Name: Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Découvrez la quantification optique du pH intracellulaire dans les tubules de Malpighi de Drosophila melanogaster à l'aide de l'indicateur génétiquement codé pHerry. Cette méthode permet d'évaluer le transport basolatéral des protons dans des types cellulaires épithéliaux distincts par imagerie en temps réel ex vivo.

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Ce travail a été soutenu par les NIH DK092408 et DK100227 à MFR. AJR a été pris en charge par T32-DK007013. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Julian A.T. Dow pour le PACCR-GAL4 et c724-GAL4 stocks de drosophile . Nous remercions également Jacob B. Anderson pour assistance, maintien des croisements expérimentaux de mouche.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le succès de dosage de pHj’ai in Drosophila MTs dépend entièrement de la santé des extraits MTs et la qualité de montage et de dissection (Figure A – C). Ainsi, la manipulation soigneuse de tissu comme décrit est impérative. Diapositives fraîchement enduits dans PLL substantiellement aide MT montage car ils ont tendance à être beaucoup plus adhésif que glisse qui ont déjà été exposés à la solution. Un montage soigneux aideront également à l’identifi...

Ce protocole vise à décrire la quantification du pH intracellulaire (pHi) à l’aide d’un indicateur pH codé génétiquement (GEpHI) et démontrer comment cette méthode peut être utilisée pour évaluer le transport H+ basolatérale chez un insecte modèle (D. melanogaster) structure rénale, les tubules Malpighian (MT). MTs servent les organes excréteurs de la mouche à fruit et sont fonctionnellement similaires aux mammifères néphron à plusieurs égards essentiels1. MTs sont disposées sous forme de 2 paires de tubules (antérieures et postérieures) dans le thorax et l’abdomen de la mouche. Le tube épithélial unicellulaire de chaque marqueur est composé de cellules métaboliquement actives principales avec distinct apicales (luminal) et polarité basolatérale (hémocoele) ainsi que des cellules étoilées intercalées. MTs antérieures sont composés de 3, morphologiquement, fonctionnellement, et débats développemental distincts, notamment la première dilatés segment segment transitoire et sécrétoire segment principal, qui relie à l' uretère2. À l’échelle cellulaire transport trans épithélial ionique dans la lumière s’effectue par une V-ATPase de la membrane plasmique apicale3 et un échangeur d’alcali-métal/H+ comme un basolatérale++de Na -K-ATPase4, vers l’intérieur-redresseur K+ canaux5, Na+-driven Cl−/HCO3− échangeur (NDAE1)6et++de Na -K-2 Cl− cotransporteur (NKCC ; Ncc69)7, tandis que les cellules étoilées médient Cl– et8,9de transport de l’eau. Ce système physiologique complex mais accessible offre d’excellentes possibilités pour l’étude des mécanismes de transport des ions endogènes lorsqu’il est combiné avec les divers ensembles d’outils génétiques et comportementaux de la drosophile.
La justification de ce protocole était de décrire un système génétiquement malléable pour étudier le transport épithélial ionique avec un potentiel pour l’intégration de la cellule au comportement et à l’exportation d’outils à d’autres systèmes de modèle. Expression de pHerry10, un GEpHI dérivé d’une fusion de vert écliptique super sensibles au pH pHluorin11,12 (EERH) et rouge mCherry insensible à pH13, dans MTs permet quantification des transports H+ cellules MT uniques à travers la haute K+/nigericin calibration technique14. Alors que de nombreux transporteurs ioniques équivalents H+ , quantification du pH intracellulaireje sert une représentation fonctionnelle du mouvement ionique via une variété de transporteurs. Le système de modèle drosophile MT aussi offre de puissants outils génétiques en tissu-spécifique transgène15 et RNA interférence (ARNi)16 expression qui peut être combinée avec l’imagerie cellulaire et dosages de l’ensemble-orgue17 , 18 , 19 de fonction tubule pour créer un ensemble d’outils robuste grâce à l’intégration verticale des molécules au comportement. Cela contraste avec les nombreux autres protocoles pour évaluer biologie épithéliale, comme historiquement ces mesures sont sont appuyés sur complexe et intimidant des électrodes sélectives micro-dissection et sophistiqué20,21, et sensibles au pH cher colorants22 avec exigences restrictives chargement et mauvaise spécificité cellulaire en tissus hétérogènes. GEpHIs ont été utilisés intensivement mesurer pHj’ai dans une variété de types de cellule23. Les premiers travaux exploités la pH-sensibilité inhérente de Green Fluorescent Protein (GFP) pour surveiller pHj’ai dans les cellules épithéliales en culture24 , mais les deux dernières décennies ont vu GEpHIs utilisé dans les neurones25, glia26, champignons27 , et28des cellules végétales. La combinaison de la possibilité d’un ciblage cellulaire des constructions génétiques par le biais de l’expression des GAL4/UAS système15 et l’accessibilité physiologique de la drosophile MT cela fait une préparation idéale pour les enquêtes de pHj’ai règlement et transport épithélial ionique.
régulation du pHj’ai a été étudiée pendant des décennies et est essentielle à la vie. La préparation de MT vous propose un modèle robuste pour enseigner la physiologie de la régulation du pHj’ai mais aussi effectuer un sophistiqué enquêtes de pHi règlement ex vivo et in vivo. Ce protocole décrit la quantification du mouvement H+ à travers la membrane basolatérale des cellules épithéliales de la drosophile MT à l’aide de la NH4Cl l’acide impulsion technique21de chargement, mais comme l’indicateur de pH est génétiquement codé, ces méthodes et leur cadre théorique peuvent être appliqués toute préparation se prêtent à la transgénèse et création d’images en direct.

<table><tbody><tr><td>Solution de poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Stocker à 4 &deg ; C, peut être réutilisé.</td></tr><tr><td>Nigericin Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>ATTENTION : Manipuler avec des gants. Stocker sous forme d’aliquotes de solution mère de 20 mM dans du DMSO à 4 &°C.</td></tr><tr><td>Couvercles de chambre de perfusion adhésifs, taille de l’adhésif 1 mm, diamètre et temps de la chambre 9 mm et fois 0,9 mm, diamètre des ports 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>peuvent être remplacés selon les besoins pour correspondre au système de perfusion.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Adhésifs Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Helping Hands Supports de soudure</td><td>Outils de fret portuaire</td><td>60501</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Système de perfusion ouvert alimenté par gravité avec contrôleur de vanne, collecteur 8 à 1 et réservants</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Tout système de perfusion comparable peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Régulateur de débit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Peut être remplacé au besoin pour s’adapter au système de perfusion.</td></tr><tr><td>Schneider’s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td>Store à 4 &deg ; C dans des aliquotes stériles.</td></tr><tr><td>#5 Pince en acier inoxydable</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td>Peut être remplacé en fonction du confort de l’expérimentateur.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en polystyrène de 35 x 10 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>La marque et la taille exactes n’ont pas d’importance.</td></tr><tr><td>Lames de microscope 75 x 25 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>La marque et la taille exactes peuvent varier tant que les puits de perfusion sont compatibles.</td></tr><tr><td>Verre capillaire borosilicaté filimenté, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, épaisseur 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment non nécessaire, le verre peut être remplacé pour s’adapter au tube de perfusion et aux puits de perfusion.</td></tr><tr><td>Tube Tygon, ID 1/16 », OD 1/8 », épaisseur 1/32</td> » <td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs, peut être remplacé pour correspondre au système de perfusion.</td></tr><tr><td>Graisse silicone sous vide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Pince de contrôle de débit en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs, stérilité non requise</td></tr><tr><td>Tiges de verre, diamètre 5 mm</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>La taille exacte est une préférence personnelle, plusieurs fournisseurs disponibles</td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Film d’étanchéité</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Tube Falcon de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Tube Falcon 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>HEPES ; Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>MES ; Acide 4-morpholineéthanesulfonique monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>robinetterie; Acide N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-3-aminopropanesulfonique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Objectif aérien 10X/0.45</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Des objectifs comparables peuvent être remplacés. Les objectifs 40X peuvent être utilisés pour l’imagerie de cellules uniques.</td></tr><tr><td>Stéréoscope de dissection</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>N’importe quel stéréoscope de dissection peut être utilisé.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry transgénique Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible auprès de Romero Lab</td><td></td><td>Première publication : Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible auprès de Romero Lab</td><td></td><td>Première publication : Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible auprès de Romero Lab</td><td></td><td>Première publication : Citation 2</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique monochromatique haute sensibilité</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>La marque et le modèle exacts peuvent varier, peuvent être remplacés par n’importe quelle caméra monochromatique haute sensibilité adaptée à l’imagerie cellulaire en direct.</td></tr><tr><td>Jeu de filtres GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroïque</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>N’importe quel ensemble de filtres GFP/FITC peut être substitué.</td></tr><tr><td>Jeu de filtres RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroïque</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>N’importe quel jeu de fichiers GFP/FITC peut être substitué.</td></tr><tr><td>Microscope épifluoescent inversé</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Tout microscope comparable avec commutation de filtre motorisée peut être utilisé. Les microscopes droits peuvent être utilisés avec des bains de perfusion ouverts et des objectifs à immersion dans l’eau.</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse statistique</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Tout logiciel doté de fonctionnalités comparables peut être remplacé par</td></tr><tr>un<td>logiciel</td><td>d’analyse d’images National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Tout logiciel doté de fonctionnalités comparables peut être substitué</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Tout logiciel doté de fonctionnalités comparables peut être remplacé</td></tr> <tr><td>par un logiciel doté de fonctionnalités comparablesLame de rasoir en acier au carbone à un seul tranchant</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71960</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Dossier de lames de microscopie</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Bec Bunsen</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Polystène Drosophila Flacons d’élevage avec Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Des articles comparables peuvent être remplacés.</td></tr><tr><td>Seau à glace de laboratoire de 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>NMDG ; N-Méthyl-D-glucamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Pointes de pipette barrière de 200 uL</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>200 et #956 ; Pipette à volume variable L</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr></tbody></table>

optique ph quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules malpighian drosophila melanogaster ayant un ph fluorescents génétiquement codé indicateur

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Transport épithélial ionique est vitale pour l’homéostasie ionique systémique ainsi que la maintenance des gradients électrochimiques cellulaires essentiels. PH intracellulaire (pHi) est influencée par de nombreux transporteurs ioniques et donc suivi pHj’ai est un outil utile pour évaluer l’activité de transporteur. PH de codé génétiquement moderne-indicateurs (GEpHIs) fournit des optique quantification de pHj’ai dans les cellules intactes à l’échelle cellulaire et subcellulaire. Ce protocole décrit la quantification en temps réel des cellulairesj’ai régulation du pH dans les tubes de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster par ex vivo live-image de pHerry, un GEpHI pseudo-ratiométrique avec un pKun bien adapté pour suivre les changements de pH dans le cytosol. Mouche adulte extraite MTs sont composés de sections morphologiquement et fonctionnellement distinctes de l’épithélium de la couche de cellules individuelles et peuvent servir comme un modèle d’étude du transport épithélial accessible et génétiquement tractable. GEpHIs offre plusieurs avantages par rapport aux colorants fluorescents conventionnels sensibles au pH et électrodes sélectives. GEpHIs pouvez étiqueter les populations cellulaires distincts autant éléments promoteurs appropriées sont disponibles. Cet étiquetage est particulièrement utile dans les ex vivo, in vivoet in situ préparations, qui sont par nature hétérogènes. GEpHIs permettent aussi de quantification de pHi dans les tissus intactes au fil du temps sans avoir besoin d’externalisation de traitement ou d’un tissu colorant répétées. Le principal inconvénient du GEpHIs actuel est la tendance à agréger dans les inclusions cytosoliques en réponse aux dommages de tissu et de construire la surexpression. Ces lacunes, leurs solutions et les avantages inhérents au GEpHIs sont illustrés dans ce protocole à travers l’évaluation de basolatérale transport de protons (H+) dans les cellules principales et stellaires fonctionnellement distinctes de mouche extraite MTs. Les techniques et les analyses décrites sont facilement adaptables à une grande variété de préparations de vertébrés et d’invertébrés, et la sophistication du dosage peut passer de laboratoires aux complexe détermination du flux ionique par l’intermédiaire de transporteurs spécifiques d’enseignement.

Tissus sains et une pièce d’identité de MTs antérieurs sont essentiels à la réussite du présent protocole. Au cours de la dissection, il faut pas directement toucher le système commercial multilatéral et à poignée unique par l’uretère en saisissant le système commercial multilatéral directement conduiront à la rupture (Figure 4 a– B). Lorsque MTs sont balayés à plat sur le toboggan, les tubules doivent toucher le moins possi...

Transport ionique cellulaire peut souvent être évaluée en contrôlant le pH intracellulaire (pHj’ai). Génétiquement Encoded pH-indicateurs (GEpHIs) fournissent une quantification optique du pH intracellulaire dans les cellules intactes. Ce protocole détaille la quantification du pH intracellulaire par cellulaires ex vivo live-imagerie de Malpighi de Drosophila melanogaster avec pHerry, une pseudo-ratiométrique codé génétiquement-indicateur de pH.

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

L'objectif général de ce protocole d'imagerie est de décrire la quantification du pH intracellulaire à l'aide d'un indicateur de pH génétiquement codé, et de montrer comment cette méthode peut être utilisée pour évaluer le transport de protons basolatéral dans un modèle de structure rénale d'insecte, le tube de Malpighien. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transport cellulaire, telles que la manière dont des protéines transporteurs spécifiques contribuent au déplacement épithélial de protons dans la régulation du pH intracellulaire. Le principal avantage de cette technique est que le transport cellulaire peut être évalué rapidement et facilement dans plusieurs zones fonctionnellement distinctes d'un épithélium intact.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régulation du pH et l'épithélium insecte, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme le néphron des mammifères et les cellules épithéliales en culture. Pour commencer cette procédure, positionnez deux jeux de pinces de maintien de soudage sur la platine du microscope d'imagerie, une pince de chaque côté. Ensuite, insérez les capillaires en verre courbés respectifs : la ligne d'entrée d'un côté, et la ligne de sortie reliée au vide de l'autre.Ensuite, les monter dans les pinces de maintien et les aligner avec la platine d'imagerie du microscope. Étendre de la graisse à vide sur le ruban adhésif du plafond et appuyer le séparateur de puits de perfusion adhésif sur le ruban afin d'enduire sa face inférieure de graisse. Détacher le séparateur de puits de perfusion adhésif et le placer, côté graisse vers le bas, au-dessus d'une lame recouverte de poly-L-lysine.Ensuite, retirez le séparateur de puits de perfusion afin de laisser des puits individuels délimités par de la graisse hydrophobe. Puis, ajoutez 200 microlitres de PBS ou de solution saline phosphate pour insectes à température ambiante dans le puits délimité par la graisse sur la lame recouverte de poly-L-lysine. Placez ensuite la lame sous le stéréomicroscope, versez du milieu de Schneider glacé dans la boîte de dissection et y transférer une seule mouche femelle anesthésiée.Tenez la drosophile par le thorax à l’aide d’une pince et utilisez l’autre main pour saisir délicatement l’abdomen postérieur. Ouvrez l’extrémité postérieure de la drosophile par de courts mouvements précis. Une fois que la pièce postérieure est visible, saisissez-en l’extrémité distale et détachez l’intestin et les atres des trachées sous-jacentes en tirant la pièce postérieure loin du corps par des tractions brèves et répétées.Ensuite, pincer délicatement les extrémités antérieures de l'uretère avec une pince fine, une fois que le deuxième ensemble d'extrémités est libéré de l'abdomen. Saisir les extrémités antérieures libres à l’aide de la baguette en verre en glissant la baguette sous l'uretère, de sorte que les tubules retombent de chaque côté. Puis, soulever verticalement les extrémités hors de la solution, puis tourner la baguette de manière à ce que les extrémités et l'uretère adhèrent à la face inférieure de la baguette.Abaisser l'uretère verticalement sur la lame, puis fixer l'uretère et sceller les extrémités distales des anses en appuyant davantage l'uretère contre la lame en verre. Utiliser l'extrémité fine de la tige en verre pour déplacer délicatement chaque tubule à travers la surface de la lame. Faire glisser la tige contre la lame afin d'éviter d'écraser le tubule, et déplacer la tige au-dessus du tubule, du distal vers le proximal, pour fixer toute la longueur de chaque tubule à la surface de la lame revêtue de poly-l-lysine.Le succès de cette technique dépend entièrement de l'identification précise et de la manipulation soigneuse des tubules de Malpighi antérieurs. Des tubules endommagés produiront des résultats incohérents. Ensuite, remettez le séparateur de puits adhésif en place sur la lame afin de former un petit puits rempli de liquide au-dessus du tubule monté.Ensuite, placez l'échantillon sur la platine du microscope. Positionnez respectivement les capillaires d'entrée et de sortie au-dessus des orifices d'entrée et de sortie du puits de perfusion. Dans cette procédure, allumez le microscope, la source de lumière et le système d'imagerie, puis ouvrez le logiciel d'imagerie.Regardez à travers les oculaires et ajustez manuellement la mise au point jusqu'à ce que la lumière de l'ante soit clairement visible en lumière transmise. Ensuite, cliquez sur l'onglet d'acquisition et sélectionnez 2x2 dans le menu déroulant d'atténuation, dans la section de chargement d'acquisition. Insérez un filtre de densité neutre de 5 % dans le trajet de la lumière, afin de réduire l'éclairement et minimiser le photoblanchiment.Cliquez sur le canal GFP dans le menu des canaux, puis cliquez sur direct pour observer le signal fluorescent via la caméra. Ensuite, réglez le curseur de temps pour ajuster le temps d'exposition, de sorte que les valeurs de pixels les plus brillants dans l'histogramme d'intensité soient d'environ 40 % de la valeur maximale. Puis cliquez sur arrêter pour interrompre l'illumination.Répétez les procédures dans le canal RFP et confirmez la présence du segment initial dilaté de l’antériori ante et l’absence d’agrégats cytosolides de m-cherry, ce qui indique un dommage tissulaire ou une surexpression. Ensuite, activez un protocole d’imagerie en laps de temps en cliquant sur la case à cocher série temporelle. Ajustez la durée dans le menu déroulant, dans la section série temporelle, à 10 minutes et le curseur d’intervalle à zéro, afin de définir la durée totale d’acquisition avec le nombre maximal d’images capturées.Ensuite, cochez les cases GFP et RFP dans la section des canaux. Ouvrez la ligne de PBS tamponné en activant le contrôleur de vanne approprié et démarrez le protocole d'acquisition en cliquant sur « démarrer l'expérience ». Après une minute, passez à la solution de chlorure d'ammonium pendant 20 secondes, en ouvrant la vanne appropriée et en fermant la ligne de PBS tamponné.Ensuite, revenir au PBS en fermant la ligne de chlorure d'ammonium et en rouvrant le robinet du PBS. Pour effectuer une étalonnage à deux points, retirer le séparateur de puits en le décollant de la lame sous-jacente et ôter les capillaires de perfusion fixés dans les pinces du puits d'imagerie. Appliquer ensuite 200 microlitres de tampon de calibration PBS à pH 7,4.Ensuite, retirez la solution du puits d'observation et remplacez-la par 200 microlitres supplémentaires de solution d'étalonnage. Répétez cette opération quatre fois afin d'assurer un échange complet de la solution. Incubez ensuite le prélèvement et la solution d'étalonnage pendant 30 minutes avant l'observation.Répétez le protocole d'imagerie en utilisant les mêmes paramètres déterminés précédemment, en modifiant uniquement la durée de capture d'image à une minute. Ajoutez ensuite 200 microlitres de tampon IPBS de calibration à pH 9. Retirez la solution du puits d'imagerie et remplacez-la par 200 microlitres supplémentaires de solution de calibration.Ensuite, incubez le pr&eacute;paratif dans la deuxi&egrave;me solution &eacute;talon pendant 10 minutes avant l'acquisition d'images, puis r&eacute;p&eacute;tez le protocole d'acquisition. Apr&egrave;s cela, examinez les images empil&eacute;es dans le logiciel d'analyse d'images afin de v&eacute;rifier qu'aucun pixel dans l'un ou l'autre canal n'est satur&eacute;, en cliquant sur MeanROI, et qu'aucune valeur indiqu&eacute;e dans l'histogramme d'intensit&eacute; n'a atteint la valeur maximale d&eacute;tectable, tout en parcourant la pile d'images &agrave; l'aide du curseur de trames. Ensuite, analysez la pile d'images en tra&ccedil;ant l'intensit&eacute; fluorescente et le rapport de fluorescence en fonction du temps ; ici, on observe la r&eacute;ponse fluorescente attendue &agrave; l'impulsion de chlorure d'ammonium dans les canaux sensibles et insensibles au pH de l'indicateur.Le rapport entre ces signaux révèle la transitoire du pH intracellulaire. Pour effectuer cette analyse, cliquez d'abord sur meanROI et sélectionnez l'outil de forme libre. Maintenez le clic gauche de la souris enfoncé pour tracer un MT de 50 micromètres et cliquez avec le bouton droit pour terminer le tracé de la ROI.Ensuite, répétez cela dans une zone adjacente au MT, afin de définir la ROI de fond. Cliquez ensuite sur l'intensité moyenne dans les mesures, puis créez un tableau de valeurs d'intensité en cliquant sur exporter, tableau de données, créer. Cliquez sur l'icône en forme d'horloge de configuration et désactivez tous les paramètres, sauf le temps et l'intensité moyenne.Cliquez avec le bouton droit sur l'onglet du tableau de données nouvellement créé, sélectionnez « Enregistrer sous » et exportez les données au format fichier csv. Ce qui est montré ici est une image en champ large, une fluorescence super-elliptique de la fluorine dans les cellules principales de l'antérior anté et les cellules étoilées de l'antérior anté. Notez que les cellules étoilées ont une forme allongée dans le segment initial, sont variables dans le segment transitionnel et présentent des prolongements cellulaires distincts dans le segment principal.Ce graphique montre les variations calibrées du pH intracellulaire en réponse à une impulsion de chlorure d'ammonium 40 millimolaire pendant 20 secondes dans des régions d'intérêt. Les courbes en pointillés représentent des ajustements exponentiels simples appliqués à la phase de récupération acide, suite au retrait du chlorure d'ammonium. À partir de ces ajustements, les valeurs de la constante de décroissance sont dérivées.Ce graphique montre le taux d'extrusion acide tracé en fonction du pH intracellulaire, et ce graphique montre le flux acide tracé en fonction du pH intracellulaire, dérivé des ajustements exponentiels de la figure précédente. Une fois maîtrisée, l'extraction des tubules de Malpighi peut être réalisée en moins de 10 minutes, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le succès dépend entièrement de la qualité de la dissection et d'une calibration précise de l'indicateur de pH.Cette préparation peut être combinée à d'autres capteurs biologiques génétiquement codés, tels que des indicateurs fluorescents du calcium et des halogénures, afin d'étudier le déplacement des solutés et la signalisation intracellulaire dans les cellules épithéliales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tubules de Malpighien sains de drosophile, imager un indicateur génétiquement codé du pH et quantifier le mouvement des protons dans les cellules épithéliales. N'oubliez pas que le travail avec le nitroizène peut être dangereux et endommager les préparations ; par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure, afin de s'assurer qu'il ne contamine aucun équipement destiné à être réutilisé.

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Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Découvrez la quantification optique du pH intracellulaire dans les tubules de Malpighi de Drosophila melanogaster à l'aide de l'indicateur génétiquement codé pHerry. Cette méthode permet d'évaluer le transport basolatéral des protons dans des types cellulaires épithéliaux distincts par imagerie en temps réel ex vivo.

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur (Vidéo) | JoVE Journal

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

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