Name: Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et In Situ Proximité Ligation Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez la co-immunoprécipitation et le test de ligation de proximité pour visualiser les interactions protéine-protéine dans les fractions nucléaire et cytoplasmique. Ces méthodes complémentaires permettent d'étudier les interactions NF90-RBM3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (FNS, 31003A_163305).

1. Co-immunoprécipitation <ol><li> Seed HEK293 cellules à 2 x 10 5 cellules par puits dans une plaque à 6 puits dans 2 ml Eagle modifié (DMEM) le supplément de Dulbecco avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep) . </li><li> Cultiver les cellules pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate froide (PBS) à trois reprises. cellules de récolte par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Préparer des fractions nucléaires et cytoplasmiques en utilisant des réactifs commerciaux d&#39;extraction nucléaire et cytoplasmique. Suivez les instructions du fabricant, avec quelques modifications. <ol><li> En utilisant 3 x 10 6 cellules pour une expérience de co-immunoprécipitation (avec environ 90% de confluence de 3 puits d&#39;une plaque à 6 puits). Ajouter 300 ul solution froide cytoplasmique d&#39;extraction (CER I) et vortex pendant 15 secondes à la vitesse maximale. </li><li> Incuber pendant 30 min sur la glace. Pendant l&#39;incubation, Vortex pour toutes les 10 min 5. </li><li> Ajouter 16,5 ul froid extraction cytoplasmique solution II (CER II), vortex pendant 5 secondes et incuber pendant 5 min sur la glace. </li><li> Vortex pendant 5 secondes et centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant (extrait cytoplasmique) dans un nouveau tube pré-réfrigéré, et garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Laver culots insolubles (contenant des noyaux) trois fois avec PBS 1 ml à froid à chaque fois par pipetage de haut en bas cinq fois. Retirer PBS après lavage. </li><li> Ajouter 150 ul solution d&#39;extraction à froid nucléaire (NER), vortex pendant 15 secondes et incuber 1 h sur la glace. Pendant l&#39;incubation, vortex pendant 15 secondes et la pipette 10 fois avec une pointe de 200 pi toutes les 10 min. </li><li> Vortex pendant 15 s et centrifuger à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant (extrait nucléaire) dans un nouveau tube pré-réfrigéré, garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Sortir 10% du volume des extraits nucléaires et cytoplasmiques chacun comme entrées. </li><li> UNEdd PBS froid aux extraits qui restent à un volume final de 1 ml. Gardez sur la glace jusqu&#39;à utilisation. NOTE: Pré-compensation est pas indispensable lors de l&#39;utilisation de protéines des billes magnétiques G-conjugué. Cependant, si le fond est élevé, effectuer le pré-compensation en incubant 40 pi de billes de protéine G-conjugués magnétiques (50% en suspension) et 1 ml dilué lysat provenant de cette étape à 4 ° C pendant 30 min sur un rotateur. surnageant séparée (lysat pré-autorisé) à partir de perles avec support magnétique. Jeter les perles. </li><li> À l&#39;anticorps primaire couple avec des perles magnétiques de protéine G-conjugués, incuber 40 ul de billes de protéine magnétiques G-conjugués (50% en suspension) avec un anticorps 4 ug polyclonal de lapin anti-RBM3 ou de lapin IgG (témoin négatif) dans 200 ul de PBS plus Tween 20 (PBST 0,02% de Tween 20) à température ambiante (TA) pendant 40 min sur un rotateur. </li><li> perles et surnageant séparé anticorps couplé à un support magnétique, et jeter le surnageant. Laver les billes une fois avec 200 ul de PBST (0,02%). </li><li> Ajouter 1ml dilué lysats (ou si nécessaire, des lysats pré-autorisé) aux billes, et incuber sur un agitateur à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Le lendemain, séparer les billes et le surnageant par une grille magnétique, et jeter le surnageant. Laver 3 x 10 minutes avec 0,5 ml de PBST (0,02%) pour chaque tube à 4 ° C sur un agitateur avec une vitesse fixe de 20 tours par minute. </li><li> Éluer des protéines à partir des billes par l&#39;ajout d&#39;un tampon d&#39;échantillon de 40 pi (tampon échantillon commercial 1x et 50 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT)). On chauffe à 70 ° C pendant 10 min. Isoler et les liquides de transfert à un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Diluer les lysats d&#39;entrée dans un tampon d&#39;échantillon (concentration finale: 1 x tampon d&#39;échantillon commercial et DTT 50 mM) et on chauffe à 70 ° C pendant 10 min. entrées de charge et protéines immunoprécipitées de la dernière étape à un 4-12% de gel bis-Tris préfabriqué. Le volume de chargement de chaque puits ne doit pas dépasser 20 pi. Effectuer l&#39;électrophorèse dans un tampon 1x exploitation commerciale sur la glace pendant 35 min. NOTE: Charge nucléaire et extrait cytoplasmiques dans un rapport de 1: 2 (V / V), ce qui reflète la même quantité initiale de cellules. </li><li> Transfert des protéines à membrane PVDF dans un tampon 1x transfert commercial à 30 V pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Membrane de bloc avec 5% de lait écrémé dans du PBST (0,1% de Tween 20) à température ambiante pendant 40 minutes sur un agitateur. </li><li> Incuber la membrane avec des anticorps primaires (tous deux dilués à 1: 1000) dans du PBST (0,1%) à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Laver 3 x 10 min avec du PBST (0,1%) à température ambiante sur un agitateur. </li><li> Incuber la membrane avec la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à des anticorps secondaires anti-souris ou anti-lapin (à la fois dilué dans 1: 5000) dans du PBST (0,1%) à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver 3 x 10 min avec du PBST (0,1%) à température ambiante sur un agitateur. </li><li> Utiliser 0,2 ml chimioluminescence amplifiée (ECL) du mélange de substrat par cm2 de membrane, incuber à température ambiante pendant 5 min. Evitez toute la lumière à partir de cette étape, sauf à compter les feux rouges. </li><li> Jeter liquide et exposer à un film X-ray dans une cassette de film. Développer film à l&#39;aide d&#39;un pr automatique du filmMachine ocessing. </li></ol> 2. Immunocytochimie et Proximité Ligation Assay <ol><li> Semence des cellules HEK293 à 1,5 x 10 4 cellules par chambre dans une chambre 8 de poly-D-lysine lame enduite dans 0,4 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 100 U / ml de Pen-Strep. </li><li> Cultiver les cellules pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Aspirer le milieu, et fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer PFA, et lavage 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre. </li><li> Et perméabiliser les cellules de bloc avec 0,5% de Triton X-100 et 5% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Incuber avec des anticorps primaires de 0,1% de Triton X-100 et 5% de NGS dans du PBS sur un agitateur à 4 ° C pendant la nuit. Diluer monoclonal de souris anti-anticorps et NF90 polyclonal de lapin anti-anticorps RBM3 1: 100 dans du PBS pendant deux taches. Pour le contrôle négatif, omettre indépendamment l&#39;une des deux anticorps primaires, et omettre les deux anticorps dans un troisième contrôle. REMARQUE: Ne pas utiliser le blocage commercial et des réactifs de dilution. </li><li> Laver 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre. </li><li> Sous réserve des protocoles d&#39;essai de ligature immunocytochimie ou de proximité <ol><li> Immunocytochimie <ol><li> Incuber à 1: 500 fluorescent anti-souris couplé au colorant vert dilué et d&#39;anticorps fluorescents rouges de colorant couplé anti-lapin secondaire à température ambiante pendant 1 h. Evitez la lumière de cette étape en avant. </li><li> Counterstain avec des noyaux 4 &#39;, 6-diamidin-2-phénylindole (DAPI) dilué 1: 5000 dans du PBS à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Laver 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre. </li><li> Enlever les chambres de la lame de verre et sec. Monter avec 250 μ, moyenne par diapositive de montage. </li></ol></li><li> essai de ligature de proximité <ol><li> Préparer proximité sondes de dosage de ligature. Mélanger et diluer deux proximité sondes de dosage de ligature (anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin attachés avec différents oligonucléotides qui peut ligaturer through l&#39;ajout de deux autres oligonucléotides en solution de ligature) les deux 1: 5 à 0,1% de Triton X-100 et 5% NGS dans PBS, avec un volume total de 320 pl pour une diapositive 8 chambre (environ 40 pi par cm 2) . Incubation à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Enlever les chambres de la lame de verre et ajouter les sondes diluées. Incuber dans un incubateur humide à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Préparer la solution de ligature. Mélanger 8 pi ligase, 64 pi x 5 ligature stock et 248 ul H 2 O. </li><li> Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 5 min dans 1x Wash Buffer A (fourni avec le kit). </li><li> Ajouter la solution de ligature et on incube dans un incubateur humide à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Préparer une solution d&#39;amplification. Mélanger 4 pl polymerase, 64 pl amplification 5x stock et 252 ul H 2 O. Évitez la lumière de cette étape en avant. </li><li> Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 2 min 1x Wash Buffer A. </li><li> Ajouter l&#39;amplisolution lification et incuber dans un incubateur d&#39;humidité obscurité à 37 ° C pendant 100 minutes. </li><li> Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 10 min dans du 1x Wash Buffer B (fourni avec le kit). Laver pendant 1 min dans 0,01x Wash Buffer B. </li><li> Sécher la lame et monter avec 250 pi d&#39;un milieu de montage commercial (avec DAPI) par diapositive. </li></ol></li></ol></li><li> Examiner les signaux fluorescents sous un microscope en utilisant une lentille d&#39;oculaire 10X et 20X objectif. L&#39;acquisition d&#39;images par une caméra CCD. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il y a plusieurs avantages ainsi que des lacunes pour les deux méthodes. En tant que technique relativement nouvelle, un avantage évident d&#39;essai de ligature de proximité est la possibilité d&#39;élucider les interactions protéine-protéine au niveau d&#39;une seule cellule au lieu d&#39;un lot de cellules hétérogènes. Images à haute intensité et de la résolution (par exemple par microscope confocal) offrent la possibilité pour la quantification par comptage des taches fluorescentes simples. En revanche, la ...

Facteur nucléaire 90 (NF90) est une protéine multi-isoforme avec de nombreuses fonctions , y compris la réponse à l&#39; infection virale, la régulation de l&#39; interleukine-2 post-transcription et la régulation de la biogenèse des miARN 1-3. RBM3 est une protéine de liaison à l&#39; ARN, impliqués dans la traduction et la biogenèse des miARN et peut être induite par divers facteurs de stress , y compris l&#39; hypothermie et l&#39; hypoxie 4-6. Récemment, nous avons trouvé NF90 et RBM3 dans un complexe protéique 7. L&#39;interaction de NF90 et RBM3 est essentiel pour moduler la protéine kinase réticulum endoplasmique kinase (PERK) l&#39; activité de l&#39; ARN comme en réponse de la protéine dépliée 7. Deux NF90 et RBM3 sont situés principalement dans le noyau , mais une faible proportion de NF90 et une navette RBM3 dans le cytoplasme et il se lient les unes aux autres pour des fonctions spécifiques, par exemple pour réguler l&#39; activité PERK. Par conséquent, il est important de visualiser la répartition des interactions NF90-RBM3 dans le compartiment sous-cellulaire, ce qui peut indiquerleurs différents rôles dans le compartiment respectif. Il y a des décennies, deux hybrides de levure (Y2H) a été développé pour détecter l&#39;interaction entre les deux protéines 8. Cependant, en raison de la construction artificielle de protéines fusionnées, des résultats faussement positifs ont restreint l&#39;application de cette méthode. Pendant longtemps, la co-immunoprécipitation a été la principale technique pour analyser les interactions protéine-protéine, en particulier dans des conditions endogènes 9. D&#39;analyser le complexe protéique de co-immunoprécipitation, Western Blot est la technique la plus commode, tandis que la spectrométrie de masse est utilisée lorsque super-sensibilité et la précision sont souhaitées. Au cours des dernières années, un essai de ligature de proximité a été développé comme un nouveau procédé pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules et les tissus in situ 10,11. Ici, nous avons comparé la méthode de co-immunoprécipitation le plus populaire et relativement nouvelle méthode d&#39;essai de ligature de proximité dans la capture NF9l&#39;interaction 0-RBM3 dans les fractions subcellulaires. Nous avons également discuté les avantages et les limites des deux techniques.

<table><tbody><tr><td>L’aigle modifié de Dulbecco s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Glycémie élevée 4 500 mg/L</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Réactifs d’extraction nucléaire et cytoplasmique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110)</td> anticorps <td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>utiliser 1:1 000 pour la WB et 1:100 pour l’ICC/PLA</td></tr><tr><td>L’anticorps RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>utilise 1:1 000 pour la WB et 1:100 pour l’anticorps ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C</td><td>Technologie de</td> <td>signalisation cellulaire#2032</td><td>utilisez 1:1 000 pour WB&nbsp ;</td></tr><tr><td>anticorps anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>utiliser 1:1 000 pour WB&nbsp ;</td></tr><tr><td>IgG de lapin normal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin, anticorps secondaires liés à</td> la <td>HRP Technologie de signalisation cellulaire</td> <td>#7074</td><td>utiliser 1:5 000 pour WB&nbsp ;</td></tr><tr><td>anticorps secondaire HRP anti-souris</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>utiliser 1:5 000 pour WB&nbsp ;</td></tr><tr><td>Substrat de transfert Clarity Western ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampon d’échantillon (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Tampon de fonctionnement (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert NuPAGE (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 Membrane PVDF</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 8 puits Culture Slide</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (anticorps H+L), conjugué Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (anticorps H+L), conjugué Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime ;, 6-Diamidin-2-phénylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Sonde PLA Duolink Anti-souris PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp ; sonde anti-lapin MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Réactifs de détection Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Wash Buffers Fluorescence</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Milieu de montage avec DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>Film radiographique</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Machine de traitement de film</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique fractions par co-immunoprécipitation et<em&gt; in situ</em&gt; proximité ligation assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Les interactions protéine-protéine sont impliquées dans des milliers de processus cellulaires et se produisent dans un contexte spatial distinct. Traditionnellement, la co-immunoprécipitation est une technique populaire pour détecter les interactions protéine-protéine. L’analyse par transfert Western ultérieur est la méthode la plus courante pour visualiser les protéines co-immunoprécipitées. Récemment, le test de ligature de proximité est devenu un outil puissant pour visualiser les interactions protéine-protéine in situ et offre la possibilité de quantifier les interactions protéine-protéine par cette méthode. Semblable à l’immunocytochimie conventionnelle, la technique de ligature de proximité est également basée sur l’accessibilité des anticorps primaires aux antigènes, mais en revanche, la technique de ligature de proximité détecte les interactions protéine-protéine avec une technique unique impliquant la PCR à cercle roulant, tandis que l’immunocytochimie conventionnelle ne montre que la co-localisation des protéines.
Le facteur nucléaire 90 (NF90) et la protéine de motif de liaison à l’ARN 3 (RBM3) ont déjà été démontrés comme partenaires d’interaction. Ils sont principalement localisés dans le noyau, mais migrent également dans le cytoplasme et régulent les voies de signalisation dans le compartiment cytoplasmique. Ici, nous avons comparé l’interaction NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme par co-immunoprécipitation et test de ligature de proximité. De plus, nous avons discuté des avantages et des limites de ces deux techniques dans la visualisation des interactions protéine-protéine en ce qui concerne la distribution spatiale et les propriétés des interactions protéine-protéine.

La figure 1 montre que NF90 et RBM3 sont tous deux des protéines nucléaires et seulement une petite fraction est présente dans le cytoplasme. Notamment, il y a trois bandes différentes colorées positives pour RBM3. Le plus petit peu moins de 20 kDa reflète la taille correcte de RBM3 (le poids moléculaire prédit de RBM3 est de 17 kDa). L&#39;origine des deux autres groupes reste à étudier. Des expériences de co-immunoprécipitation avec RBM3 que la protéine appât a révélé ...

Les interactions protéine-protéine peuvent se produire à la fois dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Pour étudier ces interactions, la co-immunoprécipitation traditionnelle et le test moderne de ligature de proximité sont appliqués. Dans cette étude, nous comparons ces deux méthodes pour visualiser la distribution des interactions NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme.

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

L'objectif général de cette expérience est de comparer les avantages et les inconvénients de la co-immunoprécipitation, ou co-ip, et du dosage par amplification de ligature en proximité, ou pla, dans la visualisation des interactions entre protéines dans différents compartiments cellulaires. La comparaison présentée ici entre deux méthodes différentes peut aider les scientifiques à déterminer laquelle est mieux adaptée à leur objectif spécifique lorsqu'ils étudient les profils de distribution des interactions entre protéines dans le noyau et le cytoplasme d'une cellule. Le principal avantage de la co-ip est de détecter des interactions authentiques entre protéines.En revanche, l'avantage de la PLA est d'analyser les interactions entre protéines au niveau de la cellule unique de manière rapide. Après avoir cultivé et récolté les cellules HEK293 selon le protocole indiqué, ajouter 300 microlitres de solution d'extraction cytoplasmique froide à 3 × 10⁶ cellules, puis vortexer les cellules à la vitesse maximale pendant 15 secondes. Incuber l'extrait sur de la glace pendant 30 minutes et, toutes les 10 minutes durant l'incubation, vortexer l'échantillon pendant cinq secondes.Ensuite, ajouter 16,5 µL de solution froide d'extraction cytoplasmique, faire un vortex pendant cinq secondes, puis incuber l'échantillon sur de la glace pendant cinq minutes. Faire un vortex de l'extrait pendant cinq secondes et centrifuger l'échantillon à 16 000 × g et à 4 °C pendant cinq minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube prérefroidi et le garder sur de la glace jusqu'à utilisation, puis utiliser un millilitre de PBS froid pour laver trois fois les culots insolubles en pipetant plusieurs fois de haut en bas et en éliminant le PBS après chaque lavage.Ensuite, ajoutez 150 microlitres de solution froide d'extraction nucléaire, vortexez pendant 15 secondes, puis incubez sur de la glace pendant une heure. Toutes les 10 minutes pendant l'incubation, vortexez l'échantillon pendant 15 secondes et utilisez une pipette de 200 microlitres pour aspirer et redistribuer la solution 10 fois. Vortexez le tube pendant 15 secondes, puis centrifugez l'échantillon à 16 000 × g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite le surnageant contenant l'extrait nucléaire dans un nouveau tube prérefroidi et conservez-le sur de la glace jusqu'à utilisation.Retirer 10 % du volume des extraits nucléaires et cytoplasmiques respectivement en tant qu'échantillons d'entrée, puis ajouter du PBS froid aux extraits restants pour obtenir un volume final d'un millilitre. Conserver sur glace jusqu'à utilisation. Après une éventuelle étape de pré-élimination des billes magnétiques conjuguées à la protéine G, mélanger 40 microlitres de billes magnétiques conjuguées à la protéine G avec quatre microgrammes d'anticorps polyclonal anti-RBM3 rapide ou avec une IgG rapide utilisée comme témoin négatif, dans 200 microlitres de PBST.Incuber jusqu'à température ambiante sur un agitateur rotatif pendant 40 minutes. Placer les tubes sur un support magnétique, puis éliminer et jeter le surnageant. Ensuite, laver les billes une fois avec 200 microlitres de PBST.Ajoutez un millilitre de lysats dilués aux billes et incubez toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, placez les tubes sur le support magnétique et aspirez le surnageant. Ajoutez 0,5 millilitre de PBST aux billes et lavez-les trois fois sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius, à une vitesse fixe de 20 tr/min pendant 10 minutes.Éluer la protéine à partir des billes en ajoutant 40 microlitres de tampon d'échantillon, puis chauffer l'échantillon à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir centrifugé les billes, transférer le liquide dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour réaliser la chimie immunocytochimique, ensemencer les cellules HEK293 à raison de 1,5 fois 10 à la puissance 4 cellules par chambre dans une lame à huit chambres revêtue de polylysine.Dans 0,4 millilitre de DMEM supplémenté avec 10 % de FPS et 100 unités par millilitre de penstrep. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures, puis aspirer le milieu et utiliser du PFA à 4 % pour fixer les cellules à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte à flux laminaire. Ensuite, aspirer le PFA et utiliser 0,5 millilitre de PBS par chambre pour laver les cellules trois fois.Ajouter 0,5 % de Triton X100 avec 5 % de NGS et du PBS pour perméabiliser et bloquer les cellules, puis incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, après avoir dilué les anticorps primaires monoclonaux anti-NF90 et polyclonaux anti-RBM3 au 1/100, ajouter les anticorps primaires dans les puits et incuber sur agitateur à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, utiliser 0,5 millilitre de PBS pour laver les chambres trois fois, dix minutes à chaque fois.Pour réaliser la chimie immunocytaire, ajoutez une dilution au 1/500 d'anticorps antimouse couplés à un colorant fluorescent vert et d'anticorps antilapin couplés à un colorant fluorescent rouge sur les cellules, puis incubez une heure à température ambiante. Ajoutez une dilution au 1/5 000 de DAPHE NBPS pour contre-colorer les noyaux et incubez 10 minutes à température ambiante, puis lavez les échantillons avec du PBS comme précédemment. Retirez les chambres de la lame de verre et faites-les sécher, avant de les monter en utilisant 250 microlitres de milieu de montage par lame.Pour préparer les sondes d'essai de liaison par proximité en tube, après avoir incubé les cellules et les anticorps primaires, puis lavé comme vient de l'être démontré, diluez les sondes prêtes à l'emploi au 1/5 dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 5 % de NGS, pour un volume total de 320 microlitres par lame à huit chambres. Incubez la solution à température ambiante pendant 20 minutes. Retirez les chambres du support en verre et ajoutez les sondes diluées, puis incubez les chambres dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius pendant une heure.Préparez une solution de ligation en mélangeant huit microlitres de ligase, 64 microlitres de tampon de ligation 5x et 248 microlitres d'eau. Éliminez le liquide en tapotant la lame, puis lavez les échantillons deux fois avec le tampon de lavage A onex, cinq minutes à chaque fois. Ajoutez la solution de ligation aux échantillons et incubez-les dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Préparez la solution d'amplification en mélangeant quatre microlitres de polymérase, 64 microlitres de tampon stock d'amplification 5x et 252 microlitres d'eau, puis enveloppez le tube dans du papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Ensuite, faites tomber le liquide de la lame et lavez les échantillons deux fois avec du tampon de lavage A à 1x, deux minutes à chaque fois. Ajoutez la solution d'amplification aux échantillons et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur sombre et humide pendant 100 minutes.Ensuite, après avoir éliminé le liquide comme précédemment, laver les échantillons deux fois pendant 10 minutes chacun dans le tampon de lavage B, puis les laver une fois dans le tampon de lavage B à 0,1 x. Enfin, sécher la lame et monter les échantillons avec 250 microlitres de milieu de montage commercial contenant du DAPHE, examiner la fluorescence au microscope et acquérir les images à l’aide d’une caméra CCD. Des expériences de co-immunoprécipitation utilisant RBM3 comme protéine appât ont révélé que les interactions NF90-RBM3 sont principalement présentes dans le noyau, tandis qu'une minorité se trouvent dans le cytoplasme. Dans cette expérience d'immunofluorescence, NF90 et RBM3 sont tous deux observés dans le noyau.Les deux protéines se retrouvent également dans le cytoplasme en C2, et les deux protéines présentent une colocalisation parfaite dans chaque compartiment. Comme on le voit sur ces images, le test d'amplification par ligature d'oligonucléotides en proximité a révélé le profil des interactions NF90-RBM3, très similaire à celui de l'immunocytochimie conventionnelle, où la majorité des interactions se situent dans le noyau dans la plupart des cellules. Seule une faible proportion de cellules a montré une distribution principalement cytoplasmique des interactions NF90-RBM3.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que, bien qu'elle soit plus pratique, l'assay d'amplification de l'ADN par ligature (PLA) ne reflète pas directement les interactions entre protéines. En revanche, la co-immunoprécipitation (co-IP) détecte une interaction dirigée. De plus, la spécificité de l'anticorps primaire détermine la qualité du résultat.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de choisir une méthode appropriée pour étudier les interactions entre protéines dans différents compartiments cellulaires, en fonction de votre objectif expérimental.

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Ce protocole décrit comment l'image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Cette vidéo décrit le test de ligature de proximité pour étudier in situ les interactions protéine-protéine dans les cellules de nématodes. La proximité des protéines d’intérêt génère la matrice d’ADN circulaire à l’aide d’une sonde PLA attachée à un anticorps secondaire. La sonde est encore amplifiée à l’aide de la solution d’amplification, qui produit un long ADN simple brin suivi de l’hybridation de la sonde détecteur, permettant la localisation des interactions protéine-protéine dans les...

Essai de ligature de proximité pour étudier les interactions protéine-protéine in situ

Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.

Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) utilise la cytométrie du débit pour détecter sensible les différences dans l'abondance des interactions protéines-protéines ciblées entre deux échantillons. QMI peut être effectué en utilisant une petite quantité de biomatériau, ne nécessite pas d'étiquettes génétiquement modifiées, et peut être adapté pour tout réseau d'interaction protéique précédemment défini.

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Les protéines cognates du domaine J coopèrent avec le chaperon Hsp70 pour aider à une myriade de processus biologiques allant du pliage des protéines à la dégradation. Ici, nous décrivons un assay in situ de ligature de proximité, qui permet la surveillance de ces machineries de chaperon transitoirement formées dans les cellules bactériennes, de levure et humaines.

Surveillance in Situ des assemblages de chaperon moléculaire s'est formé de façon transitoire dans les bactéries, les levures et les cellules humaines

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.

Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour élucider la fonction des protéines cibles, et la co-immunoprécipitation (co-IP) peut facilement confirmer les IPP. Nous avons transfecté transitoirement un plasmide codant pour une protéine marquée à un épitope dans des cellules HEK-293 et développé une méthode d’immunoprécipitation pour confirmer facilement la liaison de deux protéines cibles.

Immunoprécipitation avec un gel d’affinité anti-épitope pour étudier les interactions protéine-protéine

Découvrez la co-immunoprécipitation et le test de ligation de proximité pour visualiser les interactions protéine-protéine dans les fractions nucléaire et cytoplasmique. Ces méthodes complémentaires permettent d'étudier les interactions NF90-RBM3.

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et In Situ Proximité Ligation Assay (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et

Explorer plus de vidéos