Détection d’interactions protéine-protéine chez les larves de drosophile à l’aide d’un test de ligature de proximité

Prenez la paroi corporelle des larves de drosophile, constituée de muscles innervés par les motoneurones pour former des jonctions neuromusculaires ou JNM.

La membrane musculaire postsynaptique au niveau de la JNM contient des protéines liées à la membrane en interaction, qui sont marquées avec des anticorps primaires.

Ajoutez des sondes de test de ligature de proximité, ou PLA, contenant des anticorps secondaires conjugués à des oligonucléotides simple brin. Incuber pour que les sondes se lient aux anticorps primaires.

Laver toutes les sondes non liées.

Incuber avec un tampon de ligature contenant des oligonucléotides connecteurs et des enzymes ligase.

La proximité des protéines en interaction facilite la liaison du connecteur aux sondes. La ligase scelle ensuite les lacunes, créant de l’ADN circulaire.

Lavez tous les connecteurs non liés.

Incuber avec une solution d’amplification contenant de la polymérase, qui amplifie l’ADN circulaire par amplification en cercle roulant.

Les sondes du détecteur marquées au fluorophore dans la solution se recuit à l’ADN amplifié et, lors de l’excitation, produisent un signal fluorescent.

Montez la paroi corporelle sur une lame pour visualiser les interactions protéine-protéine marquées par fluorescence au niveau de la JNM.

Pour commencer le test, ajoutez une dilution de 1 à 5 dans un volume total d’au moins 200 microlitres de sonde PLA anti-souris et de sonde PLA anti-lapin plus dans 1 % de BSA sur les parois du corps. Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Après avoir utilisé le tampon de lavage A pour laver les parois du corps deux fois pendant 5 minutes chacune, ajoutez une dilution de 1 à 40 de ligase dans une solution de ligase. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, utilisez le tampon de lavage A pour laver les parois du corps deux fois pendant 2 minutes chacune avant d’ajouter une dilution de 1 à 80 de polymérase dans une solution d’amplification. Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Pour préparer les échantillons à l’imagerie, utilisez le tampon de lavage B pour laver les parois du corps deux fois pendant 10 minutes chacune. Utilisez ensuite une dilution de 100 X du tampon de lavage B pour effectuer un dernier lavage pendant 1 minute. Équilibrez les parois du corps en quelques gouttes de solution de montage pendant au moins 30 minutes.

À l’aide d’une pince fine, transférez soigneusement les parois du corps sur une plate-forme coulissante avec leurs cuticules vers le bas. Positionnez-les en rangées dans la même orientation dans une ou deux gouttes de solution de montage. Placez une lamelle de 22 millimètres sur 40 millimètres sur la préparation en prenant soin de ne pas générer de bulles d’air. Ensuite, utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lame.