Name: ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez la méthode ODELAY pour quantifier les phénotypes de croissance cellulaire chez la levure par microscopie time-lapse. Cette technique haut débit permet d'observer l'hétérogénéité des populations et les effets des perturbations génétiques.

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Les auteurs reconnaissent le soutien de ce travail par les subventions U54 RR022220 et P50 GM076547 à JDA des National Institutes of Health des États-Unis. FDM est un boursier postdoctoral avec les Instituts de recherche en santé du Canada. Nous remercions également le Centre luxembourgeois pour la biomédecine des systèmes et l&#39;Université du Luxembourg pour le soutien.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le dosage ODELAY comporte plusieurs points critiques pour assurer des mesures phénotypiques reproductibles et fiables. Le premier point critique est la préparation constante des cultures de levure. Il faut prendre soin de récolter les cellules de levure de la croissance logarithmique. Si les cultures sont saturées, leur hétérogénéité de population sera augmentée, ce qui peut nuire à l&#39;hétérogénéité causée par des facteurs génétiques ou environnementaux ( par exemple, source de carbone) 11 . Le deuxième point critique est la préparation uniforme des médias. En général, un grand volume de solution multimédia 10X devrait être généré puis utilisé dans le temps pour minimiser les effets de lot. Formuler des supports par poids, dans la mesure du possible, contribue à améliorer la consistance du milieu dans le temps en assurant la surveillance de la densité d&#39;agar et de la teneur globale en eau de l&#39;agarose. Le troisième point critique implique de minimiser ou d&#39;éliminer toute déformation mécanique de l&#39;agarose moiDia. La déformation mécanique des milieux se produira le plus souvent lors de la séparation de l&#39;agarose des glissières de verre. Comme pour de nombreuses techniques de laboratoire, une pratique est nécessaire pour maîtriser cette étape. La variation du temps de latence tel que représenté sur la figure 4 est souvent liée à l&#39;un des trois facteurs: la déformation mécanique du milieu d&#39;agarose, la variation de l&#39;épaisseur d&#39;agar moulée ou une source de lumière instable. Si le milieu d&#39;agarose varie en Z-hauteur à travers le réseau tacheté, la variation de hauteur peut submerger la portée de la routine de mise au point automatique, ce qui entraîne une légère désincitation des images initiales. Pour cette raison, vérifiez la hauteur de l&#39;accent sur plusieurs points au centre et le long des bords de la matrice pour s&#39;assurer que la routine de mise au point automatique possède une Z-range suffisante pour trouver la mise au point. Si nécessaire, utilisez le panneau Autofocus pour augmenter la plage de mise au point et augmenter le nombre d&#39;étapes de mise au point. Une troisième condition possibleL&#39;ion qui peut conduire à une focalisation médiocre est une source de lumière instable ou scintillante, qui peut perturber le score de mise au point calculé pour une hauteur Z spécifique. Les ampoules halogènes au tungstène ont tendance à clignoter avant que les ampoules ne brûlent. L&#39;effet d&#39;une focalisation médiocre est observé dans un exemple où les courbes de croissance s&#39;écoulent entre le premier et le deuxième point de temps ( Figure 5 A ), tandis que l&#39;endroit adjacent n&#39;a pas le même trempe ( Figure 5 B ). Dans ce cas, la mauvaise condition de focalisation a été atténuée en remplaçant la source de lumière halogène au tungstène. En pratique, les auteurs ont constaté que pour réduire le scintillement des ampoules halogènes à 100W de tungstène, les ampoules doivent être remplacées toutes les 500 h ou environ tous les 2 mois lorsque les microscopes sont très utilisés. Pour éviter des problèmes de focalisation médiocres à partir d&#39;une ampoule scintillante, remplacer souvent la source de lumière halogène de tungstène ou remplacer l&#39;ampoule halogène par une source de diode. UnL&#39;exemple d&#39;un ensemble de données qui montre une variation faible des temps de doublement ainsi que des temps de latence plus uniformes est illustré à la figure 6 . Cet ensemble de données a été pris avec un illuminateur de diodes qui fournit un éclairage plus stable au fil du temps lors de l&#39;autofocus. Bien que bon nombre des points mentionnés ici pour optimiser la préparation des médias semblent être évidents, dans la littérature, les écrans à grande échelle ne se reproduisent pas correctement 8 , 11 . Par conséquent, nous avons décrit avec soin la préparation des cultures et des milieux d&#39;agarose afin que des écrans phénotypiques plus reproductibles puissent être générés. Le dosage ODELAY est actuellement limité en débit par rapport aux essais basés sur l&#39;épinglage tels que les tableaux génétiques synthétiques ou le test Scan-O-Matic. Bien que ces méthodes augmentent le nombre de souches mesurées, elles n&#39;ont pas la capacité de résoudre des cellules individuelles.Nd ne peut donc pas mesurer l&#39;hétérogénéité de la population que nous observons dans les souches de levure clonales. L&#39;origine de cette hétérogénéité de la population n&#39;est pas actuellement comprise, mais la fusion de la technologie et du calcul, comme démontré ici, offre une opportunité d&#39;aborder objectivement les mécanismes cellulaires sous-jacents 12 . Les auteurs souhaitent noter que ODELAY n&#39;est actuellement optimisé que pour une marque et type de microscope spécifique. La modification d&#39;ODELAY pour d&#39;autres systèmes de microscope est simple mais nécessite une connaissance de l&#39;API open source 13 . Cependant, l&#39;API ainsi que les scripts ODELAY sont écrits pour être facilement adaptés à différents systèmes et essais expérimentaux. Alors que ODELAY a été initialement développé pour la levure, nous avons pu l&#39;utiliser sans modification pour observer la croissance de Mycobacterium smegmatis . L&#39;observation des autres microorganismes formant des colonies estPossible avec des modifications apportées au code source fourni 11 . En général, ODELAY est un outil puissant et flexible pour comparer les microorganismes cultivés dans différentes conditions environnementales et perturbations génétiques.

Les phénotypes de croissance des microorganismes sont un indicateur important de leur aptitude génétique sous-jacente à une condition environnementale donnée. La croissance est classiquement ségrégée en 3 régimes de croissance différents: lag-phase, log-phase et croissance de la phase stationnaire 1 . Chaque phase de croissance peut révéler différents aspects de la condition physique qui dépendent de diverses conditions environnementales et génétiques. Par exemple, le temps de décalage ou la durée pendant laquelle un organisme passe en phase de latence avant le début de la croissance exponentielle, peut être indicatif de la capacité d&#39;un organisme à répondre à des conditions environnementales altérées 2 . Le temps de doublage pendant la croissance de la phase logarithmique, la mesure la plus fréquente de l&#39;aptitude cellulaire, révèle l&#39;efficacité globale de la capacité d&#39;un organisme à se diviser en métabolisant et en utilisant des matériaux environnementaux pour la réplication. La phase stationnaire, où la croissance après la phase logarithmique est rapidement réduite, est un autre indicateur de conditionnement physique, qui est régulierUtilisé comme critère de croissance dans les essais de croissance de levure à base de taches. Plusieurs tests de croissance de levure sont actuellement disponibles et considérés comme des méthodes standard pour évaluer les phénotypes de croissance dans la levure 3 , 4 , 5 . Ces analyses reposent principalement sur des méthodes de culture de levure sur des milieux solides ou liquides. Sur les milieux solides, les essais d&#39;épinglage des colonies transfèrent un petit nombre de cellules sur de la gélose solide avec une broche, et les cellules de levure peuvent pousser pendant une période de temps définie. Les colonies sont ensuite imagées et leurs tailles sont comparées à un point terminal terminal 6 . Ces essais de fixation de colonies se sont révélés robustes et évolutifs pour générer des écrans génomiques. Plus récemment, l&#39;imagerie périodique utilisant des scanners à plat et des caméras à réflexion unique (SLR) ont été incorporées dans ces tests pour enregistrer la croissance des colonies au fil du temps 7 , 8, 9 . Cependant, la résolution de ces dispositifs les empêche de détecter des cellules individuelles et, par conséquent, ces essais d&#39;épuration de colonies n&#39;observent pas directement le retard et ne peuvent pas observer de variation entre les cellules individuelles qui se développent en colonies. Des tests de croissance à base de liquide ont également été utilisés pour réaliser des écrans 3 du génome. Le couplage d&#39;un test de croissance liquide avec une microscopie temporelle a révélé une hétérogénéité de la population au moment du doublement des cellules individuelles génétiquement identiques, ce qui offre une perspective importante pour la compréhension de la régulation génétique et de l&#39;adaptation environnementale. Cependant, ce dosage ne mesure pas d&#39;autres aspects de la croissance tels que le temps de latence et la capacité de charge 10 . Ici, nous présentons une méthode pour caractériser les trois phases de croissance des microorganismes formant des colonies sur des milieux solides en utilisant un dosage, nous appelons ODELAY 11 . ODELAY se compose d&#39;utiliUne microscopie temporelle à haut débit zing pour enregistrer des images de cellules simples qui se développent dans des colonies sur des supports solides. Cette population de cellules individuelles se développant dans des colonies révèle l&#39;hétérogénéité de la population sous-jacente, qui n&#39;est pas détectée par d&#39;autres mesures moins sensibles telles que le pointage terminal. Nous démontrons la méthode sur la levure, mais ODELAY peut être appliqué à tout organisme qui présente un contraste dans le microscope à champ lumineux.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Force du gel (1 %) 1,2 g/cm²</td></tr><tr><td>Extrait de levure peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Mélange complet de supplément (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 3350 (poids molaire moyen 3000-3700)</td><td>Souche de levure SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td> BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Souche de levure BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes Falcon</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 caisse</td></tr><tr><td>15 mL Tubes Falcon</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 pouces 1,0 mm d’épaisseur lames 1/2 brut</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96 puits à fond plat</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Hydra Robot de manipulation de liquides</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Robot de manipulation de liquides</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL pointes Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Lecteur de plaques</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif Leica 10X/0.3NA</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Caméra</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB avec boîte à outils de traitement d’image</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Contrôle du microscope (scripts MATLAB et interface graphique)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY pour scripts et logiciels Matlab</td></tr><tr><td>ODELAY Chambre de microscope</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY pour les dessins mécaniques</td></tr><tr><td>Moules de</td><td></td><td></td> gélose ODELAY <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY pour dessins de moules</td></tr></tbody></table>

odelay: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Les phénotypes de croissance des microorganismes sont un indicateur important de leur aptitude génétique sous-jacente et peuvent être séparés en 3 régimes de croissance: lag-phase, phase logarithmique et phase stationnaire. Chaque phase de croissance peut révéler différents aspects de la condition physique liés à diverses conditions environnementales et génétiques. Des mesures quantitatives et de haute résolution des 3 phases de croissance sont généralement difficiles à obtenir. Ici, nous présentons une méthode détaillée pour caractériser toutes les 3 phases de croissance sur les milieux solides à l&#39;aide d&#39;un dosage appelé Évaluation doublante à une cellule de Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifie les phénotypes de croissance des cellules individuelles qui se développent dans des colonies sur des milieux solides en utilisant une microscopie temporelle. Cette méthode peut observer directement l&#39;hétérogénéité de la population avec chaque paramètre de croissance dans des cellules génétiquement identiques qui se développent dans des colonies. Cette hétérogénéité de la population offre une perspective unique pour la compréhension de la régulation génétique et épigénétique et des réponses àLes perturbations génétiques et environnementales. Alors que la méthode ODELAY est démontrée à l&#39;aide de levure, elle peut être utilisée sur tout microorganisme formant une colonie visible par microscopie à champ clair.

<html> Des exemples d&#39;images de la levure en croissance en microscopie temporelle sont illustrés à la Figure 3B . Après avoir traité les images temporelles, un ensemble de données représentatif comparant les souches de levure BY4741 et BY4742 est illustré à la figure 4 . Dans cet exemple de base de données, il y a très peu de variations dans le temps de doublement entre différentes positions sur la plaque. Si le milieu d&#39;agarose est mal préparé, un écart évident en temps de doublement et en temps de retard serait évident dans les positions ponctuelles qui coïncident avec la région déformée du gel d&#39;agarose. Alors que les temps de doublement semblent relativement uniformes, cet exemple montre des variations dans les mesures du temps de latence. Un ensemble de données plus cohérent est illustré à la Figure 6 . Dans cet ensemble de données, le temps de décalage et le temps de doublement sont uniformes. Fichiers / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Assemblage du moule Agar. Les composants du moule d&#39;agar sont indiqués en ( A ). Assembler la base comme indiqué sur ( B ), puis serrer la base avec de petits agrafes. Placez les pièces verticales plus longues dans la cavité de la base ( C ), puis faites glisser les glissières sur le moule comme indiqué en ( D ). Une vue latérale montrant l&#39;angle du moule et l&#39;orientation du moule kerf nécessaire pour une séparation constante de la gélose de la glissière en verre ( E ). Notez la position du pouce et des index, ainsi que la ligne droite de la gélose séparant de la glissière ( F ) et notez la flèche horizontale. La ligne de séparation doit se déplacer uniformément dans la direction des flèches verticales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figure 2: méthode de sonication et spotting. Sonicate la plaque dans de l&#39;eau glacée et utilisez un porte-godet centrifuge pour aider à supporter la plaque ( A ). Posez les plaques des étapes 3.8.1 pour repérer sur la plaque d&#39;agarose ( B ). Aussi, organiser les pointes afin que la boîte de pointe la plus à gauche ait une extrémité à la position C10, puis quatre autres extrémités avec leurs extrémités coupées afin qu&#39;elles ne bloquent pas le porte-plaque ( C ). Placez les conseils restants dans quatre boîtes afin que les positions intérieures de 24 pointes soient occupées ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3: interface utilisateur graphique ODELAY. Une capture d&#39;écran de l&#39;interface utilisateur graphique pour &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Cette interface permet de surveiller la caméra et d&#39;ajuster les paramètres d&#39;éclairage du microscope pour les modes epifluorescent et champ lumineux. Les flèches rouges indiquent les boutons Focus et Transmitted qui activent la caméra pour acquérir rapidement des images et ouvrent l&#39;obturateur lumineux transmis respectivement. Les flèches bleues sont utilisées pour déplacer le plateau pour l&#39;origine, puis en définissant l&#39;origine avec le bouton &quot;Go Origin&quot; et le bouton &quot;Set&quot;. Les flèches vertes indiquent &quot;Reset&quot; et &quot;ODELAY !!!&quot; Les boutons qui réinitialisent les modes d&#39;image ODELAY aux conditions actuelles et initient la collection d&#39;images ODELAY. Images temporelles de levure poussant sur un milieu solide à 0, 3, 6 et 9 h après la tache ( B ). Une capture d&#39;écran de l&#39;interface utilisateur graphique pour &quot;ODELAY_IPT.m&quot; ou th<html> E ODELAY outil de traitement d&#39;image ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figure 4: Exemple de sortie ODELAY. Cet ensemble de données compare les contraintes BY4741 et BY4742 sur les médias YPD. Ce chiffre est un exemple d&#39;une glissière d&#39;agarose bien préparée; Cependant, les paramètres de mise au point automatique ne sont pas optimales. Les données présentées dans chaque colonne, de gauche à droite, sont: la capacité de charge dans Log 2 de la zone de colonie; Temps de doublement, donné en min. Et le temps de retard, donné en min. Dans cet exemple, le temps de doublement de toutes les taches sur la gélose se glisse bien avec une petite quantité de temps de doublement augmenté vers la colonne. Cependant, le temps de retard varie considérablement dans cet ensemble de données._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figure 5: Exemples de courbes de croissance. Cet exemple démontre que la mauvaise mise au point initiale peut entraîner une augmentation du temps de décalage estimé (t lag ) ( A ), tandis que la position adjacente montre un temps de décalage plus court ( B ). T d est le temps de doublement en min, et t lag est le temps de retard dans min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figure 6: Exemple d&#39;expérience de test bien exécuté. Un eXample de la souche BY4742 testée après avoir remplacé une ampoule halogène en tungstène par un illuminateur à diodes et en veillant à ce que la mise au point automatique soit correctement réglée. Tous les temps de doublement semblent se chevaucher bien et les temps de retard semblent être cohérents. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Nous présentons une méthode pour quantifier les phénotypes de croissance de cellules de levure individuelles à mesure qu&#39;elles se développent dans des colonies sur des milieux solides en utilisant une microscopie temporelle, une évaluation doublée d&#39;une cellule de Living Arrays of Yeast (ODELAY). L&#39;hétérogénéité des populations de cellules génétiquement identiques qui se développent dans des colonies peut être directement observée et quantifiée.

ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

L'objectif général de l'ODALAY est de mesurer les phénotypes de croissance de cellules individuelles se développant en colonies, de manière hautement performante. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en microbiologie, en génétique et en biologie des systèmes, telles que les effets des perturbations génétiques et des interactions médicamenteuses sur les phénotypes de croissance de tout microorganisme formant des colonies. Le principal avantage de l'ODALAY est qu'il permet au chercheur d'observer directement et de quantifier l'hétérogénéité de la population parmi un grand nombre d'individus.Avant de monter le moule à gélose, nettoyez les moules en acrylique avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les à l’aide d’air comprimé. Il existe trois pièces inférieures et deux pièces verticales. Pour commencer le montage du moule à gélose, prenez les trois pièces inférieures et assemblez-les de manière à ce que les deux pièces identiques encadrent la troisième pièce.Utilisez deux petits clips à levier pour fixer les pièces de base de chaque côté. Placez les montants verticaux dans le moule en vous assurant que la courbe laser est correctement positionnée. Déposez une lame de verre nettoyée et séchée sur le moule et maintenez-la en place tout en plaçant une deuxième lame de verre de l'autre côté.Fixez l'ensemble avec un trombone plus grand. Fixez les deux lames avec des trombones plus grands en veillant à ce que chaque trombone supérieur soit en contact avec la lame de verre, chevauchant l'acrylique. Avant de remplir le moule assemblé avec de l'agar fondu, assurez-vous que les bords sont étanches en pipettant environ 70 microlitres de milieu d'agar fondu le long du côté intérieur du moule.Remplir le moule sans emprisonner de bulles d'air en pipettant lentement l'agar fondu le long du bord du moule. Une fois le moule rempli, le laisser refroidir à une température ambiante d'environ 23 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. L'étape suivante consiste à séparer le moule.Commencez par retirer le trombone du bas. Ensuite, retirez la partie inférieure du moule, constituée des trois pièces superposées. Tenez les lames en les comprimant, puis retirez soigneusement les trombones. Placer le moule sur le bord de la paillasse de manière à ce que le côté du moule portant le point bleu soit orienté vers le haut. Placer les deux pouces sous l'acrylique et les premières phalanges des doigts sur le dessus, vers le bord intérieur du moule, puis pousser lentement et prudemment vers le haut avec les pouces contre le moule, comme si l'on faisait pivoter l'espacement du moule autour de son bord inférieur. Appliquer une pression constante mais progressivement croissante.Une rupture et une bulle d'air doivent apparaître le long de la ligne où le verre supérieur recouvre l'espacement du moule. Une fois la ligne de rupture initiale observée, continuer à pousser vers le haut avec les deux pouces en appliquant une pression constante. L'agar devrait commencer à se détacher du verre.Continuez à pivoter le moule vers le haut. Lorsque le verre se détache complètement, saisissez-le et retirez-le entièrement du moule. Ensuite, retirez l'autre pièce du moule en utilisant un mouvement similaire pour la soulever sans déplacer l'agar. Placer les lames dans une boîte stérile pour embouts avec un peu d'eau stérile de haute pureté au fond. Fermer la boîte et conserver à 4 degrés Celsius toute la nuit pour une utilisation le jour suivant. Commencer cette procédure en préparant les souches dans une plaque de 96 puits comme décrit dans le protocole écrit.Utiliser un lecteur de plaques pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres de chaque culture. Ensuite, utiliser un protocole de dilution automatisé afin de diluer les cultures dans la plaque jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres d'environ 0,1. Une fois le programme de dilution configuré, charger les plaques, les tubes et les pointes sur la station de travail robotisée selon le plan de disposition du plateau.Cliquez sur le bouton de lecture pour exécuter le programme de dilution. Sélectionnez le bon nombre de pointes de 50 microlitres et le bon nombre de pointes de 300 microlitres. Une fois la dilution terminée, retirez la plaque de dilution du robot et incubez la plaque à 30 degrés Celsius en maintenant l'humidité pour éviter que la plaque ne s'assèche pendant cinq à six heures.Environ une à deux heures avant la fin de l'incubation de la boîte de culture, allumez les chambres d'incubation du microscope et laissez-les s'équilibrer à 30 degrés Celsius. Diluez la culture une deuxième fois jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,01 et 0,02 en utilisant le même protocole de dilution automatisé. Recouvrez la plaque de dilution d'un scellé métallique pour congélateur et soumettez-la à une sonication dans un bain de glace pendant 30 secondes, la plaque flottant dans de l'eau glacée.Étiquetez quatre plaques à 96 puits plats respectivement comme un, deux, trois et quatre. Transférez 150 microlitres de chaque culture soniquée à partir de la plaque de dilution vers les plaques à fond plat en suivant ce schéma. Puits A1 à D6 vers les puits C4 à F9 de la plaque un.Puits A7 à D12 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Deux. Puits E1 à H6 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Trois. Et puits E7 à H12 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Quatre.Pour commencer cette procédure, placez correctement la lame d'agarose dans la chambre à lame. Ensuite, placez les plaques à 96 puits à fond plat sur la table selon leur quadrant. Les plaques Une, Deux, Trois et Quatre de gauche à droite.Placer des pointes dans quatre boîtes à pointes vides de manière à ce que les 24 puits intérieurs de chaque boîte soient occupés par des pointes. Dans une cinquième boîte, placer une pointe à la position C10 et des pointes dont l'extrémité a été coupée aux positions A1, A12, H1 et H12. Ces quatre pointes coupées assureront la stabilité de la pince de la plaque à pointes.Placer la première pointe de perçage sur le site de départ du programme de contrôle robotisé de dépôt pour percer un trou dans l'agarose, qui sera utilisé ultérieurement pour aligner les coordonnées d'origine. Placer la plaque un sur le robot de manipulation liquide pour déposer le premier quadrant. Retirer le couvercle et poursuivre le programme de dépôt.Vérifiez que toutes les gouttes sont bien présentes. Jetez les pointes utilisées dans le conteneur de déchets dangereux et placez des pointes neuves sur le robot. Attendez environ 30 secondes pour que les gouttes sèchent jusqu'à un diamètre d'environ un millimètre, puis poursuivez le programme.Remplacez la plaque un par la plaque deux et poursuivez le programme de dépôt. Lorsque les quatre quadrants ont été inoculés et que les gouttes sont sèches, remettez le couvercle sur la chambre à lames et retournez l'appareil. Placez une lame de verre sur la face supérieure de la chambre à lames.Chargez d'abord la chambre à lame dans le microscope. La microscopie par intervalles est réalisée en exécutant un script conçu sur mesure. Cliquez sur l'obturateur pour ouvrir l'obturateur de lumière transmise, puis sur le bouton de mise au point pour activer le taux élevé de la caméra.Cliquez sur « Go Origin » et déplacez la platine pour trouver la marque d'origine qui a été perforée dans l'agar, puis déplacez-vous légèrement vers la droite pour focaliser sur les cellules déposées dans la zone E7. Revenez à la perforation d'origine et centrez-la dans le champ de vision. Réglez l'origine à cette valeur en appuyant sur le bouton « Set ». Déplacez-vous jusqu'à la position H18 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement.Ensuite, passez à la position L7 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Enfin, déplacez-vous à la position E7 et effectuez la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Vérifiez la mise au point au centre ainsi qu’aux bords aux positions E12, H12 et L12, et ajustez la plage de mise au point automatique si les valeurs z de mise au point indiquées par la valeur z dépassent la plage de mise au point automatique par défaut, en valeur absolue.Appuyez sur le bouton Réinitialiser, puis sur ODELAY. Choisissez le répertoire où enregistrer les données. Le microscope collectera les données pendant 48 heures ou jusqu'à la fermeture du programme.Ces images représentatives en laps de temps montrent des cellules de levure en cours de croissance sur milieu solide aux temps zéro heure, trois heures, six heures et neuf heures après l'ensemencement. On observe ici un jeu de données représentatif comparant deux souches de levure après traitement des images en laps de temps. Les temps de doublement relativement uniformes reflètent la préparation soigneuse de la lame d'agarose, mais les temps de latence varient considérablement en raison de paramètres de mise au point automatique non optimaux.Un ensemble de données plus cohérent est présenté ici, dans lequel tous les temps de doublement semblent bien se superposer et les durées de latence apparaissent constantes. Une fois maîtrisée, la mise en place d'ODELAY peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Les étapes les plus critiques pour des mesures ODELAY reproductibles sont la préparation homogène du milieu et l'évitement de toute déformation mécanique du milieu lors de la séparation des lames.ODELAY est un dosage très sensible. Par exemple, il peut détecter des défauts de croissance chez des souches de levure sensibles à la température à température ambiante, alors que les dosages classiques basés sur des spots nécessitent la culture de la levure à 37 degrés Celsius pour révéler un défaut de croissance. Bien qu'ODELAY ait été développé chez la levure, la méthode s'applique à tout organisme formant des colonies, y compris les agents pathogènes, afin d'explorer un large éventail de conditions environnementales et génétiques pour comprendre le comportement des micro-organismes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'ODELAY afin de mesurer les phénotypes de croissance de micro-organismes unicellulaires formant des colonies sur milieu solide. N'oubliez pas que le travail avec des micro-organismes peut présenter des risques, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés aux organismes étudiés doivent toujours être prises.

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