une chambre d’humidité autour de la station d’accueil du robot si possible.

Après avoir équilibré toutes les plaques de cristallisation à 20 degrés Celsius, installez le tamis en pipetant le réservoir d’entl de protéines dans deux à quatre sous-puits. Utilisez un volume de goutte de 300 nanolitres. Utilisez des rapports protéines/réservoir de 200:100 pour le sous-puits deux, de 150:150 pour le sous-puits trois et de 100:200 pour le sous-puits quatre.

Fermez immédiatement la plaque et placez-la dans une chambre à 20 degrés Celsius. Inspectez les plateaux après l’installation tous les jours pendant la première semaine, puis effectuez une inspection hebdomadaire. Pour une cocristallisation des complexes peptidiques de substrat rPPEP-1, mélanger rPPEP-1 à 24 milligrammes par millilitre dans un rapport de 1:1 avec un excès molaire de sept fois plus de solution peptidique de poudre lyophilisée solubilisée dans une solution saline tamponnée tris.

Après une incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius, éliminez toutes les particules et poussières par centrifugation pendant 10 minutes à 16000 fois g et 20 degrés Celsius. Procéder à la cristallisation en utilisant la même procédure de micro-ensemencement que pour la protéine rPPEP-1 non liée. Des cristaux fortement intercalés de rPPEP-1 sont apparus après deux jours dans un état contenant 2,4 molaires de phosphate d’ammonium dibasique et 0,1 molaire de pH trisapseal de 8,5.

Pour optimiser la condition initiale, utilisez un logiciel pour calculer les volumes et le schéma de pipetage afin d’obtenir deux millilitres de chaque condition qui permet 10 écrans d’optimisation. Les conditions comprennent 1,8 à 2,55 molaires de phosphate d’ammonium dibasique par pas de 0,15 molaire ainsi que 0,1 molaire de pH trisapseal de 7,5 à 9,0 par pas de 0,5 unité de pH. Préparez un écran en grille comprenant 24 conditions à partir de solutions mères.

Utilisez le schéma de pipetage pour composer les conditions individuelles. Pipetez 200 microlitres de chaque solution de tamisage de grille dans les puits d’une plaque de 24 puits et équilibrez la plaque à 20 degrés Celsius. Réglez manuellement la plaque de cristallisation.

Utilisez un volume de goutte de trois microlitres et un rapport protéines/réservoir de 2:1, 1,5:1:5 et 1:2. Ici, utilisez une pipette à déplacement positif pour éviter la formation de bulles d’air. Scellez immédiatement la plaque.

Placez ensuite l’assiette dans une chambre à 20 degrés Celsius. Après un à quatre jours, des cristaux fortement intercalés de rPPEP-1 apparaissent dans les quatre conditions, contenant 2,55 molaires de phosphate d’ammonium dibasique et 0,1 molaire de trisapseal pH de 7,5 à 9,0, tandis qu’aucun cristal ne se forme dans les 20 autres conditions. Effectuez la procédure de micro-ensemencement pour obtenir des monocristaux de rPPEP-1 dans ces conditions.

Pour préparer un stock de micrograines, choisissez d’abord un seul cristal intercalé dans l’une des conditions de réussite. Ensuite, transférez 50 microlitres de la liqueur mère respective dans un tube de 1,5 millilitre contenant une petite perle de verre hautement polie et un microlitre de liqueur mère sur la lame du couvercle en verre. À l’aide d’un lubrifiant en nylon monté, pêchez le cristal et transférez-le dans la goutte sur la glissière du couvercle en verre.

Transférez ensuite le liquide contenant le cristal dans le tube et faites un vortex à grande vitesse pendant 30 secondes, en vous assurant que la perle de verre tourbillonne. Faites une dilution de 1:1000 du stock de graines dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant le même état fraîchement préparé et remuez soigneusement pendant cinq secondes. Ensuite, retirez le joint de la plaque couvrant les 20 conditions avec des gouttes claires.

Pipeter 0,5 microlitre de semence dans les puits. Fermez l’assiette et placez-la dans une chambre à 20 degrés Celsius. Après l’application de cette technique de micro-ensemencement, des monocristaux de haute qualité de diffraction apparaissent plusieurs heures à plusieurs jours après leur installation dans diverses conditions, contenant 1,8 à 2,4 molaires de phosphate d’ammonium et 0,1 molaire de tris pH 7,5 à neuf.

Les cristaux atteignent une taille de 100 à 200 microns dans la plus grande dimension. Choisissez la taille optimale de boucle en nylon pour la longueur maximale des cristaux choisis en plaçant la boucle sur le ruban d’étanchéité juste au-dessus du cristal et en faisant la mise au point de haut en bas. L’accès le plus long typique des cristaux de rPPEP-1 est d’environ 100 à 200 microns.

Préparez également la cryocondition appropriée. Remplissez les glaces en mousse d’azote liquide. Chargez ensuite la pince à flacon avec un flacon et prérefroidissez-la dans la rosée en mousse de 800 millilitres remplie d’azote liquide.

Placez un support de cryocanne marqué d’un identifiant approprié et un manchon cryogénique dans la rosée en mousse de deux litres remplie d’azote liquide. Chargez ensuite la baguette magnétique avec la boucle en nylon montée de la bonne taille. Ensuite, ouvrez le ruban d’étanchéité sur la plaque de cristallisation avec un scalpel bien aiguisé et retirez-le avec une pince.

Pipetez un microlitre de cryocondition sur la lame de couverture. Il est particulièrement important de travailler rapidement à cette étape, car l’assèchement du cristal ou le minuscule volume de cryosolution dans la boucle pourrait entraîner des fluctuations de la qualité des cristaux, voire une perte complète de diffraction. Toutes les étapes de manipulation des cristaux doivent être effectuées au stéréomicroscope.

Si le cristal colle à la surface en plastique, détachez-le du sol en déformant le plastique environnant avec une aiguille d’acupuncture. Retirez le cristal de la goutte en le pêchant avec la boucle en nylon montée. Transférez rapidement le cristal à la goutte de cryocondition et laissez-le s’équilibrer pendant une seconde.

Ensuite, pêchez le cristal hors de la goutte avec la boucle en nylon montée le plus rapidement possible. Plonger immédiatement le cristal récupéré dans de l’azote liquide. Lorsque l’azote liquide autour de la boucle montée cesse de bouillir, placez la boucle dans le flacon.

Placez le flacon sur le support de cryocanne. Une fois que le support est chargé de six flacons, placez un manchon cryogénique autour du support. Conservez les cristaux dans un réservoir rempli d’azote liquide jusqu’à utilisation.

Pour effectuer la collecte de données, récupérez soigneusement le cristal monté de la cryocanne à l’aide d’une pince et rangez-le dans une feuillette en mousse pour le transport. Déplacez la butée de faisceau et le détecteur en position de stationnement et déplacez la cryobuse vers le haut de quelques millimètres. Montez la base du cryocap sur la tête du goniomètre en retenant la base avec vos doigts tout en retirant rapidement le flacon.

Ensuite, remettez la cryobuse et la butée de faisceau en place et centrez le cristal. À tout moment, veillez à ne pas toucher la butée de faisceau ou le détecteur. Procédez à la collecte de l’ensemble de données à 180 degrés avec un angle d’oscillation de 0,1 degré, comme indiqué ici.

On voit ici des cristaux de rPPEP-1 fortement intercalés obtenus à partir d’un criblage initial à l’aide de tamis de cristallisation commerciaux dans du citrate de sodium tribasique dihydraté de 1,4, de l’HEPES sodique de 0,1 molaire, un pH de 7,5. On voit ici des cristaux obtenus à partir d’un criblage initial avec 60 % de tacsimate en volume, pH 7,0, 0,1 molaire BIS-TRIS propane, pH 7,0. Des cristaux sont également apparus dans le phosphate d’ammonium dibasique de 2,4 molaires, le tris de 0,1 molaire, le pH de 8,5.

Après l’application de la procédure d’optimisation du microensemencement, les monocristaux étaient contenus dans plusieurs conditions, notamment 2,1 molaires de phosphate d’ammonium dibasique, 0,1 molaire de phosphate dibasique, pH 8 et 2,25 molaires de phosphate d’ammonium dibasique, 0,1 molaire de phosphate dibasique, pH 8. Les cristaux montés dans des boucles en nylon ont une taille de 100 à 200 microns et semblent avoir un seul réseau d’après l’inspection microscopique. L’analyse par diffraction des rayons X montre que ces cristaux présentent en effet un seul réseau et diffractent les rayons X à une résolution proche de l’atome.

La résolution de la structure cristalline du complexe peptidique du substrat recombinant PPEP-1 donne un aperçu du mode de liaison du substrat PPEP-1. Le peptide de substrat pourrait se diffuser dans le groupe de liaison du substrat PPEP-1 lors de sa confirmation ouverte. Ensuite, lors de la fermeture de la boucle, le substrat interagit avec PPEP-1 via des liaisons hydrogène et le réseau unique de chaînes latérales aliphatiques-aromatiques situé sur la boucle S.

Le substrat se lie dans une conformation unique à double pli avec des plis au niveau de la liaison peptidique grésillante et de la liaison peptidique P2 prime à P3 prime. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des cristaux de diffractant de PPEP-1 recombinant pour les études structurales. Des approches similaires peuvent être utilisées avec d’autres protéines, ce qui permet d’obtenir des cristaux fortement intercalés et une température d’incubation et une dilution du stock C encore plus variables.

En raison de sa polyvalence et de sa simplicité d’utilisation, cette technique simple doit être essayée dans chaque processus d’optimisation des cristaux.