Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et In Situ Proximité Ligation Assay

L’objectif général de cette expérience est de comparer les avantages et les inconvénients de la co-immunoprécipitation, ou co-ip, et du test de ligature de proximité, ou pla, dans la visualisation des interactions protéiques dans différents compartiments cellulaires. La comparaison présentée ici de deux méthodes différentes peut aider les scientifiques à décider laquelle est la mieux adaptée à leur objectif spécifique lorsqu’ils étudient les modèles de distribution des interactions protéine-protéine dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Le principal avantage de la co-IP est de détecter les interactions protéiques authentiques.

En revanche, l’avantage du pla est d’analyser rapidement les interactions protéiques de l’institut au niveau de la cellule unique. Après avoir cultivé et récolté des cellules hex293 selon le protocole de texte, à 3 fois 10 à la 6ème cellule, ajoutez 300 microlitres de solution d’extraction cytoplasmique froide et vortex les cellules à la vitesse la plus élevée pendant 15 secondes. Incuber l’extrait sur de la glace pendant 30 minutes, et toutes les 10 minutes pendant l’incubation, agiter l’échantillon pendant cinq secondes.

Ajoutez ensuite 16,5 microlitres de solution d’extraction cytoplasmique froide, agitez pendant cinq secondes et incubez l’échantillon sur de la glace pendant cinq minutes. Agitez l’extrait pendant cinq secondes et centrifugez l’échantillon à 16 000 x g et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube pré-refroidi et conservez-le sur de la glace jusqu’à utilisation, puis utilisez un millilitre de PBS froid pour laver les granulés insolubles trois fois en pipetant de haut en bas et en retirant le PBS après chaque lavage.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de solution d’extraction nucléaire froide, faites tourbillonner pendant 15 secondes et incubez sur de la glace pendant une heure. Toutes les 10 minutes pendant l’incubation, faites un tourbillon sur l’échantillon pendant 15 secondes et utilisez une pointe de 200 microlitres pour pipeter la solution 10 fois. Faites tourbillonner le tube pendant 15 secondes et centrifugez l’échantillon à 16 000 x g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférez le surnageant contenant l’extrait nucléaire dans un nouveau tube prérefroidi et conservez-le sur de la glace jusqu’à utilisation.

Prélever 10 % du volume des extraits nucléaires et cytoplasmiques en entrée, puis ajouter du PBS froid aux extraits restants jusqu’à un volume final d’un millilitre. Garder sur la glace jusqu’à utilisation. Après avoir pré-éliminé les billes magnétiques conjuguées à la protéine g si nécessaire, combinez 40 microlitres de billes magnétiques conjuguées à la protéine g avec quatre microgrammes d’anticorps polyclonaux rapides anti-RBM3, ou des IGG rapides comme contrôle négatif dans 200 microlitres de PBST.

Incuber à température ambiante sur une perruquette pendant 40 minutes. Placez les tubes sur une grille magnétique, puis retirez et jetez le surnageant. Ensuite, avec 200 microlitres de PBST, lavez une fois les billes.

Ajoutez un millilitre de lisates dilués aux billes et incubez sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, placez les tubes sur la grille magnétique et aspirez le surnageant. Ajoutez 0,5 millilitre de PBST aux billes et lavez-les trois fois sur un rotateur à quatre degrés Celsius, avec une vitesse fixe de 20 tr/min pendant 10 minutes.

Éluez la protéine des billes en ajoutant 40 microlitres de tampon d’échantillon, puis chauffez l’échantillon à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir fait tourner les billes, transférez le liquide dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour effectuer la chimie immunocytaire, ensemencez les cellules HEK293 à 1,5 fois 10 aux quatre cellules par chambre dans une lame recouverte de polydélysine à huit chambres.

Dans 0,4 millilitres de DMEM complété par 10 % FPS et 100 unités par millilitre de penstrep. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures, puis aspirer le milieu et utiliser 4 % de PFA pour fixer les cellules à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte à flux laminaire. Ensuite, aspirez le PFA et utilisez 0,5 millilitre de PBS par chambre pour laver les cellules trois fois.

Ajoutez 0,5 % de tritonX100 avec 5 % de NGS et de PBS pour perméabiliser et bloquer les cellules et incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, après avoir dilué les anticorps primaires monoclonaux anti-NF90 et polyclonaux anti-RBM3 de un à 100, ajoutez les anticorps primaires dans les puits et incubez sur l’agitateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez 0,5 millilitre de PBS pour laver les chambres trois fois pendant 10 minutes chacune.

Pour effectuer la chimie immunocytaire, ajoutez une dilution de un à 500 d’anticorps anti-souris couplés à un colorant fluorescent vert et d’anticorps antilapins couplés à un colorant fluorescent rouge aux cellules, et incubez à température ambiante pendant une heure. Ajouter une dilution de un à 5 000 de DAPHE NBPS pour contre-colorer les noyaux et incuber à température ambiante pendant 10 minutes, puis laver les échantillons avec du PBS comme précédemment. Retirez les chambres de la lame de verre et séchez-les, avant d’utiliser 250 microlitres de support de montage par lame pour les monter.

Pour préparer des sondes de test de ligature de proximité du tube, après l’incubation des cellules et des anticorps primaires, et le lavage comme cela vient d’être démontré, diluez les sondes préfabriquées un à 5 dans 0,1 % de tritonx100 et 5 % NGS et PBS, dans un volume total de 320 micorlitres pour une lame à huit chambres. Incuber la solution à température ambiante pendant 20 minutes. Retirez les chambres du côté en verre et ajoutez les sondes diluées, puis incubez les chambres dans un incubateur d’humidité à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Préparez une solution de ligature en mélangeant huit microlitres de ligase, 64 microlitres de stock de ligature 5x et 248 microlitres d’eau. Tapotez le liquide de la lame et utilisez le tampon de lavage Onex A pour laver les échantillons deux fois pendant cinq minutes chacune. Ajoutez la solution de ligature aux échantillons et incubez-les dans un incubateur d’humidité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Préparez la solution d’amplification en mélangeant quatre microlitres de polymérase, 64 microlitres de stock d’amplification 5x et 252 microlitres d’eau, et enveloppez le tube dans une feuille d’aluminium pour le protéger de la lumière. Ensuite, tapotez le liquide de la lame et utilisez un tampon de lavage X A pour laver les échantillons deux fois pendant deux minutes chacune. Ajoutez la solution d’amplification aux échantillons et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur sombre et humide pendant 100 minutes.

Ensuite, après avoir tapoté le liquide comme précédemment, lavez les échantillons deux fois pendant 10 minutes chacun dans le tampon de lavage B avant de les laver une fois dans le tampon de lavage 0,1 x B.Enfin, séchez la lame et montez les échantillons avec 250 microlitres de milieu de montage commercial avec DAPHE, examinez la fluorescence au microscope et acquérez des images avec une caméra CCD. Des expériences de co-immunoprécipitation avec RBM3 comme protéine d’appât ont révélé que les interactions NF90-RBM3 sont principalement présentes dans le noyau et qu’une minorité se trouve dans le cytoplasme. Dans cette expérience d’immunofluorescence, NF90 et RBM3 sont tous deux observés dans le noyau.

Les deux protéines se trouvent également dans le cytoplasme en C2, et les deux protéines présentent une colocalisation parfaite dans chaque compartiment. Comme on le voit sur ces images, le test de ligature de proximité a révélé le modèle des interactions NF90-RBM3, qui est très similaire à la chimie immunocytaire conventionnelle, dont la plupart des interactions dans le noyau dans la majorité des cellules. Seule une petite proportion de cellules a montré une distribution principalement cytoplasmique des interactions NF90-RBM3.

En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que, bien que plus pratique, le PLA ne reflète pas directement les interactions protéiques. Au lieu de cela, co-ip détecte l’interaction dirigée. De plus, la spécificité de l’anticorps primaire détermine la qualité du résultat.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de choisir une méthode appropriée pour étudier les interactions protéiques dans différents compartiments cellulaires en fonction de votre propre objectif expérimental.