ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

L'objectif général de l'ODALAY est de mesurer les phénotypes de croissance de cellules individuelles se développant en colonies, de manière hautement performante. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en microbiologie, en génétique et en biologie des systèmes, telles que les effets des perturbations génétiques et des interactions médicamenteuses sur les phénotypes de croissance de tout microorganisme formant des colonies. Le principal avantage de l'ODALAY est qu'il permet au chercheur d'observer directement et de quantifier l'hétérogénéité de la population parmi un grand nombre d'individus.

Avant de monter le moule à gélose, nettoyez les moules en acrylique avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les à l’aide d’air comprimé. Il existe trois pièces inférieures et deux pièces verticales. Pour commencer le montage du moule à gélose, prenez les trois pièces inférieures et assemblez-les de manière à ce que les deux pièces identiques encadrent la troisième pièce.

Utilisez deux petits clips à levier pour fixer les pièces de base de chaque côté. Placez les montants verticaux dans le moule en vous assurant que la courbe laser est correctement positionnée. Déposez une lame de verre nettoyée et séchée sur le moule et maintenez-la en place tout en plaçant une deuxième lame de verre de l'autre côté.

Fixez l'ensemble avec un trombone plus grand. Fixez les deux lames avec des trombones plus grands en veillant à ce que chaque trombone supérieur soit en contact avec la lame de verre, chevauchant l'acrylique. Avant de remplir le moule assemblé avec de l'agar fondu, assurez-vous que les bords sont étanches en pipettant environ 70 microlitres de milieu d'agar fondu le long du côté intérieur du moule.

Remplir le moule sans emprisonner de bulles d'air en pipettant lentement l'agar fondu le long du bord du moule. Une fois le moule rempli, le laisser refroidir à une température ambiante d'environ 23 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. L'étape suivante consiste à séparer le moule.

Commencez par retirer le trombone du bas. Ensuite, retirez la partie inférieure du moule, constituée des trois pièces superposées. Tenez les lames en les comprimant, puis retirez soigneusement les trombones.

Placer le moule sur le bord de la paillasse de manière à ce que le côté du moule portant le point bleu soit orienté vers le haut. Placer les deux pouces sous l'acrylique et les premières phalanges des doigts sur le dessus, vers le bord intérieur du moule, puis pousser lentement et prudemment vers le haut avec les pouces contre le moule, comme si l'on faisait pivoter l'espacement du moule autour de son bord inférieur. Appliquer une pression constante mais progressivement croissante.

Une rupture et une bulle d'air doivent apparaître le long de la ligne où le verre supérieur recouvre l'espacement du moule. Une fois la ligne de rupture initiale observée, continuer à pousser vers le haut avec les deux pouces en appliquant une pression constante. L'agar devrait commencer à se détacher du verre.

Continuez à pivoter le moule vers le haut. Lorsque le verre se détache complètement, saisissez-le et retirez-le entièrement du moule. Ensuite, retirez l'autre pièce du moule en utilisant un mouvement similaire pour la soulever sans déplacer l'agar.

Placer les lames dans une boîte stérile pour embouts avec un peu d'eau stérile de haute pureté au fond. Fermer la boîte et conserver à 4 degrés Celsius toute la nuit pour une utilisation le jour suivant. Commencer cette procédure en préparant les souches dans une plaque de 96 puits comme décrit dans le protocole écrit.

Utiliser un lecteur de plaques pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres de chaque culture. Ensuite, utiliser un protocole de dilution automatisé afin de diluer les cultures dans la plaque jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres d'environ 0,1. Une fois le programme de dilution configuré, charger les plaques, les tubes et les pointes sur la station de travail robotisée selon le plan de disposition du plateau.

Cliquez sur le bouton de lecture pour exécuter le programme de dilution. Sélectionnez le bon nombre de pointes de 50 microlitres et le bon nombre de pointes de 300 microlitres. Une fois la dilution terminée, retirez la plaque de dilution du robot et incubez la plaque à 30 degrés Celsius en maintenant l'humidité pour éviter que la plaque ne s'assèche pendant cinq à six heures.

Environ une à deux heures avant la fin de l'incubation de la boîte de culture, allumez les chambres d'incubation du microscope et laissez-les s'équilibrer à 30 degrés Celsius. Diluez la culture une deuxième fois jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,01 et 0,02 en utilisant le même protocole de dilution automatisé. Recouvrez la plaque de dilution d'un scellé métallique pour congélateur et soumettez-la à une sonication dans un bain de glace pendant 30 secondes, la plaque flottant dans de l'eau glacée.

Étiquetez quatre plaques à 96 puits plats respectivement comme un, deux, trois et quatre. Transférez 150 microlitres de chaque culture soniquée à partir de la plaque de dilution vers les plaques à fond plat en suivant ce schéma. Puits A1 à D6 vers les puits C4 à F9 de la plaque un.

Puits A7 à D12 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Deux. Puits E1 à H6 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Trois. Et puits E7 à H12 dans les puits C4 à F9 de la Plaque Quatre.

Pour commencer cette procédure, placez correctement la lame d'agarose dans la chambre à lame. Ensuite, placez les plaques à 96 puits à fond plat sur la table selon leur quadrant. Les plaques Une, Deux, Trois et Quatre de gauche à droite.

Placer des pointes dans quatre boîtes à pointes vides de manière à ce que les 24 puits intérieurs de chaque boîte soient occupés par des pointes. Dans une cinquième boîte, placer une pointe à la position C10 et des pointes dont l'extrémité a été coupée aux positions A1, A12, H1 et H12. Ces quatre pointes coupées assureront la stabilité de la pince de la plaque à pointes.

Placer la première pointe de perçage sur le site de départ du programme de contrôle robotisé de dépôt pour percer un trou dans l'agarose, qui sera utilisé ultérieurement pour aligner les coordonnées d'origine. Placer la plaque un sur le robot de manipulation liquide pour déposer le premier quadrant. Retirer le couvercle et poursuivre le programme de dépôt.

Vérifiez que toutes les gouttes sont bien présentes. Jetez les pointes utilisées dans le conteneur de déchets dangereux et placez des pointes neuves sur le robot. Attendez environ 30 secondes pour que les gouttes sèchent jusqu'à un diamètre d'environ un millimètre, puis poursuivez le programme.

Remplacez la plaque un par la plaque deux et poursuivez le programme de dépôt. Lorsque les quatre quadrants ont été inoculés et que les gouttes sont sèches, remettez le couvercle sur la chambre à lames et retournez l'appareil. Placez une lame de verre sur la face supérieure de la chambre à lames.

Chargez d'abord la chambre à lame dans le microscope. La microscopie par intervalles est réalisée en exécutant un script conçu sur mesure. Cliquez sur l'obturateur pour ouvrir l'obturateur de lumière transmise, puis sur le bouton de mise au point pour activer le taux élevé de la caméra.

Cliquez sur « Go Origin » et déplacez la platine pour trouver la marque d'origine qui a été perforée dans l'agar, puis déplacez-vous légèrement vers la droite pour focaliser sur les cellules déposées dans la zone E7. Revenez à la perforation d'origine et centrez-la dans le champ de vision. Réglez l'origine à cette valeur en appuyant sur le bouton « Set ». Déplacez-vous jusqu'à la position H18 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement.

Ensuite, passez à la position L7 et faites la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Enfin, déplacez-vous à la position E7 et effectuez la mise au point à l’aide de la vis hexagonale la plus proche de cet emplacement. Vérifiez la mise au point au centre ainsi qu’aux bords aux positions E12, H12 et L12, et ajustez la plage de mise au point automatique si les valeurs z de mise au point indiquées par la valeur z dépassent la plage de mise au point automatique par défaut, en valeur absolue.

Appuyez sur le bouton Réinitialiser, puis sur ODELAY. Choisissez le répertoire où enregistrer les données. Le microscope collectera les données pendant 48 heures ou jusqu'à la fermeture du programme.

Ces images représentatives en laps de temps montrent des cellules de levure en cours de croissance sur milieu solide aux temps zéro heure, trois heures, six heures et neuf heures après l'ensemencement. On observe ici un jeu de données représentatif comparant deux souches de levure après traitement des images en laps de temps. Les temps de doublement relativement uniformes reflètent la préparation soigneuse de la lame d'agarose, mais les temps de latence varient considérablement en raison de paramètres de mise au point automatique non optimaux.

Un ensemble de données plus cohérent est présenté ici, dans lequel tous les temps de doublement semblent bien se superposer et les durées de latence apparaissent constantes. Une fois maîtrisée, la mise en place d'ODELAY peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Les étapes les plus critiques pour des mesures ODELAY reproductibles sont la préparation homogène du milieu et l'évitement de toute déformation mécanique du milieu lors de la séparation des lames.

ODELAY est un dosage très sensible. Par exemple, il peut détecter des défauts de croissance chez des souches de levure sensibles à la température à température ambiante, alors que les dosages classiques basés sur des spots nécessitent la culture de la levure à 37 degrés Celsius pour révéler un défaut de croissance. Bien qu'ODELAY ait été développé chez la levure, la méthode s'applique à tout organisme formant des colonies, y compris les agents pathogènes, afin d'explorer un large éventail de conditions environnementales et génétiques pour comprendre le comportement des micro-organismes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'ODELAY afin de mesurer les phénotypes de croissance de micro-organismes unicellulaires formant des colonies sur milieu solide. N'oubliez pas que le travail avec des micro-organismes peut présenter des risques, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés aux organismes étudiés doivent toujours être prises.