Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les organes stéroïdogènes et leurs organes interactifs chez les larves ou les femelles adultes de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à comprendre la biosynthèse des hormones stéroïdes des insectes et le mécanisme de régulation neuronale sous-jacent à l’accouplement et à la métamorphose. Le principal avantage de cette technique est que l’innervation des organes stéroïdogènes et la partie relative de leurs organes interactifs restent intactes.

En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les organes stéroïdogènes des larves de mouches sont assez minuscules et transparents. Mon laboratoire et moi sommes heureux de partager nos protocoles de dissection. Alors, commençons.

Après avoir préparé les larves, commencez la dissection dans une boîte de trois centimètres remplie de PBS, sous un microscope de dissection. Tout d’abord, saisissez le crochet buccal avec une pince. Ensuite, à l’aide de micro-ciseaux, sectionnez le corps à environ un tiers de la longueur de la pointe antérieure.

Ensuite, tenez la longueur antérieure avec une paire de pinces et utilisez une deuxième paire pour pousser doucement la pointe de la tête dans le corps, pour finalement retourner le corps larvaire. Préparez jusqu’à 20 larves de cette manière en 10 minutes, puis transférez-les dans une solution fixatrice. Après 30 minutes, lavez les préparations et procédez à l’immunomarquage.

Pour commencer, laissez les larves immergées dans l’eau pendant environ une heure, pour les asphyxier et ainsi les immobiliser. Ensuite, placez une larve côté dorsal vers le haut dans une goutte de PBS sur un plat recouvert de silicone. La face dorsale a les deux tubes trachéaux.

À l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide d’une pince, insérez une épingle à insectes dans l’extrémité antérieure. Ensuite, étirez le corps vers l’arrière et placez une deuxième épingle dans l’extrémité postérieure. Ensuite, faites une petite incision près de la queue à l’aide de micro-ciseaux.

À partir de l’incision, coupez soigneusement la cuticule dorsale longitudinalement le long de la ligne médiane dorsale, vers la tête, sans endommager les tissus sous la cuticule. Après avoir fait l’incision, étirez les parois du corps et fixez-les avec des épingles à insectes dans les coins. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez le corps adipeux antérieur et les glandes salivaires, exposant ainsi le complexe de glandes cerviales-anneau à la surface.

Maintenant, aspirez le PBS et plongez la préparation dans une solution fixative. Après 30 minutes, à l’aide d’une pince, retirez les épingles à insectes et transférez la préparation dans un microtube rempli de 0,3 % de PBT. Ensuite, procédez à l’immunomarquage.

Après l’immunocoloration des larves, à l’aide d’une pipette jetable, transférez les échantillons dans une boîte remplie de 0,3 % de PBT. Sous un microscope à dissection, saisissez la cuticule ou le crochet buccal avec une paire de pinces. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue d’un millilitre, comme un couteau, pour retirer le complexe de disque oculaire de la glande cercléo-cerclé de la cuticule du corps, en coupant l’extrémité antérieure de l’œsophage et les disques oculaires.

Ensuite, à l’aide d’une pince, séparez soigneusement l’œsophage et l’intestin du complexe discal œil-glande cercléale. Tirez l’intestin vers la face postérieure, car l’œsophage passe à travers le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral. Enfin, pour isoler le complexe cerveau-glande annulaire, coupez soigneusement les connexions entre le disque cérébral, les disques oculaires et les disques des jambes, à l’aide d’un couteau à aiguille.

Il est tout à fait essentiel d’utiliser des pinces fines à arêtes vives lors de la dissection. Je vous recommande fortement d’affûter les pinces avec un morceau de meule pour rapprocher leurs bords sans aucun espace. Pour transférer les échantillons, utilisez une micro-pipette avec une pointe à large alésage.

Déposez les échantillons au centre de la lame de verre. Ensuite, à l’aide d’une pince, positionnez les échantillons sur leurs côtés ventraux, de sorte que la glande annulaire, située sur la face dorsale du cerveau, puisse être imagée. Ensuite, inclinez la glissière et essuyez autant de PBT que possible.

Ensuite, placez une goutte de réactif de montage près des échantillons et utilisez une pince pour abaisser lentement une lamelle sur le réactif, puis sur les échantillons. Pour disséquer l’ovaire de la femelle adulte, anesthésez les mouches avec du gaz carbonique. Ensuite, coupez leur tête et transférez leur corps dans un plat de trois centimètres rempli de PBS.

Ensuite, sous un microscope à dissection, saisissez la face dorsale du thorax avec une pince et saisissez le segment abdominal A-5 ou A-6 avec une deuxième paire de pinces. Ensuite, retirez la cuticule abdominale vers la face postérieure. Avant de continuer, nettoyez la cuticule collante de la pince.

Ensuite, pincez un ovale et isolez l’ovaire. Ensuite, peignez et écartez les pointes de l’ovaire à l’aide d’une pince. Une fois étalé, plongez l’ovaire dans une solution fixatrice pendant 30 minutes, pour les préparer à la coloration.

Pour faire une préparation qui maintient l’innervation de l’ovaire, transférez les mouches femelles anesthésiées dans une boîte recouverte de silicone remplie de PBS. Sous le microscope de dissection, tenez la trompe et décollez la cuticule de la tête pour exposer le cerveau. Du cerveau, retirez la trachée attachée, en laissant le cerveau connecté au cordon nerveux ventral.

Ensuite, tenez le thorax par le côté dorsal et retirez les pattes et les ailes. Ensuite, retirez la cuticule ventrale du thorax, en commençant à la base de chaque patte. Une fois le VNC exposé, retirez très soigneusement la cuticule dorsale résiduelle et les muscles attachés au VNC, à l’aide d’une pince.

N’endommagez pas les connexions entre le cerveau et le VNC. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez la cuticule abdominale pour exposer les ovaires et leurs organes interactifs, qui comprennent l’accessoire, l’intestin, l’ovale, l’utérus et la glande accessoire. Enfin, retirez tous les tissus résiduels, y compris la trachée et le corps adipeux.

Ensuite, plongez les échantillons dans une solution fixatrice pendant 30 minutes, pour les préparer à l’immunomarquage. Après l’immunomarquage, transférez les échantillons sur une lame de verre avec 0,1 % de PBT à l’aide d’une micro-pipette. Ensuite, visualisez la lame avec un microscope et séparez les cordes des ovaires les unes des autres à l’aide d’une pince.

Ne blessez pas les extrémités des ovarioles au cours de ce processus. Ils contiennent les germaires. Lors de la préparation du complexe cerveau-organe reproducteur, retirez toute cuticule résiduelle et étalez les structures sur la lame.

Ensuite, essuyez la majeure partie de l’excès de PBT, puis appliquez une goutte de réactif de montage sur l’échantillon. Ensuite, placez lentement une lamelle sur la lame à l’aide d’une pince et rangez la lame à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Plus tard, observez les échantillons au microscope et amenez les organes stéroïdogènes dans le champ de vision.

Une fois la vue fixe, basculez le système d’imagerie en mode d’acquisition d’image. Au cours des stades larvaires, la glande prothoracique a été marquée avec des anticorps contre les enzymes ecdystéroïdogènes, y compris l’anticorps anti-linceul. Pour visualiser la connexion neuronale entre la glande prothoracique et le cerveau, le complexe glande cercléenne a été disséqué.

La méthode de dissection de filet montre le système nerveux stomatogastrique, dans lequel un groupe de neurones sérotoninergiques se projettent vers la glande prothoracique, le proventricule et les muscles pharyngés. Chez les femmes adultes, l’ecdystéroïde ovarien affecte de nombreux aspects de l’ovogenèse, tels que la prolifération de la GSC. Les GSC sont situées dans le germarium à l’extrémité de chaque ovariole de l’ovaire.

Dans le germarium, les GSCs ont été spécifiquement marquées à l’aide de deux anticorps, le 1B1 et la DE-cadhérine. Pour visualiser l’innervation de l’ovaire, l’ovaire a été disséqué, ainsi que le cerveau, le VNC, l’intestin, l’hélice, l’utérus et la spermathèque. Les neurones ont été visualisés par mCD8 :GFP sous le contrôle du pilote n-Synaptobrevin GAL4.

De plus, la structure musculaire a été colorée à l’aide de phalloïdine diconjugée. Bien que la dissection des organes stéroïdogènes puisse sembler difficile au début, utilisez ce film pour apprendre le point de coupe des tissus afin d’isoler plus facilement l’organe sans blessure. Nous espérons que notre protocole est informatif, non seulement pour les débutants, mais aussi pour les chercheurs expérimentés.

Une fois maîtrisé, vous pouvez appliquer cette procédure à vos recherches, et vous rafraîchir pour l’adapter à vos besoins. Nous espérons que ce protocole contribuera à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes. Des protocoles plus détaillés, étape par étape, sont disponibles dans le manuscrit.

S’il vous plaît jetez-y un coup d’œil.