Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

L'objectif général de cette procédure est de suivre des cellules haploïdes de levure individuelles pendant toute leur durée de vie réplicative. La première étape consiste à fabriquer une puce microfluidique contenant un réseau de microplots. Ensuite, les cellules de levure sont chargées dans la puce microfluidique, et comme la hauteur de la zone située sous les microplots est similaire au diamètre d'une cellule de levure, les cellules s'y déposent.

Ensuite, un flux continu de milieu frais est appliqué sur les cellules de levure piégées, et les cellules filles émergentes sont éliminées par le flux de milieu en microscopie à contraste de phase et en fluorescence. La microscopie permet de visualiser les changements de morphologie cellulaire ou des organites, l'expression protéique et la localisation des protéines pouvant survenir au cours du vieillissement des cellules de levure. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode classique de microdissection est qu'elle est moins laborieuse et qu'elle permet d'obtenir des images microscopiques continues sur le temps long, couvrant l'ensemble du temps de vie de cellules individuelles de levure.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le vieillissement réplicatif, elle peut également être utilisée pour des études nécessitant une observation microscopique continue sur de longues périodes. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car des précautions doivent être prises lors d'étapes spécifiques de la fabrication de la puce micro feic. En outre, le chargement des cellules dans la puce micro feic peut nécessiter une certaine expérience.

Le moule en tranche de silicium est produit par lithographie douce. Pour plus de détails sur sa fabrication, veuillez consulter le protocole associé. Découpez un morceau de label résistant en fines bandes d’environ 0,5 millimètre sur trois millimètres.

Avec un scalpel, placer soigneusement les bandes sur le moule en silicium, légèrement au-dessus de la structure du canal située entre les canaux d'entrée et le micro padre. Ensuite, recouvrir une boîte de Pétri en verre d'une double couche de papier d'aluminium et placer la tranche dans la boîte de Pétri. Le papier d'aluminium empêchera le PDMS de s'écouler entre la tranche et la boîte de Pétri lors de la fabrication des puces microfluidiques.

Pour commencer la procédure de fabrication de puces microfluidiques, placez un gobelet en plastique vide sur la balance et tarer la balance. Versez 40 grammes de la base de PDMS dans le gobelet en plastique. Ajoutez l’agent de réticulation du PDMS dans un rapport poids à poids de un pour 10, ce qui correspond ici à environ quatre millilitres.

À l’aide de la pipette en plastique jetable, mélanger soigneusement pendant plusieurs minutes ; il est important que le mélange soit bien homogénéisé afin d’assurer une polymérisation correcte ultérieure du PDMS. Verser le PDMS sur le dessus de la tranche dans la boîte de Pétri en verre. Le mélange de PDMS dans la boîte de Pétri contiendra de nombreuses bulles nécessitant une dégazéification.

Placer le PDMS, la boîte de Pétri, dans un dessiccateur relié à une pompe à vide pendant environ 30 minutes, une fois toutes les bulles éliminées. Polymériser le PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec le wafer sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius pendant une heure, suivie de 65 degrés Celsius pendant une autre heure. Après les deux heures, retirer le wafer en aluminium et le PDMS polymérisé de la boîte de Pétri en verre.

Détachez la feuille d'aluminium du PDMS à partir de l'arrière de la plaquette. Ensuite, soulevez délicatement la couche de PDMS depuis le haut de la plaquette. Placez la couche de PDMS à l'envers, avec les canaux orientés vers le haut, sur la paillasse, puis découpez soigneusement les conceptions individuelles de puces imprimées sur le PDMS à l'aide du scalpel.

Essayez de conserver environ trois millimètres de PDMS autour des bords des canaux. L'étape suivante consiste à percer des trous dans le PDMS aux extrémités du canal d'entrée, du canal de sortie et du canal latéral, comme illustré sur ce schéma. Pour percer un trou, insérez complètement un embout d'aiguille de calibre 20 à travers le PDMS de manière rectiligne.

Retirez la colonne de PDMS dans l'embout d'appât avant de sortir l'embout. Là encore, cela empêche la colonne de PDMS de bloquer le nouveau trou perforé. Une fois tous les trous perforés, nettoyez les surfaces de la puce des particules de poussière et des résidus de PDMS en appliquant un ruban adhésif dessus, puis en retirant immédiatement le ruban.

De la même manière, nettoyez le verre de couverture auquel la puce sera fixée. Placez la puce et le verre de couverture sous la lampe UV d’un nettoyeur UV/ozone de banc, les faces devant être assemblées tournées vers la lampe, exposées à la lumière UV pendant six à huit minutes, puis superposez les surfaces exposées. Tapez doucement autour des bords de la puce afin de favoriser l’adhésion du PDMS au verre de couverture et d’éliminer les éventuelles bulles d’air.

Ne pas taper sur le dessus de la structure du canal, car cela pourrait provoquer l'attachement des micro-pads au couvercle. Le verre également. Placer le dispositif microfluidique nouvellement fabriqué sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, vérifiez l'adhérence du verre de couverture au chip en PDMS en soulevant légèrement les bords du chip en PDMS. Si cela n'est pas possible, l'adhérence est réussie et le chip est prêt à l'emploi. Pour préparer le chip microfluidique au chargement cellulaire, placez le chip dans le support métallique avec du gel de silicone entre le verre du chip et les parties métalliques du support.

Pour créer un joint étanche à l'eau, vissez doucement les écrous afin d'éviter de casser le verre. Connectez des tubes fins au canal latéral et au canal de sortie de la puce. L'utilisation de pinces facilite l'insertion des tubes dans les trous perforés.

Remplir une seringue de 50 millilitres munie d'un verrouillage à leurre avec du milieu de culture. Retirer l'air de la seringue, puis la raccorder successivement à une seringue. Filtrer à l'aide d'un embout de leurre de calibre 20, d'un tube court et épais, et d'un tube fin.

Placer la seringue dans la pompe à seringue et faire avancer rapidement la pompe jusqu'à ce que le tube fin soit complètement rempli de milieu. Insérer le tube fin relié à la seringue dans le canal d'entrée de la puce et laisser le milieu s'écouler à travers la puce à un débit de 10 microlitres par minute. Recueillir le milieu sortant de la puce dans une boîte de Pétri.

Le milieu s'écoulera par le canal latéral. En raison de la différence de résistance entre le canal latéral constitué d'une grande étiquette robuste et le canal de sortie. Placez la puce sur la platine du microscope et focalisez le microscope sur les plots.

Pour commencer cette procédure, fixez une seringue à embout Luer de 5 mL à un raccord Luer de calibre 20 et à un tube épais. Remplissez la seringue avec environ 1 mL de la suspension cellulaire destinée à être chargée dans la puce. La concentration cellulaire recommandée pour le chargement se situe entre 1 et 5 × 10⁶ cellules par millilitre.

Réduisez le débit de la pompe à seringue à 0,5 microlitres par minute. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à charger les cellules dans la micropuce. Cela nécessite généralement un certain entraînement.

Reliez la seringue contenant la suspension cellulaire au tube du canal de sortie. Chargez les cellules en appuyant doucement sur le piston de la seringue. Observez délicatement l'entrée des cellules et leur dépôt sous les micro-pads à travers l'oculaire ou l'écran d'ordinateur.

Appliquez une pression continue sur le piston jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de cellules se soit déposé sous les pastilles. La charge optimale est d'une à trois cellules par pastille. Déconnectez la seringue utilisée pour le chargement des cellules et rincez le canal latéral pendant quelques minutes à des débits plus élevés afin d'éliminer les bulles d'air ou les cellules qui n'ont pas encore quitté la puce.

Réduisez à nouveau le débit de la pompe à seringue à 0,5 microlitre par minute et fermez le canal latéral en le reliant à un tube épais contenant un bouchon de cathéter à son extrémité. Augmentez le débit de la pompe à seringue jusqu'à un débit final d'un à cinq microlitres par minute. Les débits peuvent varier selon le milieu et la souche de levure.

Démarrez un film avec le microscope et les paramètres de la caméra adaptés à l'objectif de l'expérience. Voici un exemple de film en accéléré montrant une cellule E de type sauvage unique en cours de croissance sur du YPD. Des images du milieu ont été prises toutes les 10 minutes et la barre d'échelle indiquée représente cinq micromètres.

La cellule produit un total de 30 bourgeons avant de mourir. La durée de vie réplicative peut être déterminée en comptant le nombre de bourgeons produits par une seule cellule mère. Ces données sont transformées en une courbe de durée de vie en traçant le pourcentage de cellules viables en fonction du nombre de bourgeons produits ou du nombre de générations.

Cette figure montre un exemple de courbes de durée de vie obtenues pour une souche de levure de type sauvage et deux souches mutantes. La délétion du gène SER deux entraîne une durée de vie réduite, tandis que la délétion du gène FOB un conduit à une durée de vie allongée. La morphologie mitochondriale en fonction de l'âge peut être étudiée à l'aide du dispositif microfluidique.

Une expérience de vieillissement a été réalisée avec des cellules de levure de type sauvage BY 7 42 exprimant ILV 3G FP, qui est dirigée vers les mitochondries. Sur cette figure, un exemple représentatif de changements associés à l'âge dans la morphologie mitochondriale dans une cellule unique est indiqué par la flèche blanche. Toutes les images sont à la même échelle, et la barre d'échelle représente cinq micromètres.

Le deuxième film en accéléré montre une cellule unique exprimant ILV 3G FP provenant de l'expérience au cours de laquelle la morphologie mitochondriale en fonction de l'âge a été observée. Des images ont été prises toutes les 30 minutes et la barre d'échelle représente cinq micromètres. Cette dernière figure illustre les morphologies mitochondriales observées dans le même ensemble de cellules à différents âges de reproduction, avant la formation de leur premier bourgeon, après 10 bourgeonnements et avant la mort.

Une image d'exemple de chaque classe de morphologie est incluse : tubulaire, tubulaire fragmenté, points et grands points. Les modifications morphologiques observées chez les cellules d'âge intermédiaire ressemblent à celles décrites précédemment. En surveillant continuellement les cellules pendant qu'elles se divisent, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le vieillissement réplicatif de la levure, telles que : pourquoi une cellule de levure vieillit-elle, quelles modifications phénotypiques se produisent, et comment celles-ci influencent-elles la durée de vie réplicative de la levure ?

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez savoir comment créer vos propres micropuces et étudier le vieillissement réplicatif des cellules en utilisant pratiquement tout microscope fluorescent.