Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines

L’objectif global de cette méthode est de déterminer si deux ou plusieurs protéines de jonction intercellulaire colocalisent au sein des cellules et d’évaluer davantage leur interaction physique via la co-immunoprécipitation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la biologie du domaine de la glande mammaire, y compris le rôle joué par les jonctions dans le développement normal et des maladies telles que le cancer du sein. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut fournir des informations significatives sur l’interaction protéine-protéine in vivo à un coût relativement faible.

Pour effectuer une coloration par fluorescence co-immuno, récupérez les lames microscopiques appropriées du congélateur. Fixez immédiatement les sections en les immergeant dans du formaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, plongez les lames dans une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante.

Laissez les diapositives là jusqu’à ce que vous passiez à l’étape suivante. Encerclez chaque section de la lame à l’aide d’une barrière hydrophobe disponible dans le commerce ou d’un stylo de laboratoire hydrofuge. Ajoutez immédiatement des gouttes de PBS dans le tissu et placez la lame dans une chambre d’histologie humaine pour le reste de la procédure.

Bloquez chaque section de tissu avec 100 à 200 microlitres de solution saline tamponnée à l’albumine et au tris sérique de vevin, 0,1 % de polysorbate-20, pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant que les échantillons sont bloqués, préparez les solutions d’anticorps primaires et secondaires en diluant les anticorps dans du polysorbate-20 à 0,1 % de TBS. Après avoir retiré la solution bloquante par aspiration, incuber les sections dans 100 à 200 microlitres de l’anticorps primaire dilué pendant 60 minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez la solution d’anticorps primaire par aspiration et lavez les sections avec 250 à 500 microlitres de TBS 0,1 % polysorbate-20 pendant cinq minutes. Retirez la solution de lavage par aspiration avant de répéter le lavage deux fois. Aspirez la solution de lavage et incubez les sections avec 100 à 200 microlitres de l’anticorps secondaire conjugué Fluoro-4 approprié pendant 60 minutes à température ambiante.

Après avoir retiré la solution d’anticorps secondaire par aspiration, laver les sections avec 250 à 500 microlitres de TBS 0,1 % polysorbate-20 pendant cinq minutes. Retirez la solution de lavage et répétez deux fois. Répétez ces étapes en utilisant la combinaison appropriée de corps primaires et secondaires pour toutes les protéines d’intérêt ultérieures.

Après l’élimination du lavage final, effectuez la coloration des noyaux en incubant la section avec 100 à 200 microlitres d’un milligramme par millilitre de DAPI et de TBS 0,1 % de polysorbate-20 pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez la solution DAPI et montez les lames à l’aide d’un support de montage soluble dans l’eau et non fluorescent et de lamelles. Placez les lames à plat dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant au moins huit heures.

Passez à l’imagerie microscopique à fluorescence comme décrit dans le protocole texte. Prélevez 500 à 1000 microgrammes de lysat et diluez-le dans du PBS jusqu’à un volume final de 200 microlitres dans chaque tube de 1,5 millilitre. Ajoutez l’anticorps contre l’antigène d’intérêt dans le premier tube de lysat et conservez-le sur de la glace.

Incuber les tubes pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un mélangeur à rouleaux tubulaires à basse vitesse. Le lendemain, ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre pour le prélavage. Placez les tubes contenant les billes sur le support magnétique et laissez les billes migrer vers l’aimant.

Retirez la mémoire tampon de stockage des billes à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Lavez les billes en ajoutant 500 microlitres de PBS 0,1 % polysorbate-20, et agitez vigoureusement les tubes pendant 10 secondes. Ensuite, remettez les tubes sur le support magnétique et laissez les billes migrer vers l’aimant.

Retirez l’excès de tampon de lavage par pipetage avec une pipette de 200 microlitres. Ajoutez le complexe de réaction d’anticorps lysat aux billes et incubez pendant 90 minutes à température ambiante sur le mélangeur à rouleaux. Après l’incubation, placez les tubes sur le support magnétique et laissez les billes migrer vers l’aimant.

À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, aspirez et jetez le lysat et placez les tubes sur de la glace. Lavez les billes deux fois en ajoutant 500 microlitres de PBS, en plaçant les tubes sur le support magnétique et en retirant le liquide comme précédemment. Pendant les étapes de lavage, évitez le vortex et conservez les échantillons sur de la glace.

Lavez les billes une fois avec du polysorbate-20 PBS 0,1 % sans vortex et jetez le dernier tampon de lavage à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Pour éluer, ajoutez 20 microlitres de glycine acide à 0,2 molaire dans les tubes et secouez-les pendant sept minutes sur le mélangeur à rouleaux. Après une centrifugation à grande vitesse pendant quelques secondes, récupérez le surnageant dans un tube frais et glacé.

Répétez les étapes de lavage et d’élution pour chaque tube. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon 4x à l’échantillon élué de 40 microlitres. Ajoutez immédiatement une molaire Tris aux échantillons élués, une goutte à la fois, jusqu’à ce que sa couleur devienne bleue, puis passez aux tubes suivants.

Faites bouillir les échantillons élués à 70 à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes. Chargez les lysats préparés et les échantillons précipités côte à côte dans un gel d’acrylamide SDS-PAGE. Faites fonctionner le gel dans un tampon de fonctionnement à 100 volts pendant environ 95 minutes, ou jusqu’à ce que le bord des protéines en migration atteigne le fond du gel.

Par la suite, transférez les gels sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF à l’aide d’un protocole standard. Ensuite, bloquez la membrane pendant une heure sur une bascule à basse vitesse dans du lait en poudre à cinq pour cent TTBS. Pour déterminer si la précipitation a réussi, sondez la membrane à l’aide du premier anticorps contre la protéine précipitée.

Diluez-le dans cinq pour cent de lait en poudre TTBS à la concentration recommandée par le fabricant. Incuber la membrane pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une plate-forme à bascule à agitation lente. Le lendemain, lavez la membrane trois fois pendant cinq minutes chacune avec TTBS sur une plate-forme à bascule à forte agitation.

Ensuite, incubez la membrane dans l’anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort, dilué dans du TTBS, pendant une heure à température ambiante sur une plate-forme à bascule à agitation lente. Effectuez trois à six lavages, chacun pendant cinq minutes, avec TTBS sur une plate-forme à bascule avec une agitation élevée. Analysez le signal de l’anticorps secondaire en incubant la membrane avec une solution de luminol disponible dans le commerce et suivez les instructions du fabricant.

Détectez le signal à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence. Pour identifier les protéines en interaction, répétez ces étapes en utilisant les anticorps appropriés sur le même transfert. Pour déterminer si les composants de la jonction lacunaire, de la jonction d’adhérence et de la jonction serrée peuvent interagir ensemble dans la glande mammaire, des tests de co-immunofluorescence ont été effectués.

Le test de co-immunofluorescence montre que la bêta-caténine, une protéine intégrale de la jonction adhérente, et la Connexine 26, une protéine de jonction lacune, co-localisent au niveau de la membrane cellulaire dans les glandes mammaires de souris au septième jour de lactation, comme en témoigne la couleur jaune. Les noyaux cellulaires sont visualisés avec une coloration DAPI bleue. Des cryosections de glandes mammaires au 18e jour de gestation ont été coupées et colorées par immunofluorescence pour Claudin 7, une protéine de jonction serrée en vert, E-Cadhérine, une protéine de jonction adhérente en rouge, et Connexin 26, une protéine de jonction lacune indiquée en bleu corail.

Les noyaux ont été colorés avec du DAPI bleu. La colocalisation d’E-Cadherin et de Claudin 7 est affichée sous la forme d’une couleur jaune à orange clair, tandis que la colocalisation de Connexin 26 avec E-Cadherin et Claudin 7 a entraîné une coloration ponctuée de blanc. Pour savoir quelles protéines jonctionnelles s’entremêlent et s’attachent physiquement au niveau de la membrane cellulaire, une co-immunoprécipitation a été réalisée à l’aide de tissus de glandes mammaires de souris allaitantes.

Les résultats ont montré que Connexin 43, un composant de la jonction lacunaire, interagit avec E-Cadherin et Claudin 7, mais pas avec Claudin 3. Ces résultats ont été confirmés par l’immunoprécipitation réciproque. Lorsque l’E-Cadhérine a été immunoprécipitée, elle a interagi avec Connexin 43 et Claudin 7.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours pour une co-immunofluorescence de quatre à huit lames, et les lames peuvent être imagées le lendemain si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de procédure de co-immunofluorescence, il est important de se rappeler de choisir différents anticorps conjugués Fluoro 4 élevés dans différents espaces avec des longueurs d’onde non chevauchantes et de sélectionner les billes magnétiques de protéine A ou G appropriées compatibles avec les anticorps utilisés pour la co-immunoprécipitation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer l’interaction des jonctions intercellulaires dans les glandes mammaires murines.

N’oubliez pas que le travail est extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.