Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

L’objectif global de cette procédure est de suivre les cellules de levure haplo uniques tout au long de leur vie réplicative. La première étape consiste à fabriquer une puce microfluidique contenant un ensemble de micro-tampons. Ensuite, les cellules de levure sont chargées dans la puce microfluidique, et parce que la zone sous les micro-coussinets a une hauteur similaire au diamètre d’une cellule de levure, les cellules s’y déposeront.

Par la suite, un flux continu de milieu frais est appliqué sur les cellules de levure piégées, et les cellules filles émergentes sont emportées par le flux de fond clair et de fluorescence. La microscopie est utilisée pour visualiser les changements dans la morphologie des cellules ou des organites, l’expression et la localisation des protéines qui peuvent se produire dans les cellules de levure vieillissantes. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode de microdissection classique est qu’elle demande moins de main-d’œuvre et qu’elle permet d’obtenir des images microscopiques continues à long terme de toute la durée de vie des cellules de levure individuelles.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du vieillissement réplicatif, elle peut également être utilisée pour des études nécessitant une observation microscopique continue sur de longues périodes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il faut faire attention à certaines étapes de la production de la puce micro-feic. De plus, le chargement des cellules dans la puce micro feic peut nécessiter une certaine expérience.

Le moule à plaquette de silicium est produit par lithographie douce. Pour plus de détails sur sa production, veuillez vous référer au protocole d’accompagnement. Texte : découpez un morceau d’étiquette dure en fines bandes d’environ 0,5 millimètre sur trois millimètres.

À l’aide d’un scalpel, placez soigneusement les bandes sur le moule à plaquettes de silicone, légèrement au-dessus de la structure du canal entre les canaux d’entrée et le micro padre. Ensuite, couvrez une boîte de Pétri en verre d’une double couche de papier d’aluminium et mettez la plaquette dans la boîte de Pétri. La feuille d’aluminium empêchera le PDMS de s’infiltrer entre la plaquette et la boîte de Pétri pendant la production des puces microfluidiques.

Pour commencer la procédure de fabrication de puces microfluidiques, placez un gobelet en plastique vide sur la balance et déchirez la balance. Versez 40 grammes de base PDMS dans le gobelet en plastique. Ajoutez l’agent de durcissement PDMS dans un rapport poids/poids de un à 10, ce qui dans ce cas est d’environ quatre millilitres.

À l’aide de la pipette en plastique jetable bien mélangée pendant plusieurs minutes, il est important que le mélange soit bien mélangé pour assurer une bonne polymérisation du PDMS plus tard. Versez le PDMS sur la gaufrette dans la boîte de Pétri en verre. Le mélange PDMS dans la boîte de Pétri contiendra beaucoup de bulles à Degas.

Le PDMS place, la boîte de Pétri dans un desséchage relié à une pompe à vide pendant environ 30 minutes lorsque toutes les bulles ont été éliminées. Polymérisez le PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec la plaquette sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius pendant une heure, puis à 65 degrés Celsius pendant une autre heure. Après les deux heures, retirez la plaquette de papier d’aluminium et le PDMS polymérisé de la boîte de Pétri en verre.

Décollez la feuille d’aluminium en PDMS à l’arrière de la plaquette. Soulevez ensuite avec précaution la couche de PDMS du haut de la plaquette. Placez la couche PDMS à l’envers avec les canaux vers le haut sur le banc et découpez soigneusement les motifs de puce unique imprimés sur le PDMS avec le scalpel.

Essayez de conserver environ trois millimètres de PDMS sur les bords des canaux. L’étape suivante consiste à percer des trous dans le PDMS aux extrémités de la sortie d’entrée et du canal latéral, comme illustré sur ce schéma. Pour percer un trou, poussez un bout de leurre de calibre 20 à travers le PDMS de manière droite.

Retirez la colonne de PDMS dans le bout du leurre avant de retirer le talon. Encore une fois, cela empêche la colonne PDMS de bloquer le trou nouvellement perforé. Une fois que tous les trous ont été percés, nettoyez les surfaces de la puce des particules de poussière et des PDMS résiduels en plaçant du scotch dessus et en retirant immédiatement le ruban.

De même, nettoyez la vitre de protection à laquelle la puce sera fixée. Placez la puce et le verre de couverture sous la lampe UV d’un nettoyant à l’ozone UV de paillasse avec les côtés qui doivent être collés ensemble, face à la lampe exposée à la lumière UV pendant six à huit minutes, et placez les surfaces exposées les unes sur les autres. Tapotez doucement sur les côtés de la puce pour favoriser la fixation du PDMS sur le verre de protection et pour éliminer les bulles d’air.

Ne tapotez pas sur le dessus de la structure du canal car cela pourrait entraîner la fixation des micro-coussinets sur le couvercle. Le verre aussi. Placez la nouvelle installation microfluidique sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, vérifiez la liaison de la vitre de protection sur la puce PDMS en soulevant légèrement les bords de la puce PDMS. Si cela n’est pas possible, le collage est réussi et la puce est prête à l’emploi. Pour préparer la puce microfluidique au chargement des cellules, placez la puce dans le support métallique avec du gel de silicone entre le verre de la puce et les parties métalliques du support.

Pour créer un joint étanche, vissez doucement les écrous pour éviter de casser le verre. Connectez des tubes minces au canal latéral et au canal de sortie de la puce. L’utilisation d’une pince à épiler facilite l’insertion du tube dans les trous perforés.

Remplissez une seringue à leurre de 50 millilitres avec du milieu de culture. Retirez l’air de la seringue et connectez-la séquentiellement à une seringue. Filtrez un bout de leurre de calibre 20, un tube court et épais et un tube fin.

Placez la seringue dans le pousse-seringue et avancez rapidement la pompe jusqu’à ce que le tube mince soit complètement rempli de fluide. Poussez le tube mince relié à la seringue dans le canal d’entrée de la et laissez le fluide s’écouler à travers la puce à une vitesse de 10 microlitres par minute. Récupérez le milieu en laissant la puce dans une boîte de Pétri.

Le fluide s’épuisera par le canal latéral. En raison de la différence de résistance entre le grand canal latéral fabriqué par une étiquette résistante et le canal de sortie. Placez la puce sur la platine du microscope et réglez la mise au point du microscope sur les coussinets.

Pour commencer cette procédure, connectez une seringue à pointe de leurre de cinq millilitres à un bout de leurre de calibre 20 et à un tube épais. Chargez la seringue avec environ un millilitre de suspension cellulaire à charger dans la puce. Le nombre de cellules préféré pour le chargement est compris entre un et cinq fois 10 des six cellules par millilitre.

Réduisez le débit de l’exhoche-seringue à 0,5 microlitre par minute. La partie la plus difficile de cette procédure est le chargement des cellules dans la puce microme. Cela nécessite généralement un peu de pratique.

Connectez la seringue contenant la suspension cellulaire au tube du canal de sortie. Chargez les cellules en appuyant sur le piston de la seringue. Observez doucement les cellules entrer et se déposer sous les micro-coussinets via l’oculaire ou l’écran d’ordinateur.

Maintenez la pression sur le piston jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules se déposent sous les coussinets. La charge optimale est d’une à trois cellules par tampon. Débranchez la seringue utilisée pour le chargement des cellules et rincez le canal latéral pendant quelques minutes à des débits plus élevés pour éliminer les bulles d’air et/ou les cellules qui ne sont pas encore sorties de la puce.

Réduisez à nouveau le débit du pousse-seringue à 0,5 microlitre par minute et fermez le canal latéral en le connectant à un tube épais contenant un bouchon de cathéter à son extrémité. Augmentez le débit de la pompe à seringue jusqu’à un débit final d’un à cinq microlitres par minute. Les débits peuvent varier en fonction du milieu et de la souche de levure.

Démarrez un film avec le réglage du microscope et de la caméra adapté à l’objectif de l’expérience. Il s’agit d’un exemple de film en accéléré d’une seule cellule sauvage de type E se développant sur YPD. Des images moyennes ont été prises toutes les 10 minutes et la barre d’échelle que nous venons de montrer représente cinq micromètres.

La cellule produit un total de 30 bourgeons avant de mourir. La durée de vie réplicative peut être déterminée en comptant le nombre de bourgeons produits par une seule cellule mère. Ces données sont transformées en une courbe de durée de vie en traçant le pourcentage de cellules viables en fonction du nombre de bourgeons produits ou du nombre de générations.

Cette figure montre un exemple de courbes de durée de vie obtenues pour une souche de levure de type sauvage et deux souches mutantes. La délétion du gène SER two entraîne une durée de vie plus courte, tandis que la délétion du gène FOB one entraîne une durée de vie plus longue. La morphologie mitochondriale en fonction de l’âge peut être étudiée à l’aide du dispositif microfluidique.

Une expérience de vieillissement a été réalisée avec des cellules de levure de type sauvage BY 7 42 exprimant ILV 3G FP, qui cible les mitochondries. Dans cette figure, un exemple représentatif de changements associés à l’âge dans la morphologie mitochondriale d’une seule cellule est indiqué par la flèche blanche. Toutes les images sont mises à l’échelle de manière identique et la barre d’échelle représente cinq micromètres.

Le deuxième film en accéléré est celui d’une cellule unique exprimant ILV 3G FP de l’expérience où la morphologie mitochondriale en fonction de l’âge a été observée. Des images ont été prises toutes les 30 minutes et la barre d’échelle représente cinq micromètres. Cette dernière figure montre les morphologies mitochondriales observées dans le même ensemble de cellules à différents âges réplicatifs avant de produire leur premier bourgeon après 10 bourgeons et avant la mort.

Un exemple d’image de chaque classe de morphologie est inclus tubulaire, tubulaire fragmenté, et taches et grandes taches. Les changements morphologiques observés dans les cellules d’âge moyen ressemblent à ceux signalés précédemment en surveillant continuellement les cellules au fur et à mesure qu’elles se divisent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le vieillissement réplicatif de la levure, telles que pourquoi une cellule de levure vieillit-elle, quels changements phénotypiques se produisent et comment ceux-ci influencent-ils la durée de vie réplicative de la levure ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez savoir comment créer vos propres micropuces et étudier le vieillissement réplicatif dans les cellules à l’aide de n’importe quel microscope fluorescent.