Name: Production, Cristallisation et structure Détermination de C. difficile PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez la méthode de microseeding pour cristalliser PPEP-1 de Clostridium difficile et obtenir des cristaux de haute qualité pour la diffraction aux rayons X. Cette technique améliore l'étude structurale des protéines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions le personnel du X06DA de ligne de lumière à la Source de Lumière Suisse, Paul-Scherrer Institut, Villigen, en Suisse pour le soutien lors de la collecte de données de synchrotron. Nous sommes reconnaissants à Monika Gompert pour un excellent support technique. Le projet a été soutenu par l&#39;Université de Cologne et accorder INST 216 / 682-1 FUGG du Conseil de recherche allemand. Une bourse de doctorat de la Graduate School internationale en santé et développement des maladies à CP est reconnu. Les recherches menant à ces résultats ont reçu un financement du septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de la convention de subvention n ° 283570 (BioSTRUCT-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cristallographie aux rayons X est encore la méthode la plus rapide et la plus précise pour déterminer trois dimensions des structures de résolution quasi atomique de protéines 28. Cependant, il nécessite la croissance de monocristaux bien ordonnées. Ceux-ci sont souvent difficiles à obtenir et l&#39;état cristallin est artificiel. Toutefois, une comparaison des structures protéiques déterminées par cristallographie aux rayons X avec celles déterminées par d&#39;autres méthodes, en particulier RMN, montre géné...

Clostridium difficile est l&#39; une des principales causes de diarrhées infections associées aux antibiotiques nosocomiales 1. Cette bactérie anaérobie à Gram positif est transmis par sa forme de spores par voie fécale-orale. Dans la dernière décennie, le nouveau &#39;&#39; épidémie &#39;&#39; ou &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; souches (par exemple BI / NAP1 / 027) a provoqué une augmentation drastique des nouvelles infections et des taux de mortalité en Amérique du Nord et en Europe 2. C. maladie -Associated difficile (DACD) est un danger pour la vie du côlon inflammation avec des taux de létalité élevés 3. Les symptômes vont de la diarrhée 4 à la colite pseudomembraneuse 5 et le mégacôlon toxique souvent mortelle 6. Le traitement de la DACD est difficile , car les souches virulentes sont multirésistante et le taux de récidive est élevé 7. A la thérapie de couple comprend le métronidazole antibiotiques, fidaxomicine ou vancomycine, ou repetiticas récurrents de transplantation fécale vement du microbiote. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires d&#39; urgence 8. Certains progrès sont enregistrés en tant que thérapeutique anticorps monoclonal Bezlotoxumab, ciblant la toxine C. difficile B 9, a récemment passé avec succès la phase III des essais cliniques et a été soumis à l&#39; approbation de la FDA et de l&#39; EMA. En outre, les nouveaux antibiotiques sont testées à l&#39;heure actuelle à différents stades d&#39;essais cliniques 10. Pour développer un traitement efficace de nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiés. Récemment découvert C. protease difficile endopeptidase-1 proline-proline (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; CE 3.4.24.89) est une cible prometteuse, comme le manque de PPEP-1 dans une souche de knock-out diminue la virulence de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 sécrété est une métalloprotéase 12,13 cliver deux adhésines de C. difficile à leur extrémité C-terminale 13 libérant ainsi l&#39;adhérence bacterentre autres de l&#39;épithélium de l&#39;intestin humain. Par conséquent, il est impliqué dans le maintien de l&#39;équilibre entre le phénotype et sessiles motiles de C. difficile. Pour développer des inhibiteurs sélectifs contre PPEP-1 et de comprendre comment il reconnaît ses substrats connaissance intime de sa structure tridimensionnelle est indispensable. Nous avons résolu la première structure cristalline de PPEP-1 seul ou en complexe avec un peptide substrat 14. PPEP-1 est la première protéase connue qui clive sélectivement les liaisons peptidiques entre les deux résidus de proline 15. Elle lie le substrat d&#39;une manière double entortillé et stabilise via un réseau étendu aliphatique-aromatique de résidus situés dans le S-boucle qui couvre le site actif de la protéase 14. Ce mode de liaison au substrat est unique à PPEP-1 et ne trouve pas dans les protéases humaines à ce jour. Cela en fait une cible de médicament prometteur, et les effets hors-cible des inhibiteurs très improbables. Pour développer et écran sélective PPEP-1 inhibitors à l&#39;avenir, une grande quantité de pur et monodisperse PPEP-1 protéine est nécessaire. En outre, pour déterminer le mode de liaison des premiers inhibiteurs, des structures co-cristallines avec PPEP-1 devra être déterminée. Dans nos mains PPEP-1 produit constamment cristaux enchevêtrés. Ainsi, nous avons mis au point une procédure d&#39;optimisation pour produire des cristaux simples Diffraction qualité de PPEP-1. Dans ce protocole , nous décrivons en détail la solution de PPEP-1 14 production, la purification, la cristallisation et de la structure. Nous utilisons l&#39; expression intracellulaire dans Escherichia coli d&#39;une variante PPEP-1 dépourvu de la séquence signal de sécrétion, une Chromatographie d&#39; affinité et Chromatographie d&#39;exclusion de taille avec l&#39; enlèvement de l&#39;étiquette de purification, suivie microseeding 16 dans un écran d&#39;optimisation et la détermination de la structure par l&#39; intermédiaire du zinc longueur d&#39; onde unique dispersion anormale (zinc-SAD) 17. Ce protocole peut être adapté pour la production et la détermination de la structure d&#39;autres protéines (par exemple &lt;/ Em&gt; métalloprotéases) et en particulier pour les protéines produisant des cristaux enchevêtrés. Sur demande, l&#39;ADN plasmidique de la construction (pET28a-NHis-rPPEP-1) Les données de diffraction et peut être fourni à des fins éducatives.

<table><tbody><tr><td>Vecteur Genes / Vecteurs / Souches cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Clivage de la thrombine N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli souche BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficient</td></tr><tr><td>Codon Gene (for E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>acides aminés personnalisés</td><td>27-220</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>n’importe quel</td> Tryptone n’importe quel <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimousse B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>émulsion aqueuse-silicone</td></tr><tr><td>Agar</td><td>n’importe quelle</td> Kanamycine n’importe quelle <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Grade</td></tr><tr><td>tampon NaCl</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>Grade</td></tr><tr><td>tampon DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Grade tampon</td></tr><tr><td>Thrombine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate d’ammonium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol 100 %</td><td></td><td></td> toute <td>qualité la plus pure</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquide azote</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour le stockage et le cryorefroidissement des cristaux</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment (general)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>fournissant des températures de 20 &deg ; C - 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Verrerie</td><td>tout</td><td></td><td>Erlenmeyer à chicanes Flacons (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour grands volumes de culture</td><td>toute</td><td></td><td>centrifugeuse pour le traitement de volumes jusqu’à 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>ou tout autre sonicateur / perturbateur de cellules</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>toute</td><td></td><td>centrifugeuse offrant des vitesses allant jusqu’à 150 000 x g</td></tr><tr><td>Résine NiNTA Superflow</td>, <td>Qiagen,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre vide, Econo-Column</td>, <td>Bio-Rad</td>, <td>7371007</td><td>ou toute autre colonne vide en verre ou en plastique</td></tr>, <tr><td>Colonne de chromatographie d’exclusion stérique, HiLoad, Superdex 200, 16/600</td>, <td>GE, Healthcare</td>, <td></td> 28989335 <td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie & Auml ; kta Purificateur</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>ou tout autre système de chromatographie</td></tr><tr><td>Tubes de dialyse Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Fermetures de tubes de dialyse</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td>Unités d’ultrafiltration</tr><tr><td>(concentrateurs) 10 000 NWCO</td><td>tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spectrophotomètre UV-Vis</td><td>tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment (cristallographie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette à faible volume 0.1-10 &micro ; l</td><td>toute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette à déplacement positif Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>robot de cristallisation</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaque de cristallisation à 96 puits, TTP IQ à trois puits de protéines,</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>ou toute autre plaque de cristallisation à 96 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>24 puits CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité cristallin</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture en verre siliconé</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Écrans de cristallisation commerciaux : SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>écrans de cristallisation commerciaux : Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (boucles en nylon)</td><td>Hampton Research</td><td>diverses</td><td>tailles de boucles 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Mousse cryogénique Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Mousse cryogénique Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Pince à flacons, droite</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand magnétique, droite</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Porte-flacons</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Codeur couleur - Blanc</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropince droite</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour la manipulation du ruban d’étanchéité. etc.</td></tr><tr><td>Aiguille d’acupuncture</td><td>n’importe lequel</td><td></td><td>par exemple d’une pharmacie</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour l’inspection des plaques de cristallisation et le montage des cristaux, grossissement jusqu’à 160X</td></tr></tbody></table>

production, cristallisation et structure détermination de<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 via microseeding et zinc-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

De nouvelles thérapies sont nécessaires pour traiter les infections à Clostridium difficile qui constituent une menace majeure pour la santé humaine. La métalloprotéase PPEP-1 de C. difficile est une cible pour le développement futur d’inhibiteurs visant à réduire la virulence de l’agent pathogène. Pour effectuer une caractérisation biophysique et structurale ainsi qu’un criblage d’inhibiteurs, de grandes quantités de protéines pures et actives seront nécessaires. Nous avons mis au point un protocole pour une production et une purification efficaces de PPEP-1 par l’utilisation d’E. coli comme hôte d’expression, produisant des quantités suffisantes et une pureté de protéines suffisantes pour la cristallisation et la détermination de la structure. De plus, en utilisant le microensemencement, des cristaux fortement intercalés de PPEP-1 peuvent être cultivés en cristaux bien ordonnés adaptés à l’analyse par diffraction des rayons X. Les méthodes pourraient également être utilisées pour produire d’autres protéines recombinantes et pour étudier les structures d’autres protéines produisant des cristaux intercalés.

rPPEP-1 est surexprimé dans plusieurs souches de E. coli, avec le rendement le plus élevé dans E. coli BL21 (DE3) étoile (figure 1C). Après la première étape de Chromatographie d&#39;affinité 6xHis-NiNTA le marqueur peut être clivé avec succès à partir de la plupart de la protéine et dans la deuxième étape NiNTA protéine non digérée peut être complètement séparée de la thrombine digérée par la protéine (figure 1D). Sur un S200 16/600 co...

La proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) est une métalloprotéase sécrétée et une cible médicamenteuse prometteuse de l’agent pathogène humain Clostridium difficile. Nous décrivons ici toutes les méthodes nécessaires à la production et à la détermination de la structure de cette protéine.

Production, Cristallisation et structure Détermination de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver efficacement des cristaux de qualité diffraction sur un seul réseau de la protéine recombinante proline proline endopeptidase-1, ou rPPEP-1. Sans cette méthode, rPPEP-1 produit instantanément des cristaux fortement intercalés qui ne conviennent pas à l’analyse par diffraction des rayons X. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de cristaux bien ordonnés et bien diffractant pour la détermination structurale de rPPEP-1 peut être produit dans un court laps de temps et avec un apport limité de matière.Cette procédure utilise la méthode des microcités et peut être adaptée à toutes les conditions de cristallisation initiale réussies du rPPEP-1 ainsi que de ses complexes peptidiques de substrat. Cette méthode peut être adaptée pour produire des cristaux bien ordonnés de pratiquement toutes les protéines qui produisent des cristaux intercalés. Il peut également être utilisé dans des expériences d’ensemencement croisé, de variance de protéines ou dans des expériences de cocristallisation avec de petites molécules.La démonstration visuelle de la manipulation des méthodes de cristallisation est cruciale, car même de

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

Structure basée sur la conception de médicaments joue un rôle important dans le développement de médicaments. La poursuite des cibles multiples en parallèle augmente considérablement les chances de succès pour la découverte de plomb. L'article qui suit met en évidence la façon dont le Centre de génomique structurelle Seattle pour maladies infectieuses utilise une approche multi-cible pour la détermination gène à la structure de la grippe A de sous-unité PB2.

Multi-cible approche de traitement parallèle pour Gene à la structure Détermination de la polymérase de l&#39;influenza PB2 Subunit

Source : Figueroa, D. M., et.al. Production et visualisation de sphéroplastes et protoplastes bactériens pour caractériser la localisation des peptides antimicrobiens. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre la production de sphéroplastes d’Escherichia coli en inhibant d’abord la division cellulaire pour induire la filamentation, suivie d’une digestion enzymatique de la paroi cellulaire. Le processus comprend l’ajout contrôlé d’un agent chélateur, la DNase, et d’un stabilisateur osmotique pour...

Préparation des sphéroplastes d’E. coli

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l'obtention de matériel d'étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l'analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d'autres applications analytiques.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

β protéines de membrane externe (OMP) remplissent de nombreuses fonctions au sein des membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries et des chloroplastes. Ici, nous espérons pallier un goulot d’étranglement connu dans les études structurales en présentant des protocoles pour la production d’OMP à β-baril en quantités suffisantes pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou spectroscopie RMN.

De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

Un protocole simplifié permettant d’effectuer une caractérisation biochimique et structurelle vaste une protéine de liaison du substrat glucidique de Streptococcus pneumoniae est présenté.

Caractérisation biochimique et structurelle de l’hydrate de carbone Transport substrat-GRB2 SP0092

Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.

Production et la visualisation des sphéroplastes bactériennes et de protoplastes de caractériser Peptide antimicrobien localisation

Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l'expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050H60A H307A variante.

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Un dispositif microfluidique polyvalent est décrit qui permet la cristallisation d’une enzyme en utilisant la méthode de contre-diffusion, l’introduction d’un substrat dans les cristaux par trempage, et la détermination de la structure 3D de l’enzyme: substrat complexe par une analyse en série des cristaux à l’intérieur de la puce à température ambiante.

Cristallisation et détermination structurale d’une enzyme : complexe de substrat par cristallographie sérielle dans une puce microfluidique polyvalente

La détermination de la structure des complexes macromoléculaires à l’aide de cryoEM est devenue une routine pour certaines classes de protéines et de complexes. Ici, ce pipeline est résumé (préparation des échantillons, criblage, acquisition et traitement des données) et les lecteurs sont dirigés vers des ressources et des variables plus détaillées qui peuvent être modifiées dans le cas d’échantillons plus difficiles.

Cryo-microscopie électronique à particule unique : de l’échantillon à la structure

Découvrez la méthode de microseeding pour cristalliser PPEP-1 de Clostridium difficile et obtenir des cristaux de haute qualité pour la diffraction aux rayons X. Cette technique améliore l'étude structurale des protéines.

Production, Cristallisation et structure Détermination de

Explorer plus de vidéos