L'utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

L'objectif général de cette expérience est de fabriquer un dispositif microfluidique spécialisé et de l'utiliser pour mesurer la durée de vie et les phénotypes cellulaires d'une cellule de levure unique. Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions clés dans le domaine du vieillissement des levures, telles que pourquoi les cellules mères vieillissent et meurent, et quels sont les premiers événements moléculaires responsables de la perte de l'homéostasie cellulaire et, en fin de compte, du vieillissement et de la mort cellulaire ? Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons suivre les cellules mères, leur durée de vie ainsi que divers marqueurs moléculaires en même temps, ce qui nous permet d'identifier les événements moléculaires corrélés à la durée de vie.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le vieillissement des levures, elle peut également être appliquée à d'autres domaines, comme la surveillance des réponses secondaires à une participation nécessitant un contrôle cellulaire sur de nombreuses générations. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la fabrication du dispositif microfluidique, le chargement des cellules et la mise en place du microscope nécessitent beaucoup de pratique pour être réalisés avec succès. Une démonstration préalable de cette méthode est essentielle, car il est difficile de charger correctement le dispositif microfluidique avec des levures.

Pour commencer, fabriquez un moule en silicium à l’aide de techniques standard, comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Placez-le, côté motifs vers le haut, dans une boîte de Pétri de 15 centimètres. Fixez le moule sur la boîte de Pétri à l’aide de ruban adhésif.

Placez ensuite un bateau de pesée propre sur une balance et faites la tare. Versez 50 grammes de la base de PDMS dans le bateau de pesée, puis ajoutez cinq grammes d'agent de réticulation du PDMS. Mélangez la base de PDMS et l'agent de réticulation à l'aide d'une pipette jetable.

Commencez par le bord de la coupelle de pesée et avancez lentement vers l'intérieur. Mélangez soigneusement le mélange pendant plusieurs minutes jusqu'à l'apparition de petites bulles réparties uniformément. Versez lentement le mélange dans la boîte de Pétri afin qu'il recouvre complètement le moule en tranche de silicium.

Ensuite, placer la boîte de Pétri sous vide pendant 10 minutes afin d'éliminer toutes les bulles d'air du mélange de PDMS. Si des bulles persistent à la surface du mélange après la suppression du vide, utiliser une pipette pour les chasser. Ensuite, faire cuire l'appareil à 75 degrés Celsius pendant deux heures.

Lorsque la température ambiante est de nouveau atteinte, couper soigneusement le PDMS autour du moule, puis décoller délicatement la couche de PDMS polymérisé du moule en tranche de silicium, en évitant tout dommage à la structure du moule. Placer la couche de PDMS sur la paillasse avec la face structurée tournée vers le haut. Découper soigneusement chaque puce individuelle à l’aide d’un rasoir industriel à lame unique, en laissant une marge suffisante par rapport au bord de chaque puce afin d’éviter d’endommager la structure.

Avec le côté du motif tourné vers le haut, utilisez un stylo perforateur pour percer des trous verticalement à travers les cercles d'entrée et de sortie situés de chaque côté des canaux. Vérifiez chaque trou en insérant à nouveau l'aiguille du stylo perforateur dans le trou. Assurez-vous que l'aiguille peut ressortir de l'autre côté, indiquant ainsi l'absence d'obstruction.

Ensuite, utilisez le ruban adhésif pour éliminer les particules de poussière et les débris de la surface supérieure. Répétez cette étape au moins trois fois, et laissez un morceau propre de ruban adhésif Scotch sur le PDMS afin de maintenir une surface exempte de poussière. Puis retournez le dispositif et répétez cette procédure sur la face opposée du PDMS.

Laissez également le dernier morceau de ruban adhésif sur ce côté. Préparez maintenant une surface en verre pour la base du dispositif. Sélectionnez le morceau de lame couvre-objet de 24 millimètres par 30 millimètres ayant une épaisseur comprise entre 13 et 17 millimètres.

Vaporisez de l'éthanol à 70 % sur le verre, puis séchez-le avec un agent anti-poussière afin de stériliser la surface. Ensuite, transférez le verre de couverture et le PDMS dans une plaque en plastique. Retirez le ruban adhésif du PDMS et placez-le avec la face structurée vers le haut dans la plaque, sans toucher la surface supérieure.

Transférez ensuite la plaque dans une chambre à plasma. Appliquez un traitement au plasma d'oxygène sur le PDMS et le verre de couverture afin de rendre les surfaces hydrophiles. Retirez ensuite la plaque de la chambre à plasma et reliez soigneusement les surfaces traitées au plasma du PDMS et du verre de couverture.

Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air entre le PDMS et le verre de couverture. Enfin, transférez le dispositif dans un four et faites-le cuire à 75 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Plongez les tubes d'entrée et de sortie dans une solution d'éthanol à 70 % un jour avant la préparation de la puce en PDMS.

Le lendemain, remplir une seringue de cinq millilitres avec de l'eau stérilisée et laver chaque tube en plaçant le tube sur la seringue et en rinçant le tube à l'eau. Répéter l'étape de lavage au moins trois fois pour éliminer l'éthanol résiduel. Ensuite, examiner les canaux en PDMS au microscope optique.

À l’aide d’un objectif 10 X, vérifiez que les structures sont cohérentes et intactes. Stabilisez la puce PDMS intacte sur la platine du microscope à l’aide de ruban adhésif Scotch. Fixez une seringue de cinq millilitres remplie d’eau stérile sur une pompe à seringue et insérez les tubes d’entrée et de sortie correspondants dans le dispositif.

Régler le débit à 750 microlitres par heure et rincer la puce pendant environ 10 minutes. Observer les canaux pour s'assurer que toutes les bulles d'air sont éliminées. Si des bulles persistent après le rinçage de 10 minutes, ajuster manuellement la vitesse afin de les faire disparaître.

Transférez un millilitre d’un échantillon de levure préparé dans deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et centrifugez les échantillons pendant cinq minutes à 3 000 ×g. Retirez la majeure partie du surnageant de chaque tube et combinez les résidus pour former un échantillon de 5 millilitres. Une fois l’échantillon de levure prêt, retirez les tubes d’entrée de la puce en PDMS. Inversez manuellement la pompe à seringue pour aspirer une petite bulle d’air d’une à deux centimètres de longueur dans chaque tube d’entrée, puis aspirez les cultures cellulaires.

Insérez ensuite le tube d'entrée dans la puce en PDMS et réenclenchez la pompe pour charger les cellules à une vitesse de 750 microlitres par heure. Laissez la pompe à seringue fonctionner pendant 10 minutes, puis examinez la progression du chargement cellulaire au microscope. Un chargement réussi piégera les cellules sous plus de 60 % des piliers de suspension.

Pour maintenir les cellules de levure, remplacez la solution dans la seringue par une solution nutritive et réglez la vitesse à 400 microlitres par heure. Le phénotype de durée de vie de la levure peut être obtenu en comptant le nombre de bourgeons produits par chaque cellule mère piégée et en estimant l'estimateur de Kaplan-Meier. En utilisant ce protocole, l'appareil piège fréquemment de nouvelles cellules filles issues par bourgeonnement des cellules déjà piégées.

Ces cellules se transforment ensuite en de nouvelles cellules mères qui peuvent être identifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image en aval. Ces nouvelles cellules mères permettent une mesure plus précise de la durée de vie. Dans cette expérience, la durée de vie moyenne des nouvelles cellules mères était légèrement plus longue d’environ deux générations.

En plus du nombre de bourgeons, l'intervalle de temps entre deux événements de bourgeonnement successifs peut être extrait des données d'imagerie. Le bourgeonnement ralentit considérablement vers la fin de leur durée de vie, indiquant l'état défavorable de ces cellules âgées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser une puce fraîchement préparée afin d'éviter les bulles, et d'augmenter la concentration cellulaire afin d'améliorer l'efficacité de chargement des cellules si nécessaire.

Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine du vieillissement chez la levure d'explorer les premiers changements moléculaires responsables du phénotype de vieillissement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer ce dispositif microfluidique et comment l'utiliser pour mesurer la durée de vie et les phénotypes cellulaires chez des cellules individuelles.