L'utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

L’objectif global de cette expérience est de fabriquer un dispositif microfluidique spécialisé et de l’utiliser pour mesurer la durée de vie et les phénotypes cellulaires d’une seule cellule de levure. Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions clés dans le domaine du vieillissement de la levure, telles que pourquoi les cellules mères vieillissent et meurent et quels sont les événements moléculaires antérieurs qui entraînent la perte d’homéostasie cellulaire et finalement le vieillissement et la mort cellulaires ? Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons suivre les cellules mères, suivre leur durée de vie et les différents marqueurs moléculaires en même temps, de sorte que nous pouvons rechercher des événements moléculaires en corrélation avec la durée de vie.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du vieillissement de la levure, elle peut également être appliquée à d’autres domaines, tels que la surveillance des réponses secondaires à la participation qui nécessite une vérification cellulaire pendant de nombreuses générations. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car la fabrication de dispositifs microfluidiques, le chargement de cellules, la configuration d’un microscope nécessitent beaucoup de pratique pour fonctionner avec succès. La démonstration préalable de cette méthode est essentielle car il est difficile de charger correctement le dispositif microfluidique avec de la levure.

Pour commencer, fabriquez un moule de plaquette de silicium pour le dispositif en utilisant les techniques standard décrites dans le protocole de texte ci-joint. Placez-le côté trait vers le haut dans une boîte de Pétri de 15 centimètres. Fixez le moule sur la boîte de Pétri avec des rubans.

Ensuite, placez un bateau de pesée propre sur une balance et déchirez la balance. Versez 50 grammes de base PDMS dans le bateau de pesée, puis ajoutez cinq grammes d’agent de durcissement PDMS. Mélangez la base PDMS et l’agent de durcissement à l’aide d’une pipette jetable.

Commencez par le bord du bateau de pesée et déplacez-vous lentement vers l’intérieur. Remuez soigneusement le mélange pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que de petites bulles se forment dans tout le mélange. Versez lentement le mélange dans la boîte de Pétri, de sorte qu’il recouvre complètement le moule à gaufrette en silicone.

Placez ensuite la boîte de Pétri dans le vide pendant 10 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air du mélange PDMS. Si des bulles restent à la surface du mélange une fois sorti du vide, utilisez une pipette pour les souffler. Ensuite, faites cuire l’appareil à 75 degrés Celsius pendant deux heures.

Une fois refroidi à température ambiante, coupez soigneusement le PDMS autour du moule, puis décollez doucement la couche de PDMS polymérisé du moule de plaquette de silicium, évitant ainsi d’endommager la construction du moule de plaquette. Placez la couche PDMS sur le banc avec le côté du motif vers le haut. Découpez soigneusement la puce individuelle avec une lame de rasoir industriel à un seul tranchant, en conservant une marge adéquate sur le bord de chaque puce pour éviter d’endommager la construction.

Avec le côté du motif vers le haut, utilisez un stylo poinçonneur pour percer des trous directement dans les cercles d’entrée et de sortie de chaque côté des canaux. Vérifiez chaque trou en insérant à nouveau l’aiguille du stylo poinçon dans le trou. Assurez-vous que l’aiguille peut sortir de l’autre côté, indiquant qu’il n’y a pas de blocages.

Ensuite, utilisez le ruban adhésif pour nettoyer les particules de poussière et les débris de la surface supérieure. Répétez cette étape au moins trois fois et laissez un morceau de ruban adhésif propre sur le PDMS pour maintenir une surface sans poussière. Retournez ensuite l’appareil et répétez cette procédure sur le site opposé du PDMS.

Laissez également le dernier morceau de ruban adhésif de ce côté. Préparez maintenant une surface en verre pour la base de l’appareil. Sélectionnez le morceau de verre de protection de 24 millimètres sur 30 millimètres d’une épaisseur comprise entre 13 et 17 millimètres.

Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur le verre et séchez-le avec un dépoussiérant pour stériliser la surface. Transférez ensuite le verre de protection et le PDMS dans une plaque en plastique. Retirez le ruban adhésif du PDMS et placez le côté du motif vers le haut dans la plaque, sans entrer en contact avec la surface supérieure.

Transférez ensuite la plaque dans une chambre à plasma. Appliquez un traitement au plasma d’oxygène sur le PDMS et le verre de protection pour rendre les surfaces hydrophiles. Retirez ensuite la plaque de la chambre à plasma et connectez soigneusement les surfaces traitées au plasma du PDMS dans du verre de protection.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air entre le PDMS et la vitre de protection. Enfin, transférez l’appareil dans un four et faites cuire à 75 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Immergez les tubes d’entrée et de sortie dans une solution d’éthanol à 70 % un jour avant la préparation de la puce PDMS.

Le lendemain, remplissez une seringue de cinq millilitres d’eau autoclavée et lavez chaque tube en plaçant le tube sur la seringue et en rinçant le tube avec de l’eau. Répétez l’étape de lavage au moins trois fois pour éliminer l’éthanol résiduel. Ensuite, examinez les canaux PDMS au microscope optique.

À l’aide d’un objectif 10X, assurez-vous que les structures sont cohérentes et intactes. Stabilisez la puce PDMS intacte sur la plate-forme du microscope à l’aide de ruban adhésif. Fixez une seringue de cinq millilitres chargée d’eau stérile à un pousse-seringue et insérez les tubes d’entrée et de sortie correspondants dans l’appareil.

Réglez le débit à 750 microlitres par heure et rincez la puce pendant environ 10 minutes. Surveillez les chaînes pour vous assurer que toutes les bulles d’air sont emportées. S’il reste des bulles après le rinçage de 10 minutes, ajustez manuellement la vitesse pour éliminer les bulles.

Transférez un millilitre d’un échantillon de levure préparé dans deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez les échantillons pendant cinq minutes à 3 000 fois G. Retirez la majorité du surnageant de chaque tube et combinez le reste pour former un échantillon de 5 millilitres. L’échantillon de levure étant maintenant prêt, retirez les tubes d’entrée de la puce PDMS. Inversez manuellement le pousse-seringue pour aspirer une petite bulle d’air d’un à deux centimètres de long, chaque tube d’entrée, puis aspirez des cultures cellulaires.

Ensuite, réinsérez le tube d’entrée dans la puce PDMS et redémarrez la pompe pour charger les cellules à une vitesse de 750 microlitres par heure. Laissez le pousse-seringue allumé pendant 10 minutes, puis examinez la progression de la charge cellulaire au microscope. Une charge réussie piégera les cellules sous plus de 60 % du pilier de suspension.

Pour maintenir les cellules de levure, remplacez la solution dans la seringue par une solution nutritionnelle et ajustez la vitesse à 400 microlitres par heure. Le phénotype de durée de vie de la levure peut être obtenu en comptant le nombre de bourgeons produits par chaque cellule mère piégée et en estimant l’estimateur de Kaplan-Meier. En utilisant ce protocole, le dispositif piège fréquemment des cellules filles fraîches qui se sont détachées des cellules déjà piégées.

Ces cellules se transforment ensuite en cellules mères fraîches qui peuvent être identifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en aval. Ces cellules mères fraîches fournissent une mesure plus précise de la durée de vie. Dans cette expérience, la durée de vie moyenne des cellules mères fraîches était légèrement plus longue d’environ deux générations.

En plus du nombre de bourgeons, l’intervalle de temps entre deux événements de bourgeonnement successifs peut être extrait des données d’imagerie. Le bourgeonnement ralentit considérablement vers la fin de leur vie, ce qui indique l’état malsain de ces cellules âgées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler à la fois d’utiliser une puce fraîchement fabriquée pour éviter les bulles et d’augmenter la concentration des cellules afin d’améliorer l’efficacité du chargement des cellules si nécessaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du vieillissement des levures pour explorer les changements moléculaires précoces qui sont à l’origine du phénotype du vieillissement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de ce dispositif microfluidique et de la façon de l’utiliser pour mesurer la durée de vie et les phénotypes cellulaires dans des cellules uniques.