Name: Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez l'imagerie microfluidique haute résolution du vieillissement réplicatif chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet le suivi continu des changements morphologiques et de l'expression protéique au cours du vieillissement cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Laura Schippers pour écrire les premières versions du protocole de chargement de cellules et Marcus de Goffau et Guille Zampar pour marquer morphologies mitochondriales.

1. Production et la préparation d&#39;une plaquette moule en silicone Puces microfluidiques sont créés à partir d&#39;un moule de plaquette de silicium produite par lithographie douce. Ces plaquettes peuvent être réutilisés plusieurs fois pour produire des puces microfluidiques. Il est souhaitable que la production d&#39;une tranche respective est réalisée par un groupe spécialisé dans la microfluidique 6. La plaquette est réalisée par un procédé de photolithographie deux étapes au moyen de deux couches différentes de résine photosensible négative, SU-8 7. La couche de fond est utilisée pour générer la zone de piégeage de cellules (SU-8 2002; hauteur 3-4 pm), alors que les canaux sont réalisés avec la couche supérieure (SU-8 2010; hauteur 10 pm). Une impression du processus de production de plaquettes peut être trouvée dans Huang et al 8. Les dessins des puces microfluidiques peuvent être obtenus auprès des auteurs ainsi que des conseils sur la façon d&#39;obtenir une plaquette respective. <ol><li> Une fois la plaquette est obtenue, couper un morceau de int Tough-Tago minces bandes d&#39;environ 0,5 mm par 3 mm avec un scalpel et les placer soigneusement sur ​​la plaquette légèrement sur ​​le dessus de la structure de canal entre les canaux d&#39;entrée et le réseau Micropad (figure 2A). Cela se traduira par la formation d&#39;un grand canal supplémentaire dans chaque puce, qui permettra non seulement être utilisé pendant le chargement de la cellule, mais il est également important pour le fonctionnement stable du dispositif microfluidique. </li><li> Couvrir la boîte de Pétri en verre avec une double couche de papier d&#39;aluminium et mettre la galette dans la boîte de Pétri. La feuille d&#39;aluminium permet d&#39;éviter PDMS de fonctionnement entre la plaquette et la boîte de Pétri. Si PDMS ne se glisser entre la plaquette et la boîte de Pétri en verre, la plaquette devient fixé de façon permanente dans la boîte de Pétri. Bien que la plaquette est encore utilisable, il ne sera pas possible de remplacer la boîte de Pétri en verre si ça casse et le PDMS devra être coupé par la suite. </li></ol> 2. La production de puces microfluidiques <ol><li> Placez un plastique videtasse sur la balance et tarer la balance. Verser 40 g de base PDMS dans le gobelet en plastique (pour un cm de diamètre en verre de Pétri 12). Ajouter PDMS durcisseur avec une pipette dans un rapport p / p de 1:10, soit environ 4 ml. </li><li> Mélanger le PDMS et durcisseur à fond pendant plusieurs minutes. Cela peut être fait avec la pipette jetables en plastique qui a servi à la pipette l&#39;agent de durcissement. Il est important que le mélange soit bien mélangé avant d&#39;être coulée sur le dessus de la galette. Mauvais mélange fera partie du PDMS ne se polymériser. </li><li> Verser le PDMS sur le dessus de la galette dans la boîte de Pétri en verre. </li><li> Le mélange de PDMS avec l&#39;agent de durcissement va conduire à la formation de bulles dans le mélange PDMS. Ces bulles doivent être retirés avant le PDMS polymérise. Le PDMS peut être dégazé après la coulée sur le dessus de la plaquette en plaçant la boîte de Petri dans un dessiccateur relié à une pompe à vide. Avec cette configuration, il faut environ 30 minutes pour éliminer toutes les bulles du mélange. </li><li> Polymériser ee PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec la galette sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 1 h, puis à 65 ° C pendant une heure. </li><li> Retirer la feuille d&#39;aluminium ainsi que la tranche et le PDMS polymérisé à partir de la boîte de Pétri en verre. Enlever la feuille d&#39;aluminium et la couche mince de résidu polymérisé PDMS de l&#39;arrière de la plaquette. La couche de PDMS sur le dessus de la tranche peut alors être séparé de la plaquette en la soulevant avec soin. </li><li> Placez la couche de PDMS à l&#39;envers (avec les canaux vers le haut) sur le banc et découpez les modèles de puce unique imprimé sur le PDMS soigneusement avec un scalpel. Essayer de conserver l&#39;ordre de 3 mm de PDMS autour des bords des canaux afin d&#39;améliorer la fixation de la puce sur le verre de recouvrement par la suite. </li><li> Percer des trous dans le PDMS aux extrémités de la goulotte d&#39;entrée, de sortie et de côté (figure 2A) en poussant un tronçon Luer de calibre 20 tout le long du PDMS de façon rectiligne. </li></ol> Assurez-vous que la puce PDMSest toujours couché à l&#39;envers sur le banc tandis que poinçonnage des trous. Ceci empêche PDMS de coller à l&#39;intérieur du canal, ce qui pourrait provoquer un blocage du canal. <ol start="9"><li> Après avoir percé chaque trou, enlever la colonne de PDMS dans le talon luer avec des pincettes avant de tirer le talon de nouveau. La colonne PDMS pourrait autrement rester derrière et de bloquer le trou juste poinçonné. </li><li> Nettoyer les surfaces de la puce à partir de particules de poussière et PDMS résiduelle en plaçant du ruban adhésif sur elle et enlever immédiatement de nouveau la bande. De même nettoyer le verre de protection à laquelle la puce sera jointe. </li><li> Placez la puce nettoyé et couvercle en verre en dessous de la lampe UV de la paillasse Cleaner UV-Ozone. Les parties qui doivent être liés ensemble doivent faire face à la lampe. </li><li> Exposer le PDMS et couvrir verre à la lumière UV pendant 6-8 min, et directement après, mettre la puce de la vitre de protection en plaçant les surfaces exposées au-dessus de l&#39;autre. </li><li> Tapoter légèrement sur les côtés de la pucefavoriser la participation du PDMS pour le verre de couverture et d&#39;éliminer les bulles d&#39;air. Ne tapez pas sur le dessus de la structure de canal car cela pourrait provoquer des micropads de s&#39;attacher à la vitre de protection ainsi. </li><li> Placez la configuration microfluidique nouvellement faite sur une plaque chauffante à 100 ° C pendant 60 min. Testez la force de la liaison entre le couvercle en verre et puce PDMS en essayant de soulever les bords de la puce PDMS légèrement. Lorsque le bloc PDMS ne peut être levée à partir de la surface du verre, la liaison est réussi et la puce est prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Préparation de la puce pour portable Chargement en cours Défaillance d&#39;un dispositif microfluidique peut potentiellement provoquer des fuites de fluide dans le microscope. Pour éviter cela, il est consultatif d&#39;utiliser un support de métal et / ou sceller les côtés de la puce où le PDMS rencontre le verre avec vernis ou de colle époxy. Cela empêche les fuites de fluide dans le cas où la puce PDMS n&#39;est pas lié assez bien pour le verre de protection. Aussi le tubeconnexions peuvent être fixés autour des points d&#39;insertion de la même manière à éviter toute fuite de fluide. Un capteur d&#39;eau fait maison qui éteint la pompe seringue en cas de fuite peut être utilisé comme une mesure de sécurité supplémentaire. Dessins du support métallique spécialement conçu pour la puce microfluidique peuvent être obtenus auprès des auteurs. <ol><li> Placer la puce microfluidique dans le support en métal, avec un gel de silicone entre la vitre de la puce et les parties métalliques du support pour créer un joint étanche à l&#39;eau. Visser les écrous doucement, pour ne pas briser le verre. </li><li> Connecter des tubes minces (environ 5 à 15 cm de long) vers le canal latéral et le canal de sortie de la puce. L&#39;utilisation de la pince, il est facile d&#39;insérer le tube dans les trous perforés. </li><li> Remplir une seringue de 50 ml Luer-Lok avec un milieu de culture, enlever l&#39;air de la seringue et le connecter de manière séquentielle à un filtre de seringue, un talon Luer de calibre 20, un gros tube court (environ 2 cm de long) et un tube mince. Assurez-vous que la baignoire mincee est suffisamment longue pour couvrir la distance entre la pompe à seringue et la platine du microscope. </li><li> Placer la seringue dans la pompe à seringue, l&#39;avance rapide de la pompe jusqu&#39;à ce que le tube mince est entièrement remplie de fluide. </li><li> Poussez le tube mince relié à la seringue dans le canal d&#39;entrée de la puce et de laisser le débit moyen à travers la puce à 10 pi / min (figure 2B). Recueillir le moyen de quitter la puce (par exemple dans une boîte de Pétri). Le milieu sera épuisé par l&#39;intermédiaire du canal latéral à cause de la différence de résistance entre la dure-Tag fait grand canal latéral et le canal de sortie. </li><li> Placez la puce à l&#39;étape de microscope et mettre l&#39;accent sur le microscope sur les pads. </li></ol> L&#39;utilisation d&#39;objectifs à immersion d&#39;huile est préférable à celle des objectifs à immersion de l&#39;eau parce que l&#39;huile ne sèche pas sur le temps long de l&#39;expérience. Selon le microscope qu&#39;il pourrait y avoir des problèmes avec maintien de la fOCUS pendant les premières heures de l&#39;expérience. Il est donc conseillé de laisser la puce pendant une à deux heures dans la platine du microscope afin qu&#39;il puisse s&#39;installer avant que les cellules de chargement et de commencer l&#39;expérience. 4. Chargement des cellules de levure dans la puce microfluidique <ol><li> Connectez un ml Luer seringue à embout 5 à un talon Luer de calibre 20 et un tube épais (environ 3 cm). </li><li> Prélever un échantillon de la culture cellulaire doit être chargé dans la puce. </li></ol> Le nombre de cellules le plus pratique pour le chargement est entre 1-5 x 10 6 cellules par ml. Cultures avec le nombre de cellules plus élevées doivent être dilués avant le chargement. Lorsque la culture de cellules sur YPD, l&#39;efficacité de chargement de la cellule peuvent être améliorés de nombreuses fois si les cellules sont d&#39;abord lavées et remises en suspension avec dans un milieu minimal contenant un pourcentage de glucose similaire avant le chargement. Pendant le fonctionnement de la puce, milieu YPD peut de nouveau être utilisé en toute sécurité. <ol start="3"><li> Charge d&#39;environ 1 ml de la suspension cellulaire dans ee seringue et retirer tout l&#39;air de la seringue. </li><li> Diminuer le débit de la pompe à seringue à 0,5 ul / min. Le faible débit et continue appliquée par la pompe de seringue pendant le chargement (à l&#39;étape 4.5) va pousser des cellules non attachées par l&#39;intermédiaire de la chaîne latérale (figure 2C). </li><li> Raccorder la seringue contenant la suspension cellulaire sur le tube de la voie de sortie. Charger les cellules en appuyant sur le piston de la seringue en douceur. Respecter les cellules entrent et s&#39;installer sous les micropads via l&#39;oculaire ou via l&#39;écran de l&#39;ordinateur. </li><li> Maintenir la pression sur le piston jusqu&#39;à ce que suffisamment de cellules s&#39;installent sous les patins. La charge optimale est de 1-3 cellules par bloc. Comme les cellules se déposent sous les patins au hasard, il est assez fréquent que quelques blocs ne contiennent pas de cellules et d&#39;autres blocs sont complètement remplis de cellules. </li><li> Déconnecter la seringue utilisée pour le chargement de la pile et le tube épais qui lui est connecté dans le mince tube du canal de sortie, rincer le CH latéraleAnnel pour un couple de minutes à des débits plus élevés (10 pi / min) pour éliminer les bulles d&#39;air et / ou des cellules qui n&#39;ont pas encore sortent de la puce (figure 2B). Si les cellules ne sont pas retirés du canal latéral, ils peuvent commencer à croître dans le canal latéral et interférer avec l&#39;expérience plus tard. </li><li> Mettre le débit de la pompe de la seringue vers le bas à 0,5 ul / min et de fermer le canal de côté large en le connectant à un tube d&#39;épaisseur (environ 5 cm de long) contenant un connecteur de cathéter à son extrémité (figure 2D). </li><li> Augmenter le débit à un débit d&#39;écoulement final de 5.1 pi / min. Les débits peuvent varier en fonction du fluide et de la souche de levure. </li><li> Lancer un film avec les réglages du microscope et de la caméra appropriés pour le but de l&#39;expérience. S&#39;assurer que la vitesse de la platine du microscope est réglé sur une vitesse faible que l&#39;huile peut suivre. Pour la détermination de la durée de vie réplicative, les cellules d&#39;image toutes les 10 min. Pour protéger les cellules contre les infimes quantités de lumière UV émis par l&#39;halogènelampe, qui est utilisé lors de l&#39;acquisition DIC, il est recommandé de placer un filtre UV supplémentaire dans le trajet de la lumière. Lorsque vous utilisez la microscopie à fluorescence, il est préférable d&#39;image, les cellules moins fréquemment (par exemple toutes les 20 minutes) pour éviter les effets phototoxiques. L&#39;expérience est terminée lorsque toutes les cellules chargées au début de l&#39;expérience sont morts, qui dans des conditions normales peut prendre jusqu&#39;à 5 jours. Il est recommandé de vérifier régulièrement la mise au point des images lors de l&#39;expérience et si nécessaire ajuster. </li></ol>

<ol><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li>
<li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li>
<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIR2%2F3%2F4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li>
<li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li>
<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La méthode décrite ici microfluidique est un outil important de roman en recherche sur le vieillissement, car elle permet la production simple et automatisée de levure réplicatif données de durée de vie en combinaison avec l&#39;imagerie en continu à haute résolution. Ces attributs sont les principales améliorations par rapport aux possibilités expérimentales de la méthode de dissection classique, mais il ya quelques limites de la méthode qui doit être pris en compte. Notez que la durée de v...

Bourgeonnement levure est un organisme modèle important pour recherche sur le vieillissement 1. Jusqu&#39;à une date récente étude réplicative vieillissement des cellules de levure a été un processus laborieux nécessitant une méthode de dissection, dans lequel chaque bourgeon a été enlevé manuellement à partir de la cellule mère 2,3. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment présenté une configuration microfluidique roman en mesure de suivre les cellules mères individuels tout au long de leur durée de vie 4. Dans notre puce microfluidique, les cellules de levure sont piégées sous micropads gazeuses à base d&#39;élastomère (voir Figure 1). Un flux continu de milieu emporte cellules filles nouvellement formés et fournit les cellules avec des nutriments frais. Dans une expérience unique, jusqu&#39;à 50 cellules mères peuvent être contrôlés de manière entièrement automatique pendant toute leur durée de vie réplicative. En raison des excellentes propriétés optiques de la puce microfluidique, il est possible de surveiller simultanément les différents aspects de la biologie de la cellule de levure (par exemple, </em&gt; en utilisant des protéines fluorescentes). Par rapport à la méthode de dissection classique, la configuration microfluidique offre des avantages substantiels. Elle assure un environnement déterminée et constante pendant toute l&#39;expérience de vieillissement. Il ne nécessite aucun équipement spécialisé coûteux et peut être exécuté sur n&#39;importe quel microscope équipé d&#39;orientation automatisé et des capacités time-lapse ainsi que de contrôle de température pour la culture cellulaire. La production et le fonctionnement des puces microfluidiques peuvent être appris en quelques jours. En outre, les cellules peuvent être chargés directement à partir d&#39;une culture en croissance exponentielle, un avantage sur une autre méthode microfluidique récemment publié 5, qui nécessite biotinylation des cellules mères. Une Combiné avec imagerie à haute résolution, la méthode décrite ici peut être utilisé pour mesurer des changements progressifs dans la morphologie cellulaire, l&#39;expression de protéines et de localisation au cours de la levure du vieillissement d&#39;une manière sans précédent. La capacité desuivi à long terme de cellules individuelles offre également des possibilités uniques pour l&#39;étude du cycle cellulaire de la levure. Cette méthode a récemment été optimisée pour enlever la biotinylation du protocole 16, qui a été publié alors que ce manuscrit était à l&#39;examen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 élastomère </td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>Ce paquet contient une base PDMS et un agent de durcissement PDMS.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en verre 120/20 mm </td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>Verres de couverture 22x40 mm </td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Tough-Tags </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td>Feuille</tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>d’aluminium </td></tr><tr><td>Gobelet </td><td></td><td></td><td></td>jetable en plastique</tr> <tr><td>Pipette sérologique 5 ml </td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>Scotch </td><td>tape VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Pâte de Baysilone (silicones GE Bayer) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microbore en PTFE, 0.012"ID x 0.030"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>Appelé tube mince </td></tr><tr><td>Tube de microbore Tygon, 0.030"ID x 0.090"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>Scalpel </td></tr><tr><td> </td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Luer-Lok 50 ml </td><td>BD</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>seringues de 5 ml, Embout Luer </td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler </td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>Embouts Luer de calibre 20 </td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à seringue (taille des pores 0,20 &mu ; m) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter en acier inoxydable Plug, 20 ga x12 mm </td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri </td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Benchtop Nettoyeur UV-Ozone </td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pump 11 Elite </td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 moule maître en silicone (wafer) </td><td></td><td></td><td>Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant </td></tr><tr><td>Balance </td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide </td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur </td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante </td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>En option : Support métallique pour verre de protection (22x40 mm) </td><td></td><td></td><td>Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant </td></tr><tr><td>(Fluorescence) Microscope avec objectif 60x, autofocus, capacités time-lapse et de préférence un étage automatisé (contrôle XY motorisé) </td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;une configuration microfluidique simple, dans lequel les cellules de levure bourgeonnante simples peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. La puce microfluidique exploite la différence de taille entre les cellules de la mère et la fille en utilisant un tableau de micropads. Lors du chargement, les cellules sont piégées en dessous de ces micropads, parce que la distance entre le Micropad et le verre de couverture est similaire au diamètre d&#39;une cellule de levure (3-4 pm). Après la procédure de chargement, le milieu de culture est constamment balayé par la puce, ce qui non seulement crée un environnement constant et défini tout au long de l&#39;expérience, mais aussi de rincer les cellules filles émergents, qui ne sont pas retenues sous les patins en raison de leur petite taille. La configuration conserve les cellules mères si efficacement que dans une seule expérience jusqu&#39;à 50 cellules individuelles peuvent être surveillés de façon entièrement automatisée pour 5 jours ou, le cas échéant, plus longtemps. En outre, les excellentes propriétés optiques de la puce permettent élevéImagerie de résolution des cellules au cours de la totalité du processus de vieillissement.

Dans ce protocole, les cellules sont chargées dans la puce microfluidique directement à partir de la culture à mi-exponentielle. Pour déterminer si la répartition par âge des cellules piégées dans la puce microfluidique est similaire à celle de la culture avant le chargement, les cellules ont été colorées avec agglutinin de blé conjugué au FITC (WGA-FITC) pour visualiser les cicatrices de bourgeon. Comme on peut le voir dans la figure 3, le piégeage de cellules dans les micropads de la puce microfluidiq...

Nous décrivons ici le fonctionnement d&#39;un dispositif microfluidique qui permet l&#39;imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.

Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

L'objectif général de cette procédure est de suivre des cellules haploïdes de levure individuelles pendant toute leur durée de vie réplicative. La première étape consiste à fabriquer une puce microfluidique contenant un réseau de microplots. Ensuite, les cellules de levure sont chargées dans la puce microfluidique, et comme la hauteur de la zone située sous les microplots est similaire au diamètre d'une cellule de levure, les cellules s'y déposent.Ensuite, un flux continu de milieu frais est appliqué sur les cellules de levure piégées, et les cellules filles émergentes sont éliminées par le flux de milieu en microscopie à contraste de phase et en fluorescence. La microscopie permet de visualiser les changements de morphologie cellulaire ou des organites, l'expression protéique et la localisation des protéines pouvant survenir au cours du vieillissement des cellules de levure. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode classique de microdissection est qu'elle est moins laborieuse et qu'elle permet d'obtenir des images microscopiques continues sur le temps long, couvrant l'ensemble du temps de vie de cellules individuelles de levure.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le vieillissement réplicatif, elle peut également être utilisée pour des études nécessitant une observation microscopique continue sur de longues périodes. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car des précautions doivent être prises lors d'étapes spécifiques de la fabrication de la puce micro feic. En outre, le chargement des cellules dans la puce micro feic peut nécessiter une certaine expérience.Le moule en tranche de silicium est produit par lithographie douce. Pour plus de détails sur sa fabrication, veuillez consulter le protocole associé. Découpez un morceau de label résistant en fines bandes d’environ 0,5 millimètre sur trois millimètres.Avec un scalpel, placer soigneusement les bandes sur le moule en silicium, légèrement au-dessus de la structure du canal située entre les canaux d'entrée et le micro padre. Ensuite, recouvrir une boîte de Pétri en verre d'une double couche de papier d'aluminium et placer la tranche dans la boîte de Pétri. Le papier d'aluminium empêchera le PDMS de s'écouler entre la tranche et la boîte de Pétri lors de la fabrication des puces microfluidiques.Pour commencer la procédure de fabrication de puces microfluidiques, placez un gobelet en plastique vide sur la balance et tarer la balance. Versez 40 grammes de la base de PDMS dans le gobelet en plastique. Ajoutez l’agent de réticulation du PDMS dans un rapport poids à poids de un pour 10, ce qui correspond ici à environ quatre millilitres.À l’aide de la pipette en plastique jetable, mélanger soigneusement pendant plusieurs minutes ; il est important que le mélange soit bien homogénéisé afin d’assurer une polymérisation correcte ultérieure du PDMS. Verser le PDMS sur le dessus de la tranche dans la boîte de Pétri en verre. Le mélange de PDMS dans la boîte de Pétri contiendra de nombreuses bulles nécessitant une dégazéification.Placer le PDMS, la boîte de Pétri, dans un dessiccateur relié à une pompe à vide pendant environ 30 minutes, une fois toutes les bulles éliminées. Polymériser le PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec le wafer sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius pendant une heure, suivie de 65 degrés Celsius pendant une autre heure. Après les deux heures, retirer le wafer en aluminium et le PDMS polymérisé de la boîte de Pétri en verre.Détachez la feuille d'aluminium du PDMS à partir de l'arrière de la plaquette. Ensuite, soulevez délicatement la couche de PDMS depuis le haut de la plaquette. Placez la couche de PDMS à l'envers, avec les canaux orientés vers le haut, sur la paillasse, puis découpez soigneusement les conceptions individuelles de puces imprimées sur le PDMS à l'aide du scalpel.Essayez de conserver environ trois millimètres de PDMS autour des bords des canaux. L'étape suivante consiste à percer des trous dans le PDMS aux extrémités du canal d'entrée, du canal de sortie et du canal latéral, comme illustré sur ce schéma. Pour percer un trou, insérez complètement un embout d'aiguille de calibre 20 à travers le PDMS de manière rectiligne.Retirez la colonne de PDMS dans l'embout d'appât avant de sortir l'embout. Là encore, cela empêche la colonne de PDMS de bloquer le nouveau trou perforé. Une fois tous les trous perforés, nettoyez les surfaces de la puce des particules de poussière et des résidus de PDMS en appliquant un ruban adhésif dessus, puis en retirant immédiatement le ruban.De la même manière, nettoyez le verre de couverture auquel la puce sera fixée. Placez la puce et le verre de couverture sous la lampe UV d’un nettoyeur UV/ozone de banc, les faces devant être assemblées tournées vers la lampe, exposées à la lumière UV pendant six à huit minutes, puis superposez les surfaces exposées. Tapez doucement autour des bords de la puce afin de favoriser l’adhésion du PDMS au verre de couverture et d’éliminer les éventuelles bulles d’air.Ne pas taper sur le dessus de la structure du canal, car cela pourrait provoquer l'attachement des micro-pads au couvercle. Le verre également. Placer le dispositif microfluidique nouvellement fabriqué sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, vérifiez l'adhérence du verre de couverture au chip en PDMS en soulevant légèrement les bords du chip en PDMS. Si cela n'est pas possible, l'adhérence est réussie et le chip est prêt à l'emploi. Pour préparer le chip microfluidique au chargement cellulaire, placez le chip dans le support métallique avec du gel de silicone entre le verre du chip et les parties métalliques du support.Pour créer un joint étanche à l'eau, vissez doucement les écrous afin d'éviter de casser le verre. Connectez des tubes fins au canal latéral et au canal de sortie de la puce. L'utilisation de pinces facilite l'insertion des tubes dans les trous perforés.Remplir une seringue de 50 millilitres munie d'un verrouillage à leurre avec du milieu de culture. Retirer l'air de la seringue, puis la raccorder successivement à une seringue. Filtrer à l'aide d'un embout de leurre de calibre 20, d'un tube court et épais, et d'un tube fin.Placer la seringue dans la pompe à seringue et faire avancer rapidement la pompe jusqu'à ce que le tube fin soit complètement rempli de milieu. Insérer le tube fin relié à la seringue dans le canal d'entrée de la puce et laisser le milieu s'écouler à travers la puce à un débit de 10 microlitres par minute. Recueillir le milieu sortant de la puce dans une boîte de Pétri.Le milieu s'écoulera par le canal latéral. En raison de la différence de résistance entre le canal latéral constitué d'une grande étiquette robuste et le canal de sortie. Placez la puce sur la platine du microscope et focalisez le microscope sur les plots.Pour commencer cette procédure, fixez une seringue à embout Luer de 5 mL à un raccord Luer de calibre 20 et à un tube épais. Remplissez la seringue avec environ 1 mL de la suspension cellulaire destinée à être chargée dans la puce. La concentration cellulaire recommandée pour le chargement se situe entre 1 et 5 × 10⁶ cellules par millilitre.Réduisez le débit de la pompe à seringue à 0,5 microlitres par minute. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à charger les cellules dans la micropuce. Cela nécessite généralement un certain entraînement.Reliez la seringue contenant la suspension cellulaire au tube du canal de sortie. Chargez les cellules en appuyant doucement sur le piston de la seringue. Observez délicatement l'entrée des cellules et leur dépôt sous les micro-pads à travers l'oculaire ou l'écran d'ordinateur.Appliquez une pression continue sur le piston jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de cellules se soit déposé sous les pastilles. La charge optimale est d'une à trois cellules par pastille. Déconnectez la seringue utilisée pour le chargement des cellules et rincez le canal latéral pendant quelques minutes à des débits plus élevés afin d'éliminer les bulles d'air ou les cellules qui n'ont pas encore quitté la puce.Réduisez à nouveau le débit de la pompe à seringue à 0,5 microlitre par minute et fermez le canal latéral en le reliant à un tube épais contenant un bouchon de cathéter à son extrémité. Augmentez le débit de la pompe à seringue jusqu'à un débit final d'un à cinq microlitres par minute. Les débits peuvent varier selon le milieu et la souche de levure.Démarrez un film avec le microscope et les paramètres de la caméra adaptés à l'objectif de l'expérience. Voici un exemple de film en accéléré montrant une cellule E de type sauvage unique en cours de croissance sur du YPD. Des images du milieu ont été prises toutes les 10 minutes et la barre d'échelle indiquée représente cinq micromètres.La cellule produit un total de 30 bourgeons avant de mourir. La durée de vie réplicative peut être déterminée en comptant le nombre de bourgeons produits par une seule cellule mère. Ces données sont transformées en une courbe de durée de vie en traçant le pourcentage de cellules viables en fonction du nombre de bourgeons produits ou du nombre de générations.Cette figure montre un exemple de courbes de durée de vie obtenues pour une souche de levure de type sauvage et deux souches mutantes. La délétion du gène SER deux entraîne une durée de vie réduite, tandis que la délétion du gène FOB un conduit à une durée de vie allongée. La morphologie mitochondriale en fonction de l'âge peut être étudiée à l'aide du dispositif microfluidique.Une expérience de vieillissement a été réalisée avec des cellules de levure de type sauvage BY 7 42 exprimant ILV 3G FP, qui est dirigée vers les mitochondries. Sur cette figure, un exemple représentatif de changements associés à l'âge dans la morphologie mitochondriale dans une cellule unique est indiqué par la flèche blanche. Toutes les images sont à la même échelle, et la barre d'échelle représente cinq micromètres.Le deuxième film en accéléré montre une cellule unique exprimant ILV 3G FP provenant de l'expérience au cours de laquelle la morphologie mitochondriale en fonction de l'âge a été observée. Des images ont été prises toutes les 30 minutes et la barre d'échelle représente cinq micromètres. Cette dernière figure illustre les morphologies mitochondriales observées dans le même ensemble de cellules à différents âges de reproduction, avant la formation de leur premier bourgeon, après 10 bourgeonnements et avant la mort.Une image d'exemple de chaque classe de morphologie est incluse : tubulaire, tubulaire fragmenté, points et grands points. Les modifications morphologiques observées chez les cellules d'âge intermédiaire ressemblent à celles décrites précédemment. En surveillant continuellement les cellules pendant qu'elles se divisent, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le vieillissement réplicatif de la levure, telles que : pourquoi une cellule de levure vieillit-elle, quelles modifications phénotypiques se produisent, et comment celles-ci influencent-elles la durée de vie réplicative de la levure ?Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez savoir comment créer vos propres micropuces et étudier le vieillissement réplicatif des cellules en utilisant pratiquement tout microscope fluorescent.

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Vieillissement chronologique dans la levure se réfère à la perte de la viabilité cellulaire associée avec le temps dans la phase stationnaire. Nous décrivons ici une méthode à haut débit pour déterminer quantitativement la durée de vie de la levure chronologique.

Quantifier Life Span levure chronologique par excroissance de cellules âgées

Dans cet article nous présentons un protocole général pour la mesure de la durée de vie réplicative des cellules mères de la levure.

Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule...

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Nous décrivons ici un ensemble d'essais sur la mutation d'ADN qui peuvent être combinés avec le modèle de la levure chronologique durée de vie à étudier les gènes / voies de régulation ou de contribuer à l'instabilité ADN génomique au cours du vieillissement.

Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l'âge des cellules mères afin d'identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues.

La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans Saccharomyces cerevisiae

Nous fournissons une méthode de base reproductible pour la microscopie à long terme du cycle de vie sexuel de la levure à fission. Avec des ajustements mineurs décrits, le protocole présenté permet de concentrer la recherche sur différentes étapes du processus de reproduction.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

Cet article présente un protocole optimisé pour la production de puces microfluidiques et la mise en place d'expériences microfluidique pour mesurer la durée de vie et phénotypes cellulaires de cellules de levure unique.

L&#39;utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.

L&#39;imagerie à haute résolution et d&#39;analyse de l&#39;individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

Découvrez l'imagerie microfluidique haute résolution du vieillissement réplicatif chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet le suivi continu des changements morphologiques et de l'expression protéique au cours du vieillissement cellulaire.

Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

Explorer plus de vidéos