Name: Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Découvrez la visualisation des organes stéroïdogéniques chez Drosophila melanogaster par immunomarquage. Cette méthode permet d'étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et leurs mécanismes neuronaux.

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Nous remercions Reiko Kise et Tomotsune Ameku pour leur soutien technique pour ce travail. Nous sommes également reconnaissants envers Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko koto, Masayuki Miura, le Stock Center drosophile Bloomington, KYOTO Stock Center (DGRC), et les études de développement Hybridome Banque pour les stocks et réactifs. Ce travail a été soutenu par des subventions à YSN de JSPS KAKENHI Grant Numéro 16K20945, La Fondation Naito et Inoue Prix scientifique de la recherche; et par une subvention à RN de MEXT KAKENHI Grant Numéro 16H04792.

NOTE: Le schéma d&#39; ensemble des protocoles est illustré à la figure 1. 1. La Dissection du larvaire Anneau Gland (RG) NOTE: Dans D. melanogaster, qui appartient à cyclorrhaphous Diptera, le PG est dans un organe endocrine composite appelé le presse - étoupe annulaire (RG, figure 2D). Comme il est impossible que le PG est chirurgicalement séparé des autres types de cellules (voir plus loin), une cible pratique est d&#39;isoler un RG par dissection intact et non endommagé. <ol><li> Préparation des larves aux stades de développement appropriés REMARQUE: Pour synchroniser les stades de développement des larves de D. melanogaster, il est nécessaire de ramasser les œufs dans une étroite fenêtre de temps et de recueillir les larves au moment opportun. <ol><li> Ramassez les œufs pendant 2 h sur une plaque d&#39;agar-jus de raisin à 25 ° C. </li><li> Recueillir nouvellement éclos 1 <sup&gt; st larves du sous microscope à dissection avec une pince et les transférer dans un petit flacon contenant de la levure / semoule de maïs alimentaire mouche norme purée. NOTE: L&#39;âge des larves est représenté par « heures après la ponte des œufs (HAEL) », « heures après l&#39;éclosion (HAD) », ou « heures après L3 exuviation (hAL3E) ». </li><li> Au point de temps approprié, recueillir les larves mis en scène avec une boucle en plastique jetable pour éviter les blessures indésirables. Afin de minimiser une différence dans la progression du développement des larves de dernier stade 3 ème, recueillir les larves du 2 ème à 70 HAEL (48 HAD) et leur permettre de muent dans des intervalles de 2 h. Ensuite, recueillir les 3 e stade larvaire dans les 2 heures après la L3 exuviation; cette procédure donne 0-2 larves hAL3E. </li><li> Transférer les larves par étapes dans une boîte remplie de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Rincer les larves avec du PBS pour enlever la nourriture résiduelle du corps. </li></ol></li><li> Dissection grossière des larves sousmicroscope disséquant <ol><li> Tenez le crochet de la bouche d&#39;une larve avec une pince. Séparer le corps de la larve au tiers antérieur de la longueur du corps en utilisant des micro ciseaux. </li><li> Maintenir l&#39;extrémité de coupe du corps de la larve antérieure avec une paire de forceps. Utilisation de l&#39;autre paire de forceps, pousser doucement le bout de la tête vers l&#39;intérieur du corps; cette procédure transforme le corps de la larve intérieur. REMARQUE: Cette étape peut être ignorée pour la dissection du 1 er stade larvaire. </li><li> Répétez les étapes 1.2.1-1.2.2 avec des larves supplémentaires pendant 5-10 min. NOTE: Le nombre de larves doit être égale ou inférieure à 20 pour gagner du temps pour la dissection. </li></ol></li><li> Dissection Fillet des larves REMARQUE: Cette méthode permet de maintenir la position des tissus reste intacte. <ol><li> Laisser les larves dans l&#39;eau seulement pendant 1 h. Les larves sont immobilisées en raison de l&#39;asphyxie. </li><li> Mettre un côté dorsal des larves dans une goutte de PBS sur un enduit de siliciumplat, avec sa face dorsale vers le haut. REMARQUE: La face dorsale a 2 tubes trachéaux étendant longitudinalement. </li><li> Sous un microscope à dissection, insérer une broche d&#39;insectes dans l&#39;extrémité antérieure de la chenille en utilisant une pince. Étirer le corps de la larve de la face postérieure et mettre une deuxième broche dans l&#39;extrémité postérieure de la larve. NOTE: En plus des broches d&#39; insectes, une aiguille faite d&#39;un fil de tungstène peut être utile 21. Une aiguille peut être incorporée dans une pointe de pipette par chauffage destiné à être utilisé comme une aiguille de dissection. </li><li> Sous un microscope de dissection, faire une petite incision près de la queue avec des micro ciseaux. De l&#39;incision, couper la cuticule dorsale longitudinalement le long de la ligne médiane dorsale vers la tête. Veillez à ne pas endommager les tissus sous la cuticule. </li><li> Étirer la cuticule de paroi corporelle de chaque côté et placer 4 broches à chaque coin de la paroi de corps disséqué. </li><li> Retirer une partie de corps antérieure en matière grasse avec une pince, afin d&#39;exposer le cerveau-RG complex être exposé à la surface. Retirer une paire de glandes salivaires, le cas échéant. </li></ol></li><li> Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie <ol><li> Mettre le tiers antérieur du corps de larves (étape 1.2.2) dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 500 ul de la solution de correction (4% de paraformaldehyde dans du PBS). Fixer moins de 20 échantillons en même temps, sinon PBS jointe aux échantillons fixes peuvent provoquer une dilution défavorable du fixateur. Pour la dissection de filet, retirer une goutte de PBS, puis ajouter une goutte de solution de solution. REMARQUE: Pour une solution de solution, soit 3,7% de formaldéhyde ou 4% paraformaldéhyde peuvent être utilisés. </li><li> Incuber les tissus disséqués dans la solution de solution pendant 30 min à température ambiante (RT) ou aussi pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois. Laver pendant 15 min sur une bascule à R échantillons avec 500 uL de 0,3% PBT (PBS + 0,3% d&#39;éthoxylate d&#39;octylphénol)T. Pour la dissection de filet, enlever les broches d&#39;insectes et de transférer les échantillons dans un microtube de 1,5 ml. NOTE: Pour augmenter la perméabilité des anticorps dans les tissus, les échantillons sont traités avec 500 ul de 2,0% PBT pendant 1-2 h sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer PBT avec 500 ul de solution de blocage (2% d&#39;albumine de sérum bovin en PBT). Incuber les échantillons pendant 1,5 h sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d&#39;anticorps primaire, anticorps -à- dire dilué dans la solution de blocage. </li><li> Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C. </li><li> Remplacer la solution d&#39;anticorps primaire avec 500 uL de 0,3% PBT et rincer rapidement les échantillons 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer PBT 0,3% avec 50 ul de la solution d&#39;anticorps secondaire (anticorps conjugué à un colorant dilué dans la solution de blocage). Pour la coloration nucléaire, 0,5 pi 4&#39; , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, solution mère 0,1 mg / ml) est ajouté à une solution de 50 ul. Incuber les échantillons sur un balancier pendant 2 h à la température ambiante ou bien à 4 ° C pendant une nuit. REMARQUE: Conservez les échantillons dans l&#39;obscurité. </li><li> Remplacer la solution d&#39;anticorps avec 500 ul de 0,3% PBT et rincer 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois à la température ambiante. </li></ol></li><li> Dissection fine du complexe cerveau-RG contenant le PG et le montage <ol><li> Utiliser une pipette jetable pour transférer les échantillons immunocolorées à un plat rempli avec 0,3% de PBT. REMARQUE: Pour éviter des bulles gênantes lors de la dissection et de montage, 0,3% PBT peut être remplacé par du PBS. </li><li> Sous un microscope à dissection, maintenir le crochet de cuticule ou de la bouche avec une paire de forceps. En utilisant une aiguille 27 G attachée à une seringue de 1 ml comme un « couteau », couper l&#39;extrémité antérieure de l&#39;œsophage et des disques oculaires pour éliminer le complexe de disque cerveau-RG-oeil de la cuticule du corps. </li><li> Sepaévaluer l&#39;oesophage et de l&#39;intestin du complexe disque cerveau-RG yeux avec des pinces. Depuis l&#39;œsophage passe à travers le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral (VNC), retirer l&#39;intestin du côté postérieur. REMARQUE: Pour retirer les disques imaginaux supplémentaires à partir des échantillons, couper les liens entre le cerveau, les disques des yeux et des disques de la jambe avec un couteau à aiguille. </li><li> Répétez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour d&#39;autres échantillons. Remarque: Pour éviter les débris de tissu de coller aux échantillons, transférer chaque échantillon rempli à un plat propre différent rempli avec 0,3% de PBT ou de PBS. </li><li> Transférer les échantillons au centre d&#39;une lame de verre propre avec une micropipette. NOTE: Pour 2 ème ou 3 ème stade larvaire, devrait être tronqué la fin d&#39;une pointe de micropipette avec une lame de rasoir. </li><li> Sous un microscope à dissection, aligner des échantillons individuels avec leur face dorsale par l&#39;aide de pinces. NOTE: Le RG est situé sur la face dorsale du cerveau (figure 2A). Cet alignement facilite la spécification des échantillons individuels au cours de l&#39;imagerie. </li><li> Inclinaison vers une lame de verre et essuyer autant que possible l&#39;excès de PBT. Mettre une goutte de réactif de montage sur un côté de la glissière. Placez le bord d&#39;un glissement de couverture de l&#39;autre côté de la goutte et mettre la lamelle sur les échantillons lentement avec des pinces. NOTE: Cette procédure empêche les échantillons de se déplacer à l&#39;extérieur du glissement de couverture. </li><li> Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l&#39;obscurité. </li></ol></li></ol> 2. Le Dissection du Ovaire en Femmes adultes <ol><li> Préparation des femelles adultes <ol><li> Alimentation mouches femelles avec de la nourriture à la mouche levure / semoule de maïs standard pour 3-4 jours pour engraisser l&#39;ovaire. Maintenir à 25 ° C. </li></ol></li><li> Dissection de l&#39;ovaire chez les femmes adultes <ol><li> Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de couper la tête. </li><li> Transfert des corps de mouche à un plat de 3 cmrempli de PBS. </li><li> Sous un microscope à dissection, tenir le thorax du côté dorsal en utilisant une pince. Saisir le segment abdominal A5 ou A6 avec les autres pinces et décoller la cuticule abdominale vers le côté postérieur. Essuyez la cuticule collante de la pointe de la pince. </li><li> Pincez un oviducte et prendre l&#39;ovaire du corps. </li><li> Peigne et diffuser les conseils de l&#39;ovaire avec une pince. REMARQUE: Cette opération améliore l&#39;efficacité de l&#39;immunocoloration. </li></ol></li><li> Dissection du cerveau des femmes adultes, VNC et les organes reproducteurs. NOTE: Cette méthode permet l&#39;innervation de l&#39;ovaire à conserver intacte. <ol><li> Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de les transférer à un plat siliconé rempli avec du PBS. </li><li> Sous un microscope de dissection, tenir les rostre et éplucher la cuticule de la tête pour exposer le cerveau avec une pince. Retirer la trachée attachée au cerveau. NOTE: Le Brain est une structure blanche et arrondie. Le cerveau se connecte à VNC dans le thorax. </li><li> Tenir le thorax sur la face dorsale et couper les pattes et les ailes avec une paire de forceps. Utilisation de l&#39;autre paire de forceps, décoller le thorax ventral cuticule de la base des jambes. Une fois que le VNC est exposé, enlever la cuticule dorsale résiduelle et les muscles attachés à la pince à l&#39;aide de VNC. Veillez à ne pas endommager la connexion entre le cerveau et le VNC. </li><li> Utilisez une pince pour peler la cuticule abdominale et d&#39;exposer l&#39;ovaire et de leurs organes interactifs, y compris les neurones, la culture, l&#39;intestin, l&#39;oviducte, l&#39;utérus et la glande accessary. </li><li> Retirez les tissus résiduels, y compris la trachée et le corps de graisse à l&#39;aide des pinces. </li></ol></li><li> Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie <ol><li> Transférer environ 8-10 paires des ovaires dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 250 ul de la solution de correction (4% paraformaldehyde dans du PBS) et incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois. </li><li> Laver les échantillons 2 fois avec 500 uL de 0,1% PBT pendant 5 min chacun à TA. </li><li> Remplacer PBT avec une solution de blocage de 50 ul. Incuber les échantillons pendant 1 heure sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d&#39;anticorps primaire. </li><li> Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C. </li><li> Remplacer la solution d&#39;anticorps primaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL PBT 0,1% pendant 15 minutes chacun sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer PBT de 0,1% avec une solution d&#39;anticorps secondaire de 50 ul. Pour la coloration nucléaire, ajouter 0,5 ul DAPI à 50 ul de la solution. Incuber les échantillons pendant 2 heures sur une bascule à la température ambiante. </li><li> Remplacer la solution d&#39;anticorps secondaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,1% PBT<html> pendant 15 min chacun sur une bascule à la température ambiante. REMARQUE: La procédure de lavage peut se faire à 4 ° C pendant la nuit. Gardez les échantillons dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Montage des échantillons sur des lames de verre <ol><li> Transférer les échantillons sur une lame de verre avec 0,1% de PBT en utilisant une micropipette. Remarque: Pour éviter les bulles gênantes lors de la dissection et de montage, PBT 0,1% peut être remplacée par du PBS. </li><li> Pour l&#39;ovaire, séparer les chaînes des ovarioles de l&#39;autre avec des pinces au microscope de dissection. Ne pas blesser les conseils des ovarioles contenant les germaria. Pour l&#39;organe reproducteur-VNC complexe du cerveau, enlever la cuticule résiduelle et organiser la position sur une lame de verre. </li><li> Essuyez le plus excès PBT que possible et mettre une goutte de réactif de montage au centre des échantillons. Placez une lamelle lentement à l&#39;aide des pinces. </li><li> Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l&#39;obscurité. </li></ol></li></ol>« &gt; 3. Imagerie avec un balayage laser microscope confocal <ol><li> Observez les échantillons au microscope et amener les organes stéroïdogenèse dans le champ de vision. Une fois que le point de vue est fixe, changer le système d&#39;imagerie dans le mode d&#39;acquisition d&#39;image. REMARQUE: Les lentilles sont utilisées objectifs 10-20x pour obtenir les images du complexe cerveau-RG ou de l&#39;ovaire entier. En variante, les lentilles d&#39;objectif 40-63X (eau ou immersion dans l&#39;huile) sont utilisés pour la visualisation de la localisation subcellulaire des protéines dans les CSS ou l&#39;innervation des neurones du PG et de l&#39;ovaire. </li><li> Mettre en place les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image sur le logiciel ci-joint. Sélectionnez la combinaison de fluorescence (par exemple GFP et DP). En procédure de balayage rapide, régler la puissance du laser, la sensibilité des détecteurs (Gain / Offset), et la taille du trou d&#39;épingle. REMARQUE: Pour obtenir des images à haute qualité, doivent être optimisés la puissance du laser à balayage et la sensibilité du détecteur (gain) pour chaque échantillon. Pour définir la formedes tissus, une image de lumière transmise peut être prise en plus d&#39;une image fluorescente. </li><li> Prenez des piles Z des images. Lors d&#39;une analyse rapide continue, déplacer le plan focal avec le lecteur de mise au point du microscope et définir la position de départ et la position finale. Le nombre de tranches et la distance entre les tranches d&#39;intervalle sont ajustées en conséquence. </li><li> Sélectionnez la vitesse de balayage, la méthode de balayage et le mode de balayage bidirectionnel. </li><li> « Démarrer les vrais scans » pour l&#39;acquisition d&#39;images. </li><li> Enregistrez l&#39;image avec le format du logiciel ci-joint. REMARQUE: Les fichiers d&#39;image d&#39;origine contient les informations des paramètres d&#39;acquisition d&#39;image et échelles. Les images exportées peuvent être traitées à l&#39; aide d&#39; un logiciel de traitement d&#39;images sur l&#39;ordinateur 22. </li></ol>

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<li>Niwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-molting+glossy%2Fshroud+encodes+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase+that+functions+in+the+%26%2334%3BBlack+Box%26%2334%3B+of+the+ecdysteroid+biosynthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the &#34;Black Box&#34; of the ecdysteroid biosynthesis pathway.</a> Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Komura-Kawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Ouija+Board+Controls+Ecdysteroid+Biosynthesis+through+Specific+Regulation+of+spookier%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier.</a> PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons étudié la biosynthèse ecdystéroïde et son mécanisme de réglementation D. melanogaster, et a élaboré un protocole de dissection et immunomarquage. Le moment de la biosynthèse ecdystéroïde est affectée par des facteurs environnementaux à travers les entrées de neurones 33, il est donc essentiel de maintenir l&#39;innervation des organes ecdysteroidogenic ainsi que le cerveau, VNC, et d&#39; autres tissus lors de la dissection. Comme décrit ci - dessu...

Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d&#39;une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d&#39;autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d&#39;autres types de cellules étant conservées intactes dans l&#39;architecture multicellulaire. Un exemple de ces organes spécialisés est un organe stéroïdogénique, où de nombreuses enzymes biosynthétiques les étapes de médiatisent conversion du cholestérol aux hormones stéroïdes actifs 1. La plupart de ces gènes d&#39;enzymes sont exprimés spécifiquement dans les organes stéroïdogenèse, et la voie de biosynthèse est étroitement régulée par de nombreux stimuli externes via des entrées humorale et entrées neuronales. Une fois quesynthétisés, les hormones stéroïdes sont sécrétés dans l&#39;hémolymphe et sont destinés à de nombreux tissus et organes de régulation de l&#39;expression d&#39;une variété de gènes 2. Par conséquent, l&#39;action d&#39;une hormone stéroïde induit une réponse systémique à maintenir l&#39;homéostasie, la croissance et la reproduction. Pour étudier les fonctions de la biosynthèse des hormones stéroïdes et les actions pléiotropiques des hormones stéroïdes, Drosophila melanogaster peut être utilisé comme système modèle approprié. Au cours des stades larvaires, dans un organe endocrine spécialisé l&#39;hormone stéroïde insecte, ecdystéroïde, biosynthesized appelée la glande prothoracique (PG) 3. Dans le PG, plusieurs enzymes catalysent spécifiquement ecdysteroidogenic les multiples étapes de conversion du cholestérol à l&#39; ecdysone, qui contrôle la mue et de la métamorphose à des stades de développement appropriés 4. Par conséquent, un changement dynamique du titre ecdystéroïde est réglementépar de nombreuses voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux. D&#39;autre part, dans le stade adulte, ecdystéroïde joue un rôle essentiel dans la physiologie, y compris la reproduction, le sommeil, la mémoire et la durée de vie 5, 6, 7, 8. Il est connu que ecdystéroïde est synthétisée activement dans l&#39;ovaire, la régulation de la progression de l&#39; ovogenèse 6, 7, 8, 9, 10, 11. Récemment , nous avons rapporté que le nombre de cellules souches germinales (CSS) est affectée par ecdystéroïde et le sexe de signalisation peptidique en réponse à l&#39; accouplement des stimuli 12. Des outils puissants de D. melanogaster la génétique et la biologie cellulaire, y compris l&#39; information du génome bien annoté, gène binairesystèmes d&#39;expression, et des techniques transgéniques ARNi, nous ont permis d&#39;identifier des gènes essentiels à la biosynthèse ecdystéroïde dans la PG et l&#39;ovaire 13, 14, 15. Une fois que les gènes ecdysteroidogenic sont identifiés, la régulation de la transcription de ces gènes et les dynamiques de produits Localisations de gènes peuvent être examinés dans la voie de biosynthèse 16. A cet effet, la transcription-PCR quantitative en sens inverse, l&#39; ARN par hybridation in situ, et l&#39; analyse immunohistologique sont effectuées. L&#39;application de ces techniques comprend une tâche difficile; la dissection élaborée du PG ou de l&#39;ovaire. En particulier, le PG de la mouche des fruits est relativement plus faible que celle d&#39;autres insectes (par exemple , le ver à soie et la mouche de coup), donc on a besoin de pratiquer la compétence essentielle de la mouche des fruits dissection pour l&#39; échantillonnage. En outre, les deux organes ecdysteroidogenic reçoivent innervations du système nerveux central (SNC) 17, 18, 19, 20. Ainsi, pour les analyses anatomiques précises, les organes ecdysteroidogenic doivent être conservés intacts ainsi que le système nerveux central et d&#39;autres organes, de ne pas perturber leurs connexions neuronales. Ici , nous fournissons des protocoles pour la dissection et la visualisation des organes stéroïdogenèse dans D. melanogaster. L&#39;apprentissage de la technique de dissection est la clé point de départ de ces expériences. De plus, on peut étiqueter avec succès les organes stéroïdogenèse ainsi que leurs organes interactifs avec plusieurs anticorps et des lignes de pilote GAL4. Profitant de ces techniques, les matériaux et la génétique, on peut étudier les mécanismes complets de biosynthèse des hormones stéroïdes.

<table><tbody><tr><td><Boîte > collecte d’œufs forts</Boîte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>culture tissulaire (55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp ; pour assiettes d’agar au jus de raisin</td></tr><tr><td>tasse de collecte</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pâte</td><td>de levure Levure sèche orientale, Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % jus de raisin</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td><larves fortes>élevées</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petites fioles (12ml, 40&fois ; 23,5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>boucle jetable</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>nourriture standard pour mouches</td><td></td><td></td><td>&nbsp ; le recepi us sur le site web du centre de stock Blooington.</td></tr><tr><td>Microscope <dissection</>dissection fort></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire (35 x 10 mm, non traitée)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>silicone coarting à l’intérieur des boîtes</td></tr><tr><td>Aiguille Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)&nbsp ;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Un « couteau » pour couper les pinces à tissus</td></tr><tr><td>, Inox, #5</td><td>Dumont, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>épingle à insectes (0,18 mm de diamètre)</td><td>Marque</td><td></td> Shiga <td>pour dissection de filets</td></tr><tr><td>micro ciseaux</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&nbsp ;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td><forte>fixation</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eau ultrapure</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate salin tamponné (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1,5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>Incubation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td>rocker</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (cobaye), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (lapin), 1:1000</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mAb de souris, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (lapin), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (souris)</td><td>Banque d’hybridomes d’études développementales (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-cadhérine (rat), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (souris), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire, Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488</td> Life <td>Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgG (H+L) anti-cobaye de chèvre, conjugué Alexa Fluor 555 Life</td><td>Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloïdine conjuguée à un colorant</td><td>Life Technologies</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de montage</td><td></td><td></td><td></td></tr>Micro <tr><td>slide glass</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture de microscope carré</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>Réactif FluorSave (Réactif de montage)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert 1 ml (Compte-gouttes jetable)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Système de microscope laser à balayage</td> Carl <td>Zeiss</td><td></td><td>inversé Axio Observer. Z1 SP gauche</td></tr><tr><td>traitement d’image</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss Il s’agit</td><td></td><td>d’une interface utilisateur spéciale basée sur le système d’exploitation 64 bits de Microsoft Windows7</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w ; GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash ; GFP ; UAS&ndash ; mCD8 ::GFP</td><td></td><td></td><td>dons de K. Ito, Université de Tokyo.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w ; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w ; UAS-mCD8 ::GFP ; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>voir dans Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)</td></tr><tr><td>w ; UAS-mCD8 ::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw ;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protocoles pour visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec immunostaining dans le fruit fly<em&gt; drosophila melanogaster</em

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Dans les organismes multicellulaires, un petit groupe de cellules est doté d&#39;une fonction spécialisée dans leur activité biogénique, ce qui induit une réponse systémique à la croissance et la reproduction. Chez les insectes, la glande prothoracique des larves (PG) et les femmes jouent un rôle essentiel de l&#39;ovaire adulte dans les hormones stéroïdes biosynthèse principales appelées ecdysteroids. Ces organes sont innervés ecdysteroidogenic du système nerveux, à travers lequel le moment de la biosynthèse est affectée par des facteurs environnementaux. Nous décrivons ici un protocole pour visualiser les organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs chez les larves et les adultes de la mouche Drosophila melanogaster, qui fournit un système modèle approprié pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. dissection adroite nous permet de maintenir les positions des organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs, y compris le cerveau, le cordon nerveux ventral, et d&#39;autres tissus. Immunocoloration avec unntibodies contre enzymes ecdysteroidogenic, ainsi que des protéines de fluorescence transgéniques commandés par des promoteurs spécifiques d&#39;un tissu, sont disponibles pour marquer des cellules ecdysteroidogenic. De plus, l&#39;innervation des organes ecdysteroidogenic peuvent également être marqués par des anticorps spécifiques ou une collection de pilotes GAL4 dans divers types de neurones. Par conséquent, les organes ecdysteroidogenic et leurs connexions neuronales peuvent être visualisées simultanément par immunocoloration et techniques transgéniques. Enfin, nous décrivons comment visualiser les cellules souches de la lignée germinale, dont la prolifération et de maintenance sont contrôlés par ecdysteroids. Cette méthode contribue à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.

Nous avons utilisé les protocoles ci - dessus pour visualiser les organes stéroïdogenèse et leurs organes interactifs larves de D. melanogaster et les femelles adultes. Le schéma d&#39; ensemble des protocoles est illustré à la figure 1. Le RG, y compris le PG (Figure 2D), est plus petit et plus transparent que le cerveau et est situé au niveau du côté antérieur-dorsale du cerveau (figure 2A-C et 3A-E). Pour marquer les cellules PG, plusieurs groupes ont pr...

Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l&#39;innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les organes stéroïdogènes et leurs organes associés chez les larves ou les femelles adultes de la drosophile, Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à comprendre la biosynthèse des hormones stéroïdiennes chez les insectes ainsi que le mécanisme régulateur neuronal sous-jacent à l'accouplement et à la métamorphose. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'innervation des organes stéroïdogènes et la position relative de leurs organes associés restent intactes.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les organes stéroïdogènes des larves de drosophile sont très petits et transparents. Mon laboratoire et moi-même sommes heureux de partager nos protocoles de dissection. Commençons donc.Après avoir préparé les larves, commencez la dissection en cours dans une boîte de trois centimètres remplie de PBS, sous un microscope stéréoscopique. Tout d'abord, saisissez le crochet buccal avec une pince. Ensuite, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, sectionnez le corps à environ un tiers de la longueur depuis l’extrémité antérieure.Ensuite, maintenez la longueur

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Comment les niches et les cellules souches forment pendant le développement est une question importante avec des implications pratiques. Dans...

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Une méthode pour visualiser les organes et immunocoloration chordotonaux chez les larves et des pupes...

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Cette vidéo décrit la glande annulaire de la drosophile, une structure endocrinienne complexe importante pour la biosynthèse et la sécrétion d’ecdystéroïdes et d’autres hormones. Le protocole présenté démontre sa dissection, sa fixation et son immunomarquage.

Dissection de la glande annulaire larvaire : isolement des organes endocriniens du développement de la drosophile

Cette vidéo présente un protocole d’immunomarquage détaillé pour visualiser les défauts phénotypiques dans les corps en champignon des cerveaux de drosophiles mutantes. Le protocole implique l’utilisation d’anticorps contre Fas2, une protéine impliquée dans le guidage axonal qui facilite le bon développement morphologique et fonctionnel du corps du champignon.

Visualisation des neurones du corps des champignons dans le cerveau des drosophiles via l’immunomarquage

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Nous présentons ici un protocole amélioré pour la préparation et l’immunomarquage de tout-monture des testicules de drosophile, adapté à la microscopie confocale et permettant également un étiquetage reproductible et fiable. Nous illustrant ce protocole par la représentation 3D et la quantification des expériences de colocalisation sur les grands spermatocytes S4-S5.

Immunomarquage de testicules de drosophiles de mont entier pour l’analyse confocale 3D de grands spermatocytes

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Découvrez la visualisation des organes stéroïdogéniques chez Drosophila melanogaster par immunomarquage. Cette méthode permet d'étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et leurs mécanismes neuronaux.

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly

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