Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

L’objectif général de ce protocole d’imagerie est de décrire la quantification du pH intracellulaire, à l’aide d’un indicateur de pH génétiquement codé et de démontrer comment cette méthode peut être utilisée pour évaluer le transport basolatéral de protons dans un modèle de structure rénale d’insecte, le tubule de Malpighian. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transport cellulaire, telles que la façon dont des protéines de transport spécifiques contribuent au mouvement des protons épithéliaux dans la régulation du pH intracellulaire. Le principal avantage de cette technique est que le transport cellulaire peut être rapidement et facilement évalué à travers plusieurs zones fonctionnellement distinctes d’épithélium intact

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation du pH et de l’épithélium des insectes, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le néphron de mammifère et les cellules épithéliales en culture. Pour commencer cette procédure, placez deux jeux de pinces à souder sur la platine du microscope d’imagerie, avec une pince de chaque côté. Ensuite, insérez les capillaires en verre courbé respectifs et la conduite d’entrée, et la conduite d’écoulement connectée au vide.

Ensuite, montez-les dans les mains aidantes et alignez-les avec la platine d’imagerie du microscope. Étalez de la graisse sous vide sur le ruban de plafond et appuyez sur le séparateur de puits de profusion d’adhésif sur le ruban pour enduire le fond de graisse. Décollez le séparateur de puits de perfusion adhésive et placez-le, côté gras vers le bas, sur une lame enduite de poly l lysine.

Ensuite, retirez le séparateur de puits de perfusion pour laisser des puits spécifiques individuels tracés dans de la graisse hydrophobe. Après cela, placez 200 microlitres d’IPBS à température ambiante ou de solution saline tampon de phosphate d’insecte dans le graissé et encerclez bien sur la lame enduite de poly l lysine. Ensuite, placez la lame sous le stéroscope, versez le milieu de Schneider glacé dans la boîte de dissection et transférez-y une seule mouche femelle anesthésiée.

Tenez la mouche par le thorax à l’aide d’une pince et utilisez l’autre pour saisir doucement l’abdomen postérieur. Ouvrez l’extrémité postérieure de la braguette en effectuant de courts mouvements délibérés. Une fois que le protège-arrière est visible, saisissez l’extrémité distale et libérez l’intestin et les antes des trachées sous-jacentes, en éloignant le protège-arrière du corps par de brefs tirages répétitifs.

Ensuite, pincez les antes antérieures de l’uretère avec une pince fine, une fois que la deuxième série d’antes est libérée de l’abdomen. Récupérez les antes antérieures libres à l’aide de la tige de verre, en glissant la tige sous l’uretère, de sorte que les tubules tombent de chaque côté. Ensuite, soulevez les antes vers le haut, hors de la solution, puis tournez la tige de verre de manière à ce que les antes et l’uretère adhèrent à la face inférieure de la tige.

Abaissez l’uretère directement sur la lame, puis fixez l’uretère et scellez les extrémités distales des antes en appuyant davantage l’uretère sur la lame de verre. Utilisez l’extrémité fine de la tige de verre pour balayer doucement chaque tubule sur la surface de la glissière. Effleurez la tige contre la glissière pour éviter d’écraser le tubule et faites glisser la tige sur le dessus du tubule, en se déplaçant de distale à proximale, pour fixer toute la longueur de chaque tubule à la surface de la lame recouverte de polylysine.

Le succès de cette technique dépend entièrement de l’identification précise et de la manipulation soigneuse des tubules antérieurs de Malpighian. Les tubules endommagés produiront des résultats incohérents. Ensuite, replacez le séparateur de puits de profusion d’adhésif sur la lame pour former un petit puits rempli de liquide sur le tubule monté.

Après cela, placez l’échantillon sur la platine du microscope. Positionnez les capillaires d’entrée et de sortie sur l’ouverture d’entrée et de sortie du puits de profusion, respectivement. Dans cette procédure, allumez le microscope, la source lumineuse et le système d’imagerie, puis ouvrez le logiciel d’imagerie.

Regardez à travers les oculaires et ajustez manuellement la mise au point jusqu’à ce que la lumière des antes soit clairement visible sous la lumière transmise. Ensuite, cliquez sur l’onglet acquisition et sélectionnez 2x2 dans le menu déroulant de gradation, dans la section Charge d’acquisition. Insérez un filtre à densité neutre de 5 % dans le trajet lumineux, pour réduire la lumière d’éclairage et minimiser le photo-blanchiment.

Cliquez sur le canal GFP dans le menu des canaux, puis cliquez sur en direct pour observer le signal fluorescent via la caméra. Après cela, ajustez le curseur temporel pour régler le temps d’exposition, de sorte que les valeurs de pixels les plus lumineuses de l’histogramme d’intensité soient d’environ 40 % de la valeur maximale. Cliquez ensuite sur stop, pour arrêter l’éclairage.

Répétez les procédures dans le canal RFP et confirmez la présence du segment initial dilaté de l’ante antérieure et l’absence d’agrégats cytosolides de cerise, ce qui indique une lésion tissulaire ou une surexpression. Ensuite, activez un protocole d’imagerie timelapse en cochant la case des séries chronologiques. Ajustez la durée dans le menu déroulant, dans la section des séries chronologiques, sur 10 minutes, et le curseur d’intervalle sur zéro, pour définir la durée totale de capture avec l’acquisition d’image maximale.

Ensuite, cochez les cases GFP et RFP dans la section des canaux. Ouvrez la ligne IPBS du système de profusion en activant le contrôleur de vanne approprié et démarrez le protocole d’imagerie en cliquant, démarrez l’expérience. Après une minute, passez à la post-solution de chlorure d’ammonium pendant 20 secondes, en ouvrant la vanne appropriée et en fermant la conduite IPBS.

Ensuite, retournez à l’IPBS en fermant la conduite de chlorure d’ammonium et en rouvrant la vanne IPBS. Pour effectuer un étalonnage en deux points, retirez le séparateur de puits en le décollant de la lame sous-jacente et retirez les capillaires de profusion dans les pinces du puits d’imagerie. Ensuite, appliquez 200 microlitres de tampon IPBS d’étalonnage à pH 7,4.

Ensuite, retirez la solution du puits d’imagerie et remplacez-la par un autre 200 microlitres de solution d’étalonnage. Répétez ce processus quatre fois pour garantir un remplacement complet de la solution. Ensuite, incubez la solution de préparation et d’étalonnage pendant 30 minutes avant l’imagerie.

Répétez le protocole d’imagerie en utilisant les mêmes paramètres déterminés précédemment, avec la modification d’une seule minute de capture d’image. Ajoutez ensuite 200 microlitres de tampon IPBS d’étalonnage à pH neuf. Retirez la solution du puits d’imagerie et remplacez-la par 200 microlitres supplémentaires de solution d’étalonnage.

Par la suite, incubez la préparation dans la deuxième solution d’étalonnage pendant 10 minutes avant l’imagerie et répétez le protocole d’imagerie. Après cela, examinez l’image capturée empilée dans le logiciel d’analyse d’images pour confirmer qu’aucun pixel de l’un ou l’autre canal n’est saturé, en cliquant sur MeanROI et qu’aucune valeur signalée dans l’histogramme d’intensité n’a atteint la valeur maximale détectable, tout en faisant défiler la pile d’images avec le curseur de cadre. Ensuite, analysez la pile d’images en traçant l’intensité de la fluorescence et le rapport de fluorescence en fonction du temps, ici, nous voyons la réponse fluorescente attendue à l’impulsion de chlorure d’ammonium dans les canaux sensibles au pH et insensibles au pH de l’indicateur.

Le rapport de ces signaux révèle la fugacité du pH intracellulaire. Pour effectuer cette analyse, cliquez d’abord sur meanROI et sélectionnez l’outil de forme gratuite. Maintenez le clic gauche de la souris pour tracer une MT de 50 micromètres et faites un clic droit pour terminer de dessiner le ROI.

Ensuite, répétez l’opération dans une zone adjacente à la MT, pour définir le retour sur investissement de l’arrière-plan. Ensuite, cliquez sur intensité moyenne sous mesures, créez un tableau des valeurs d’intensité en cliquant sur Exporter, tableau de données, créer. Cliquez sur l’icône de la roue de configuration de l’horloge et désélectionnez tous les paramètres, à l’exception du temps et de l’intensité moyenne.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’onglet de la table de données nouvellement créée, sélectionnez Enregistrer sous et exportez les données sous forme de fichier csv. On voit ici une image à grand champ, une fluorescence super-elliptique dans les cellules principales de l’ante antérieure et les cellules étoilées de l’ante antérieure. Notez que les cellules étoilées sont en forme de barre dans le segment initial, variables dans le segment transitionnel et affichent des projections cellulaires distinctes dans le segment principal.

Ce graphique montre les changements de pH intercellulaires calibrés en réponse à une impulsion de chlorure d’ammonium de 20 secondes et 40 millimolaires dans les régions d’intérêt. Les courbes pointillées indiquent des ajustements exponentiels uniques appliqués à la phase de récupération de l’acide, après le retrait du chlorure d’ammonium. À partir de là, les valeurs constantes décomposées sont dérivées.

Ce graphique montre le taux d’extrusion d’acide tracé en fonction du pH intracellulaire et ce graphique montre le flux d’acide tracé en fonction du pH intracellulaire, dérivé des ajustements exponentiels de la figure précédente. Une fois maîtrisée, l’extraction des tubules de Malpighian peut se faire en 10 minutes, si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le succès dépend entièrement de la qualité de la dissection et de l’étalonnage précis de l’indicateur de pH.

Cette préparation peut être combinée avec d’autres biocapteurs génétiquement codés tels que des indicateurs fluorescents de calcium et d’halogénure pour étudier le mouvement des solutés et la signalisation intracellulaire dans les cellules épithéliales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tubules de drosophile malpighian sains, d’imager un indicateur de pH génétiquement codé et de quantifier le mouvement des protons dans les cellules épithéliales. N’oubliez pas que travailler avec du nitroïsène peut être dangereux et endommager les préparations et que, par conséquent, des précautions doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure, pour s’assurer qu’il ne contamine aucun équipement à réutiliser.