ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

L’objectif global d’ODELAY est de mesurer les phénotypes de croissance des cellules individuelles qui se transforment en colonies à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en microbiologie, en génétique et en biologie des systèmes, telles que les effets des perturbations génétiques et des interactions médicamenteuses sur les phénotypes de croissance de tout micro-organisme formant une colonie. Le principal avantage d’ODELAY est qu’il permet au chercheur d’observer et de quantifier directement l’hétérogénéité de la population parmi un grand nombre d’individus.

Avant d’assembler le moule à gélose, nettoyez les moules en acrylique avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les à l’air pulsé. Il y a trois pièces inférieures et deux pièces verticales. Pour commencer l’assemblage du moule à agar, prenez les trois pièces inférieures et assemblez-les de manière à ce que les deux pièces identiques prennent en sandwich la troisième pièce.

À l’aide de deux petites pinces à reliure, fixez les pièces de base de chaque côté. Placez les montants dans le moule en vous assurant que la courbe laser est correctement positionnée. Placez une lame de verre nettoyée et séchée sur le moule et maintenez-la en place tout en plaçant une deuxième lame de verre de l’autre côté.

Fixez l’ensemble à l’aide d’une pince à reliure plus grande. Serrez les deux lames avec des pinces à reliure plus grandes, en vous assurant que chaque pince à reliure supérieure est en contact avec la lame de verre chevauchant l’acrylique. Avant de remplir le moule assemblé avec de la gélose fondue, assurez-vous que les bords sont scellés en pipetant environ 70 microlitres de gélose fondue le long de la face intérieure du moule.

Remplissez le moule sans piéger les bulles d’air à l’intérieur en pipetant lentement la gélose fondue le long du bord du moule. Une fois le moule rempli, laissez-le refroidir à une température ambiante d’environ 23 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. L’étape suivante est la séparation des moules.

Commencez par retirer la pince de reliure inférieure. Retirez ensuite la partie inférieure du moule qui se compose des trois morceaux pris en sandwich. Tenez les diapositives en les comprimant, puis retirez soigneusement les pinces de reliure.

Placez le moule sur le bord du plan de travail de manière à ce que le côté du moule avec le point bleu soit vers le haut. Placez les deux pouces sous l’acrylique et les premiers doigts sur le dessus vers le bord intérieur du moule et poussez lentement et soigneusement vers le haut avec les pouces contre le moule comme si vous faisiez pivoter l’entretoise du moule autour de son bord inférieur. Appliquez une pression constante mais augmentant lentement.

Une rupture et une bulle d’air doivent apparaître le long d’une ligne où le verre supérieur recouvre l’entretoise du moule. Après avoir vu la ligne de rupture initiale, continuez à pousser vers le haut avec les deux pouces et appliquez une pression constante. La gélose doit commencer à se détacher du verre.

Continuez à faire pivoter le moule vers le haut. Lorsque le verre est complètement libre, saisissez-le et retirez-le complètement du moule. Retirez ensuite l’autre pièce du moule en utilisant un mouvement similaire pour libérer la pièce sans déplacer l’agar.

Placez les lames dans une boîte d’embouts stériles avec de l’eau stérile de haute pureté au fond. Fermez la boîte et conservez-la à 4 degrés Celsius pendant la nuit pour une utilisation le lendemain. Commencez cette procédure en préparant les souches dans une plaque à 96 puits comme décrit dans le protocole de texte.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurer la densité optique à 600 nanomètres de chaque culture. Ensuite, utilisez un protocole de dilution automatisé pour diluer les cultures dans la plaque à une densité optique à 600 nanomètres d’environ 0,1. Une fois le programme de dilution mis en place, installez les plaques de charge, les tubes et les pointes sur le pont du robot de manipulation de liquides, comme indiqué par la disposition du pont.

Cliquez sur le bouton de lecture pour exécuter le programme de dilution. Sélectionnez le bon nombre d’embouts de 50 microlitres et le bon nombre d’embouts de 300 microlitres. Lorsque la dilution est terminée, retirez la plaque de dilution du robot et cultivez la plaque à 30 degrés Celsius en maintenant l’humidité pour éviter que la plaque ne se dessèche pendant cinq à six heures.

Environ une à deux heures avant la fin de l’incubation de la plaque de culture, allumez les chambres d’incubation du microscope et laissez-les s’équilibrer à 30 degrés Celsius. Diluer une seconde fois la culture à une densité optique à 600 nanomètres de 0,01 à 0,02 en utilisant le même protocole de dilution automatisée. Couvrez la plaque de dilution avec un joint de congélation en métal et faites du sonicate dans un bain de glace pendant 30 secondes avec la plaque flottant dans de l’eau glacée.

Étiquetez quatre plaques à fond plat de 96 puits comme un, deux, trois et quatre. Transférez 150 microlitres de chaque culture soniquée de la plaque de dilution vers les plaques à fond plat en suivant ce modèle. Puits A1 à D6 dans les puits C4 à F9 de la première planche.

Puits A7 à D12 dans les puits C4 à F9 de la planche deux. Puits E1 à H6 dans les puits C4 à F9 de la planche trois. Et les puits E7 à H12 dans les puits C4 à F9 de la planche quatre.

Pour commencer cette procédure, placez correctement la lame d’agarose dans la chambre de la lame. Ensuite, placez les 96 plaques à fond bien plat sur la table dans l’ordre de leur quadrant. Planches Un, Deux, Trois et Quatre de gauche à droite.

Disposez les pointes dans quatre boîtes de pointes vides de sorte que les 24 puits intérieurs de chaque boîte de pointes soient occupés par des pointes. Dans une cinquième boîte, placez une pointe en position C10 et des pointes avec leur extrémité coupée dans les positions A1, A12, H1 et H12. Ces quatre pointes coupées assureront la stabilité de la pince de la plaque de pointe.

Placez le premier poinçon de pointe dans le site de départ du programme de repérage de contrôle du robot pour percer un trou dans l’agarose qui sera utilisé plus tard pour aligner les coordonnées d’origine. Placez la première plaque sur le robot de manipulation de liquides pour repérer le premier quadrant. Retirez le couvercle et poursuivez le programme de détachage.

Assurez-vous que tous les endroits sont présents. Videz les pointes utilisées dans le récipient pour matières dangereuses et placez les pointes fraîches sur le robot. Attendez environ 30 secondes que les taches sèchent à environ un millimètre de diamètre, puis continuez le programme.

Remplacez la première plaque par la deuxième planche et continuez le programme de repérage. Lorsque les quatre quadrants ont été repérés et que les taches sont sèches, replacez le couvercle de la chambre de la diapositive et retournez l’appareil. Placez une lame de verre sur la face supérieure de la chambre de diapositive.

Chargez d’abord la chambre de lame dans le microscope. La microscopie Time Lapse est réalisée en exécutant un script personnalisé. Cliquez sur l’obturateur pour ouvrir l’obturateur en lumière transmise, puis sur le bouton de mise au point pour lancer la fréquence élevée de la caméra.

Cliquez sur Go Origin" et déplacez l’étape pour trouver la marque d’origine qui a été poinçonnée dans la gélose puis déplacez-vous légèrement vers la droite pour vous concentrer sur les cellules repérées dans la zone E7. Revenez au poinçon d’origine et centrez-le dans le champ de vision. Réglez l’origine sur cette valeur en appuyant sur le bouton Définir. Déplacez-vous jusqu’à la position H18 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement.

Passez ensuite à la position L7 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Enfin, déplacez-vous vers la position E7 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Vérifiez la mise au point au centre et sur les bords aux points E12, H12 et L12 Ajustez la plage de mise au point automatique si les valeurs z de mise au point indiquées par la valeur z sont supérieures à plus ou moins à plus ou moins à la plage de mise au point automatique.

Appuyez sur le bouton « Réinitialiser », puis appuyez sur ODELAY. Choisissez le répertoire dans lequel vous souhaitez enregistrer les données. Le microscope recueillera des données pendant 48 heures ou jusqu’à la fin du programme.

Ces images timelapse représentatives montrent des cellules de levure se développant sur un milieu solide à l’heure zéro, trois heures, six heures et neuf heures après le repérage. Voici un ensemble de données représentatif comparant deux souches de levure après le traitement des images timelapse. Les temps de doublage relativement uniformes reflètent la diapositive d’agarose bien préparée, mais les temps de latence varient considérablement en raison des paramètres de mise au point automatique qui ne sont pas optimaux.

Un ensemble de données plus cohérent est présenté ici, dans lequel tous les temps de doublage semblent bien se chevaucher et les temps de latence semblent être cohérents. Une fois maîtrisé, l’installation d’ODELAY peut se faire en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Les étapes les plus critiques pour les mesures ODELAY reproductibles sont la préparation cohérente du support et l’évitement de la déformation mécanique du support lors de la séparation des lames.

ODELAY est un test très sensible. Par exemple, il peut observer des défauts de croissance dans des souches de levure sensibles à la température à température ambiante, alors que les tests ponctuels couramment utilisés nécessitent une culture de levure à 37 degrés centigrades pour révéler un défaut de croissance. Bien que ODELAY ait été développé chez la levure, la méthode est applicable à tout organisme formant une colonie, y compris les agents pathogènes, afin d’explorer un large éventail de conditions environnementales et génétiques pour comprendre le comportement des micro-organismes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer ODELAY pour mesurer les phénotypes de croissance de micro-organismes unicellulaires formant des colonies sur des milieux solides. N’oubliez pas que travailler avec des micro-organismes peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle adapté aux organismes étudiés doivent toujours être prises.