Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l'identification des médicaments immunomodulateurs

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la puissance des médicaments immunomodulateurs à l’aide d’un compteur de cellules automatisé en mesurant la blastogenèse des lymphocytes T ou la transformation blastique. Ce test fournit une méthode rapide pour quantifier l’activation des lymphocytes T à l’aide d’un compteur de cellules automatisé équipé pour mesurer les diamètres des cellules. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une mesure rapide, simple et directe à partir de cellules uniques, contrairement aux tests courants de prolifération des lymphocytes T.

Le traitement des lymphocytes avec des médicaments immunomodulateurs augmentera ou diminuera le taux et l’étendue de la blastogenèse cellulaire. À l’aide du dosage par compteur cellulaire, l’étendue de cette blastogenèse peut être mesurée en environ quatre minutes par échantillon. Dans les dix minutes suivant le sacrifice, vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux pour faire une incision dans la fourrure et la peau du côté gauche de l’animal.

Tenez la peau écartée et reculée pour révéler le péritoine. Appliquez ensuite une chlorhexidine à quatre pour cent sur le site d’incision. À l’aide d’une deuxième paire de ciseaux et de pinces, faites une coupe de deux à trois centimètres le long de l’abdomen central pour ouvrir le péritoine.

Ensuite, retirez les attaches viscérales et l’excès de graisse entourant la rate et transférez le tissu dans un récipient de DPBS. Ensuite, ajoutez dix millilitres de milieu RPMI 1640 complet dans une boîte de culture de dix centimètres et écrasez les rates entre deux lames de verre dépoli stérilisé. Filtrez la boue tissulaire à travers une passoire stérile en nylon de 40 microns dans une nouvelle boîte de culture de dix centimètres pour éliminer les tissus conjonctifs et les débris et transférez la suspension unicellulaire dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans 20 millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Après dix minutes à température ambiante avec un léger balancement, récupérez les cellules avec une autre centrifugation et remettez en suspension le granulé dans dix millilitres de milieu frais. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules pour les remettre en suspension dans deux millilitres de milieu complet à 37 degrés Celsius.

Pour purifier les lymphocytes T, lavez d’abord une à deux colonnes de laine de nylon par rate deux fois avec cinq millilitres de RPMI complet et placez les colonnes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une heure. À la fin de l’incubation, chargez deux millilitres de suspension de splénocytes isolés sur le dessus de chaque colonne et laissez les cellules passer à travers la colonne jusqu’à ce que le liquide atteigne le haut de la laine. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu complet frais à 37 degrés Celsius en haut des colonnes et laissez le milieu passer à travers la laine de nylon jusqu’à ce que le liquide au sommet de la colonne atteigne le haut de la laine.

Couvrez maintenant la laine avec trois millilitres de milieu complet à 37 degrés Celsius et retournez la colonne dans l’incubateur de culture cellulaire pour que tous les lymphocytes B, fibroblastes et cellules accessoires adhèrent aux fibres de laine. Au bout d’une heure, dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, lavez la colonne deux fois avec cinq millilitres de milieu complet frais pour éluer les lymphocytes T non adhérents. Récupérez ensuite les cellules par centrifugation.

Après avoir lavé les cellules T une fois avec dix millilitres de milieu complet, remettez le granulé en suspension dans deux millilitres de milieu complet frais. Ensuite, comptez les cellules et diluez la suspension à une concentration de 0,5 fois dix à six cellules par millilitre dans un milieu complet frais pour l’ensemencement dans une plaque de culture cellulaire à six ou 24 puits, selon le niveau expérimental. Dans les 24 heures suivant leur isolement, activez la colonne de laine de nylon isolant les lymphocytes T avec le stimulus approprié et le médicament expérimental d’intérêt.

Après 12 à 72 heures, utilisez une pipette d’un millilitre pour mélanger doucement les cellules traitées activées afin d’éliminer les grumeaux. Pour mesurer les diamètres des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, transférez un millilitre de cellules traitées de chaque puits dans des godets d’échantillon individuels et placez les godets d’échantillon dans le carrousel d’échantillons du compteur de cellules automatisé. Entrez l’ID de l’échantillon et les informations de type de cellule pour enregistrer les échantillons et commencer à les exécuter.

Après avoir mélangé le bleu de trypan avec la suspension cellulaire, les cellules sont passées sur un champ d’imagerie jusqu’à ce qu’environ 100 images cellulaires soient collectées à partir de chaque échantillon. Le logiciel dessine un cercle autour de chaque cellule colorée au bleu trypan et non colorée détectée pour déterminer le diamètre de la cellule. Lorsque toutes les cellules ont été mesurées, les données sont exportées vers une feuille de calcul qui affiche les résultats sous forme de nombre total et viable de cellules pour chaque diamètre mesuré.

Les données peuvent ensuite être présentées sous forme d’histogrammes. Après deux jours de stimulation par PMA et ionomycine, on observe un décalage significatif de la médiane de la distribution de fréquence vers des diamètres de cellules plus grands, le nombre de cellules T de plus petit diamètre étant réduit en conséquence. À une concentration fixe de 250 nanomolaires d’ionomycine, l’effet PMA n’est pas modifié de manière significative en augmentant la concentration du stimulus d’activation de deux à 250 nanogrammes par millilitre.

Il n’y a pas non plus de différence appréciable dans la prolifération des lymphocytes T observée. Les inhibiteurs de la calcineurine suppriment partiellement la blastogenèse et la prolifération des lymphocytes T. Le traitement par lymphocytes T avec des composés immunosuppresseurs qui ciblent le facteur nucléaire calcineurine des lymphocytes T activés inhibe la réponse blastogénique de près de 72 %.

La rapamycine et le FTY720 présentent des effets modérés mais statistiquement significatifs sur la blastogenèse. Alors que TRAM34 n’affecte apparemment pas la prolifération des lymphocytes T murins, même à des concentrations nanomolaires de 700. Lorsque la rapamycine et la cyclosporine A sont utilisées ensemble, la blastogénèse est complètement inhibée.

Des résultats similaires sont observés avec des lymphocytes T murins activés par des billes magnétiques conjuguées anti-CD3 et anti-CD28. Ce test peut être utilisé pour quantifier avec succès les effets de divers médicaments immunomodulateurs, ce qui permet une meilleure évaluation de la puissance du médicament par rapport aux tests de prolifération typiques qui incluent également les contributions des cellules apoptotiques et nécrotiques. Avec cette méthode, jusqu’à 15 échantillons peuvent être mesurés à l’entrée et à la sortie, ce qui permet de quantifier simultanément et ultérieurement les taux de blastogenèse et de prolifération.

Parfois, des bulles d’air peuvent pénétrer dans la cellule d’écoulement, rendant la mesure inutilisable, par conséquent, toutes les images doivent être examinées pour détecter la présence de bulles d’air avant que les données de chaque essai ne soient acceptées pour analyse. L’une des limites de cette procédure est que s’il y a trop de débris dans l’échantillon, la mesure peut traiter les débris comme des cellules viables. Avec les modifications appropriées, ce test a le potentiel d’être adapté à l’étude de la variation de la taille des cellules dans les neutrophiles et les hépatocytes.