Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
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Prenez la paroi corporelle des larves de drosophile, constituée de muscles innervés par les motoneurones pour former des jonctions neuromusculaires ou JNM.
La membrane musculaire postsynaptique au niveau de la JNM contient des protéines liées à la membrane en interaction, qui sont marquées avec des anticorps primaires.
Ajoutez des sondes de test de ligature de proximité, ou PLA, contenant des anticorps secondaires conjugués à des oligonucléotides simple brin. Incuber pour que les sondes se lient aux anticorps primaires.
Laver toutes les sondes non liées.
Incuber avec un tampon de ligature contenant des oligonucléotides connecteurs et des enzymes ligase.
La proximité des protéines en interaction facilite la liaison du connecteur aux sondes. La ligase scelle ensuite les lacunes, créant de l’ADN circulaire.
Lavez tous les connecteurs non liés.
Incuber avec une solution d’amplification contenant de la polymérase, qui amplifie l’ADN circulaire par amplification en cercle roulant.
Les sondes du détecteur marquées au fluorophore dans la solution se recuit à l’ADN amplifié et, lors de l’excitation, produisent un signal fluorescent.
Montez la paroi corporelle sur une lame pour visualiser le
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