Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les organes stéroïdogènes et leurs organes associés chez les larves ou les femelles adultes de la drosophile, Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à comprendre la biosynthèse des hormones stéroïdiennes chez les insectes ainsi que le mécanisme régulateur neuronal sous-jacent à l'accouplement et à la métamorphose. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'innervation des organes stéroïdogènes et la position relative de leurs organes associés restent intactes.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les organes stéroïdogènes des larves de drosophile sont très petits et transparents. Mon laboratoire et moi-même sommes heureux de partager nos protocoles de dissection. Commençons donc.

Après avoir préparé les larves, commencez la dissection en cours dans une boîte de trois centimètres remplie de PBS, sous un microscope stéréoscopique. Tout d'abord, saisissez le crochet buccal avec une pince. Ensuite, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, sectionnez le corps à environ un tiers de la longueur depuis l’extrémité antérieure.

Ensuite, maintenez la longueur antérieure avec une paire de forceps et utilisez une deuxième paire pour pousser doucement la pointe de la tête à l'intérieur du corps, afin de retourner complètement le corps larvaire à l'envers. Préparez jusqu'à 20 larves de cette manière en moins de 10 minutes, puis transférez-les dans la solution de fixation. Après 30 minutes, rincez les préparations et procédez au marquage immunohistochimique.

Pour commencer, laissez les larves immergées dans l’eau pendant environ une heure, afin de provoquer une asphyxie et ainsi immobiliser les larves. Ensuite, placez une larve sur le dos dans une goutte de PBS sur une boîte recouverte de silicone. Le côté dorsal présente les deux tubes trachéens.

Sous un microscope stéréoscopique, utilisez une pince pour insérer une aiguille à insecte dans l'extrémité antérieure. Ensuite, étirez le corps vers le côté postérieur et insérez une deuxième aiguille dans l'extrémité postérieure. Puis, faites une petite incision près de la queue à l’aide de ciseaux microchirurgicaux.

À partir de l'incision, couper soigneusement la cuticule dorsale longitudinalement le long de la ligne médiane dorsale, en direction de la tête, sans endommager les tissus situés sous la cuticule. Après avoir pratiqué l'incision, écarter les parois corporelles et les fixer à l'aide d'épingles à insectes aux coins. Puis, à l'aide de pinces, retirer le corps adipeux antérieur et les glandes salivaires, exposant ainsi le complexe cerveau-glande en anneau à la surface.

À présent, aspirez le PBS et immergez le prélèvement dans la solution de fixateur. Après 30 minutes, utilisez une pince pour retirer les épingles à insectes et transférez le prélèvement dans un microtube rempli de PBT à 0,3 %. Ensuite, procédez au marquage immunohistochimique.

Après la coloration immunohistochimique des larves, utilisez une pipette jetable pour transférer les échantillons dans une boîte de Pétri contenant du PBT à 0,3 %. Sous un microscope stéréo, saisissez l’exosquelette ou le crochet buccal avec une paire de forceps. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 27 fixée à une seringue d’un millilitre, comme un couteau, pour extraire le complexe anneau cérébral-glandulaire-disque oculaire de l’exosquelette du corps, en sectionnant l’extrémité antérieure de l’œsophage et des disques oculaires.

Ensuite, à l’aide de pinces, séparer délicatement l’œsophage et l’intestin du complexe anneau cérébral-glande-disque oculaire. Tirer l’intestin vers le côté postérieur, car l’œsophage traverse le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral. Enfin, pour isoler le complexe anneau cérébral-glande, couper soigneusement les connexions entre le disque cérébral, les disques oculaires et les disques des pattes à l’aide d’un couteau en forme d’aiguille.

Il est très important d'utiliser des pinces fines à bords tranchants lors de la dissection. Je recommande vivement d'affûter les pinces avec une pierre à aiguiser afin de rapprocher leurs bords sans aucun espace entre eux. Pour transférer les échantillons, utilisez une micropipette équipée d'une pointe à large orifice.

Déposer les échantillons au centre de la lame de verre. Ensuite, utiliser une pince pour positionner les échantillons sur leur face ventrale, afin que le glande annulaire, situé sur la face dorsale du cerveau, puisse être observé. Puis, incliner la lame et essuyer autant que possible l'excès de PBT.

Ensuite, déposez une goutte de réactif de montage près des échantillons et utilisez une pince pour abaisser lentement une lame couvre-objet sur le réactif, puis sur les échantillons. Pour disséquer l'ovaire de la femelle adulte, anesthésiez les mouches avec du gaz dioxyde de carbone. Ensuite, coupez-leur la tête et transférez leurs corps dans une boîte de trois centimètres de diamètre remplie de PBS.

Ensuite, sous un microscope stéréoscopique, saisissez le côté dorsal du thorax avec une pince, puis saisissez le segment abdominal A-5 ou A-6 à l’aide d’une deuxième paire de pinces. Puis, retirez délicatement la cuticule abdominale vers le côté postérieur. Avant de poursuivre, nettoyez la cuticule collante sur les pinces.

Ensuite, pincez un oviducte et isolez l'ovaire. Puis, peignez et étalez les extrémités de l'ovaire à l'aide de pinces. Une fois étalées, immergez l'ovaire dans une solution fixative pendant 30 minutes, afin de les préparer pour la coloration.

Pour préparer un échantillon qui conserve l'innervation de l'ovaire, transférez les mouches femelles anesthésiées dans une boîte recouverte de silicone et remplie de PBS. Sous le microscope de dissection, saisissez le proboscis et retirez la cuticule de la tête afin d'exposer le cerveau. À partir du cerveau, retirez la trachée attachée, en laissant le cerveau connecté au cordon nerveux ventral.

Ensuite, maintenez le thorax par le côté dorsal et retirez les pattes et les ailes. Puis, détachez la cuticule ventrale du thorax en commençant à la base de chaque patte. Une fois le cordon nerveux ventral (VNC) exposé, retirez très soigneusement la cuticule dorsale résiduelle et les muscles attachés au VNC à l’aide de pinces.

Ne pas endommager les connexions entre le cerveau et le cordon nerveux ventral. Ensuite, à l'aide de pinces, détacher la cuticule abdominale pour exposer les ovaires et leurs organes associés, notamment le prop, l'intestin, l'oviducte, l'utérus et la glande accessoire. Enfin, retirer tous les tissus résiduels, notamment la trachée et le corps adipeux.

Ensuite, immergez les échantillons dans une solution fixative pendant 30 minutes, afin de les préparer pour l'immunomarquage. Après l'immunomarquage, transférez les échantillons sur une lame de verre avec du PBT 0,1 % à l'aide d'une micropipette. Puis, observez la lame au microscope et séparez les cordons des ovarioles les uns des autres à l’aide de pinces.

Ne pas endommager les extrémités des ovarioles au cours de cette procédure. Elles contiennent les germariums. Lors de la préparation du complexe cerveau-organes reproducteurs, retirer tout résidu de cuticule et étaler les structures sur la lame.

Ensuite, essuyez la majeure partie de l'excès de PBT, puis appliquez une goutte de réactif de montage sur l'échantillon. Ensuite, placez lentement une lamelle sur la lame à l’aide de pinces et conservez la lame à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Par la suite, observez les échantillons au microscope et amenez les organes stéroïdogènes dans le champ de vision.

Une fois la vue fixée, passez le système d'imagerie en mode d'acquisition d'images. Pendant les stades larvaires, la glande prothoracique a été marquée à l'aide d'anticorps dirigés contre les enzymes ecdystéroïdogènes, notamment l'anticorps anti-shroud. Pour visualiser la connexion neuronale entre la glande prothoracique et le cerveau, le complexe cerveau-glande en anneau a été disséqué.

La méthode de dissection du filet met en évidence le système nerveux stomatogastrique, dans lequel un groupe de neurones sérotoninergiques projette vers la glande prothoracique, le proventriculus et les muscles pharyngés. Chez les femelles adultes, l'écdystéroïde ovarien affecte de nombreux aspects de l'ovogenèse, tels que la prolifération des CSG. Les CSG se trouvent dans le germarium, à l'extrémité de chaque ovariole de l'ovaire.

Dans le germarium, les CSG ont été spécifiquement marquées à l'aide de deux anticorps, 1B1 et la DE-cadhérine. Pour visualiser l'innervation de l'ovaire, l'ovaire a été disséqué, ainsi que le cerveau, le CNC, l'intestin, le prop, l'utérus et la spermathèque. Les neurones ont été visualisés grâce à mCD8:GFP sous le contrôle du conducteur n-Synaptobrèvine GAL4.

En outre, la structure des muscles a été marquée à l'aide de phalloïdine doublement conjuguée. Bien que la dissection des organes stéroïdogènes puisse sembler difficile au départ, utilisez cette vidéo pour apprendre les points de coupe des tissus afin d'isoler plus facilement l'organe sans le lésionner. Nous espérons que notre protocole s'avérera instructif, non seulement pour les débutants, mais aussi pour les chercheurs expérimentés.

Une fois maîtrisée, vous pouvez appliquer cette procédure à vos recherches et l’adapter à vos besoins. Nous espérons que ce protocole contribuera à une compréhension approfondie de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Des protocoles plus détaillés, étape par étape, sont disponibles dans l’article.

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