Name: Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez l'analyse des interactions protéine-protéine et la co-localisation des jonctions intercellulaires dans les glandes mammaires murines. Cette méthode par co-immunoprécipitation et co-immunofluorescence révèle les mécanismes du développement mammaire et du cancer du sein.

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La PI est financée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (NSERC n ° 418233-2012); Un Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS), une bourse de carrière de la Fondation du cancer du sein du Québec et une subvention Leader Founds de la subvention de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation. ED a reçu une bourse de la Fondation universitaire Armand-Frappier.

Tous les protocoles d&#39;animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité universitaire de soins animaux (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada). 1. Identification de la co-localisation des protéines <ol><li> Du tissu aux glissières microscopiques REMARQUE: Les tissus et les sections doivent être manipulés sur de la glace carbonique. <ol><li> Accepter les glandes mammaires d&#39;un animal (pour une description complète de cette procédure, se référer à Plante et al. ) 14 . </li><li> Incorporer le tissu excisé dans un milieu de congélation / montage sur de la glace sèche. Ajoutez suffisamment de milieu pour couvrir la glande. Lorsque le milieu est solidifié, transférer les tissus dans un congélateur à -80 ° C pour une utilisation ultérieure 9 . </li><li> À l&#39;aide d&#39;un cryomicrotome réglé à ≤ -35 ​​° C, couper les tissus dans des sections de 7-10 μm d&#39;épaisseur et les placer sur des lames de microscope. REMARQUE: chaque fois que possible, placez deux sections sur chaque diapositive; La section de gauche sera utilisée commeContrôle négatif pour vérifier la spécificité des anticorps et l&#39;autofluorescence du tissu, tandis que le côté droit sera marqué avec les anticorps. </li><li> Conservez les sections à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Co-IF coloration <ol><li> Récupérez les glissières microscopiques appropriées du congélateur et réparez immédiatement les sections en les immergeant dans du formaldéhyde 4% pendant 15 minutes à température ambiante (RT). </li><li> Ensuite, immergez les glissières dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à la température ambiante. Laissez les diapositives dans PBS à RT jusqu&#39;à ce que vous passiez à l&#39;étape suivante. </li><li> Encerclez chaque section de la glissière à l&#39;aide d&#39;une barrière hydrophobe disponible dans le commerce ou d&#39;un stylo de laboratoire hydrofuge (voir la Table des matières ). Veillez à ne pas toucher le tissu. Ajoutez immédiatement des gouttes de PBS au tissu et placez la glissière dans une chambre d&#39;histologie humide pour le reste de la procédure. REMARQUE: Les sections de tissus doivent rester hydratées. AlternativeUtilisez une boîte avec un couvercle et placez des serviettes en papier humide sur le fond. </li><li> Bloquer chaque section de tissu avec 100-200 μL d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) à 3% -Tris-tampon de solution saline (TBS) -0,1% de polysorbate 20 (voir la Table des matières ) pendant 30 minutes à la RT. Alors que les échantillons bloquent, préparent les solutions d&#39;anticorps primaires et secondaires en diluant les anticorps dans du TBS-0,1% de polysorbate 20. NOTE: La concentration requise pour l&#39;anticorps est fournie par le fabricant; Voir le tableau des matériaux et les figures 1 et 2 pour des exemples, ainsi que Dianati et al. 9 . Bien qu&#39;il ne soit pas nécessaire de travailler dans le noir lors de l&#39;utilisation de la plupart des anticorps conjugués au fluorophore, évitez d&#39;exposer les solutions d&#39;anticorps ou les tissus colorés à une lumière intense et intense. </li><li> Enlever la solution de blocage par aspiration et incuber les coupes dans 100-200 μL de l&#39;anticorps primaire dilué pendant 60 minutes à la RT. AlternativelY, incuber avec l&#39;anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirez la solution d&#39;anticorps primaire par aspiration et lavez les sections avec 250-500 μL de TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 minutes. Enlever la solution de lavage par aspiration et répéter le lavage deux fois. </li><li> Retirer la solution de lavage par aspiration et incuber les sections avec 100-200 μL de l&#39;anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié pendant 60 minutes à la RT. </li><li> Enlever la solution d&#39;anticorps secondaire par aspiration et laver les sections avec 250-500 μL de TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 min. Retirer la solution de lavage et répéter deux fois. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5-2.8 en utilisant la combinaison appropriée d&#39;anticorps primaires et secondaires pour la protéine (s) subséquente (s) d&#39;intérêt. </li><li> Retirez la solution de lavage par aspiration et effectuez la coloration des noyaux en incubant la section avec 100-200 μL de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindol (DAPI) 1 mg / mL dans du TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 min àRT. </li><li> Retirez la solution DAPI par aspiration et montez les diapositives à l&#39;aide d&#39;un milieu de montage hydrosoluble et non fluorescent (voir la Table des matériaux ) et des lamelles. Procédez à une diapositive à la fois. REMARQUE: l&#39;incubation de la tache du noyau pendant plus de 5 minutes ne changera pas l&#39;intensité de la coloration. Alternativement, retirez la solution DAPI sur toutes les glissières et incupez les tissus dans PBS tout en montant les glissières. </li><li> Placez les diapositives à plat dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant au moins 8 h. Passez à l&#39;imagerie microscopique à fluorescence (voir figures 1 et 2 ). </li></ol></li><li> Imagerie microscopique <ol><li> Visualiser les anticorps secondaires conjugués au fluorophore à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal équipé des différents lasers nécessaires pour exciter les fluorophores à leurs longueurs d&#39;onde spécifiques. Remarque: Pour pouvoir visualiser les conduits et les alvéoles, on suggère un objectif 40X avec une ouverture numérique de 0,95. Un exempleE des réglages spécifiques est fourni à la figure 1 . </li><li> Vérifiez la localisation de chaque protéine individuellement en analysant l&#39;image en une seule longueur d&#39;onde. Note: À ce stade, il est important d&#39;analyser de manière critique la localisation des protéines de jonction. Pour pouvoir former des liens de jonction, ces protéines doivent être localisées à la membrane plasmique. </li><li> Déterminer la co-localisation des protéines en fusionnant les images numérisées avec les lasers aux différentes longueurs d&#39;onde. Remarque: La co-localisation des protéines peut être visualisée par le changement de couleur résultant de l&#39;émission de deux ou plusieurs fluorophores au même endroit et peut être mesurée à l&#39;aide du logiciel approprié ( figures 1 et 2 , voir également la référence 9). </li></ol></li></ol> 2. Étudier les PPI NOTE: Les glandes mammaires abdominales devraient être utilisées pour étudier les PPI, car les glandes thoraciques sont en étroite association avec le pectoralmuscles. Acceptez les glandes mammaires (pour une description complète de cette procédure, reportez-vous à Plante et al .) 14 et conservez-les à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. <ol><li> Préparation du lysat <ol><li> Placez du papier de pesage et 2 mL de tubes de microcentrifugeuse sur de la glace sèche pour les pré-refroidir avant de procéder aux prochaines étapes. </li><li> Prenez le tissu de la glande mammaire à partir de -80 ° C et conservez-les sur de la glace sèche. </li><li> Peser les tissus sur les papiers de pesage pré-refroidis, puis transférer le tissu dans des tubes de microcentrifugeuse de 2 mL (poignée sur glace sèche). Utiliser entre 50 et 100 mg de tissu par échantillon. Garder le tissu sur de la glace sèche jusqu&#39;à l&#39;étape 2.1.5. </li><li> Préparez la quantité requise de tampon de lyse à triple détergent additionné de NaF, NaVO 3 et inhibiteur de protéase / phosphatase, comme indiqué dans le Tableau des Matériaux , en utilisant les formules suivantes. Souris: tampon requis (μL) = poids du tissu de la souris (mg) x 3; Rat: requisTampon (μL) = poids du tissu du rat (mg) x 5. </li><li> Ajouter la quantité requise de tampon de lyse glacé (calculé à l&#39;étape 2.1.4) dans le tube de 2 ml contenant le tissu. REMARQUE: Dans les étapes 2.1.5-2.1.6, procédez à un seul tube à la fois. </li><li> Homogénéiser le tissu pendant 30 à 40 s en utilisant une homogénéisation continue sur un broyeur à tissus; Toujours garder le tube sur la glace. Réglez l&#39;homogénéisateur de tissu à vitesse moyenne et déplacez doucement le broyeur vers le haut et vers le bas à l&#39;intérieur du tube. </li><li> Répétez les étapes 1.6 et 1.7 avec les autres tubes. </li><li> Incuber les lysats sur de la glace pendant 10-30 min. </li><li> Centrifuger les tubes à 170 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Pendant ce temps, identifiez les tubes de microcentrifugeuse 6-10 (0.6 mL) pour chaque échantillon et conservez-les sur de la glace. </li><li> Une fois la centrifugation terminée, vérifiez les tubes. Assurez-vous qu&#39;ils contiennent une couche supérieure de lysats gras, clairs, jaune-à-rose (selon le stade de développement) et une pastille. </li><li> Créer un trou dans la couche lipidiqueEn utilisant une pointe de pipette de 200 μl pour accéder à la phase liquide. Changez la pointe et collectez le lysat sans perturber la pastille ou aspirer la couche lipidique. Aliquotez le lysat dans des tubes pré-marqués sur de la glace (étape 2.1.11) et rangez-les à -80 ° C. </li><li> Utilisez une aliquote pour quantifier la concentration de protéines en utilisant un kit approprié disponible dans le commerce (voir la Table des matières ). </li></ol></li><li> Immunoprécipitation indirecte <ol><li> Sur la glace, décongeler deux aliquotes du total des lysats de glande mammaire préalablement préparés. REMARQUE: Une aliquote sera utilisée pour l&#39;IP de la protéine cible, tandis que l&#39;autre servira de témoin négatif. </li><li> Recueillir 500-1,000 μg du lysat et diluer dans PBS pour atteindre un volume final de 200 μL dans chaque tube de 1,5 mL. NOTE: La quantité de lysat à utiliser dépend de l&#39;abondance de la protéine d&#39;intérêt et de l&#39;efficacité de l&#39;anticorps (voir la figure 3 pour uneN exemple, ainsi que le tableau des matériaux ). Pour optimiser pour chaque cible, il faut utiliser différentes quantités de lysat ( c.-à-d., 500, 750 et 1000 μg) et des anticorps ( c&#39;est-à-dire 5, 10 et 20 μg). Procédez comme suit (2.2.3-2.3.7.4). </li><li> Ajouter l&#39;anticorps contre l&#39;antigène d&#39;intérêt pour le premier tube de lysat et le garder sur la glace. REMARQUE: le montant requis est habituellement suggéré dans la fiche d&#39;instructions fournie par chaque entreprise (voir la table des matières ). </li><li> Dans le second tube, préparez un témoin négatif en ajoutant la même concentration de contrôle isotype IgG que l&#39;anticorps utilisé à l&#39;étape 2.2.3. </li><li> Incuber les tubes pendant une nuit à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux à basse vitesse. </li><li> Le lendemain, ajouter 50 μL de perles magnétiques à de nouveaux tubes de 1,5 mL pour pré-lavage. <ol><li> Sélectionnez soit des billes magnétiques Protein A ou Protein G en fonction de l&#39;affinité relative de l&#39;anticorps. </lI&gt; <li> Il est important d&#39;éviter l&#39;utilisation de perles agrégées; Mélanger doucement la suspension de talon jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit régulièrement remis en suspension avant de l&#39;ajouter aux tubes. </li></ol></li><li> Placez les tubes contenant les perles sur le support magnétique et permettez aux perles de migrer vers l&#39;aimant. Retirez le tampon de stockage des billes en utilisant une pipette de 200 μL. </li><li> Laver les perles en ajoutant 500 μL de PBS-0,1% de polysorbate 20 et tourbillonner les tubes vigoureusement pendant 10 s. </li><li> Remettre les tubes sur le support magnétique et permettre aux perles de migrer vers l&#39;aimant. </li><li> Enlever le tampon de lavage en excès par pipettage avec une pipette de 200 μL. </li><li> Ajouter le complexe de réaction (lysate-anticorps) de l&#39;étape 2.2.5 aux perles et incuber pendant 90 minutes à TA sur le mélangeur à rouleaux. </li><li> Placez les tubes sur le support magnétique et permettez aux perles de migrer vers l&#39;aimant. En utilisant une pipette de 200 μl, aspirer et jeter le lysat et placer les tubes sur de la glace. </li><li> Laver le cordonS en ajoutant 500 μL de PBS, en plaçant les tubes sur le support magnétique et en enlevant le liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 μL. Répétez cette étape de lavage. Pendant les étapes de lavage, éviter de tourbillonner et de garder les échantillons sur de la glace. </li><li> Laver les perles une fois avec PBS-0,1% de polysorbate 20 sans tourbillonner et jeter le dernier tampon de lavage en utilisant une pointe de pipette de 200 μL. </li><li> Pour éluer, ajouter 20 μL de glycine acide 0,2 M (pH = 2,5) aux tubes et les secouer pendant 7 minutes sur le mélangeur à rouleaux. </li><li> Centrifugez à grande vitesse pendant quelques secondes (rotation rapide) et récupérez le surnageant dans un tube glacé frais. </li><li> Répétez les étapes 2.2.14 et 2.2.15 pour chaque tube. NOTE: Le volume final sera de 40 μL. </li><li> Ajouter 10 μL de tampon 4x Laemmli dans l&#39;échantillon élué de 40 μL de l&#39;étape 2.2.16. REMARQUE: La couleur devient jaune en raison du pH acide. </li><li> Ajouter immédiatement 1 M Tris (pH = 8), une goutte à la fois, à l&#39;échantillon élu de l&#39;étape 2.2.18 jusqu&#39;à sa couleurDevient bleu. Procédez aux tubes suivants. </li><li> Faire bouillir les échantillons à partir de l&#39;étape 2.2.18 à 70-90 ° C pendant 10 min. Procéder immédiatement à l&#39;électrophorèse sur gel. Sinon, transférez les échantillons à un congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à ce que le chargement. </li></ol></li><li> Application en aval: électrophorèse sur gel suivie de Western Blot <ol><li> Préparer la séparation et l&#39;empilage des gels d&#39;acrylamide SDS-PAGE (1,5 mm d&#39;épaisseur) selon les procédures standard 15 . REMARQUE: Le choix du gel (8-15% d&#39;acrylamide, gradient: voir la Table des matériaux ) doit être déterminé en fonction de la taille moléculaire de la protéine à précipiter et des partenaires de liaison potentiels à analyser. Ces protéines doivent être résolues les unes des autres pour permettre une immunodétection appropriée. </li><li> Décongeler les échantillons liés à l&#39;immunoprécipitation (IP) (étape 2.2.20) sur de la glace. </li><li> Préparez des lysats de protéines à partir des mêmes échantillons (utilisés pour la procédure IP ci-dessus). Utiliser 50Μg de lysat total et ajouter un tampon d&#39;échantillon 4X Laemmli. Faites bouillir les échantillons à 70-90 ° C pendant 5 minutes et placez-les sur de la glace jusqu&#39;à ce qu&#39;ils le chargent. NOTE: Ces échantillons seront chargés à côté de l&#39;échantillon élué IP pour démontrer la présence de protéines précipitées dans le lysat total. </li><li> Charger les lysats préparés à partir de l&#39;étape 2.3.3 et les échantillons précipités de l&#39;étape 2.2.20 côte à côte dans un gel d&#39;acrylamide et les exécuter dans un tampon de roulement (10x tampon courant: 30.3 g de Tris, 144.1 g de glycine et 10 G de SDS dans 1 L d&#39;eau distillée) à 100 V pour environ 95 minutes, ou jusqu&#39;à ce que le bord des protéines migrantes atteigne le fond du gel. </li><li> Transférer les gels sur une membrane de nitrocellulose ou PVDF en utilisant un protocole standard 9 , 15 . </li><li> Bloquer la membrane pendant 1 h sur une bascule à basse vitesse dans du lait sec à 5% -TTBS (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl et 0,05% de polysorbate 20). </li><li> Identifiez si les précipitations ont été obtenues. <ol><li> Probe de la membrane en utilisant le premier anticorps contre la protéine précipitée, dilué dans 5% de TTBS au lait sec à la concentration recommandée par le fabricant, pendant une nuit à 4 ° C sur une plate-forme basculante avec une agitation lente. REMARQUE: voir le tableau des matériaux pour les recommandations. </li><li> Le lendemain, lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TTBS sur une plate-forme basculante avec une forte agitation. </li><li> Incuber la membrane dans l&#39;anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort (HRP), dilué dans TTBS, pendant 1 h à la RT sur une plate-forme basculante avec une agitation lente. NOTE: En variante, un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome peut être utilisé si un appareil approprié pour détecter le signal est disponible. </li><li> Effectuer 3 à 6 lavages, chacun pendant 5 min, avec TTBS sur une plate-forme basculante avec une forte agitation. Analyser le signal de l&#39;anticorps secondaire en incubant la membrane avec un produit commercial(Voir la Table des matériaux ) et suivre les instructions du fabricant. Détecter le signal en utilisant un système d&#39;imagerie par chimioluminescence (voir la Table des matières ). REMARQUE: pour un protocole détaillé sur l&#39;analyse Western Blot, voir référence 16. </li></ol></li><li> Pour identifier les protéines qui interagissent, procédez aux étapes 2.3.7.1-2.3.7.4 en utilisant les anticorps appropriés sur le même buvard. NOTE: Si les protéines interagissent, les partenaires de liaison seront co-immunoprécipités avec la protéine cible et seront donc détectables par Western Blot. L&#39;étape 2.3.8 peut être répétée avec plus d&#39;anticorps pour déterminer si d&#39;autres protéines résident dans le même complexe de protéines, à condition que les poids moléculaires des protéines soient suffisamment différents pour être bien séparés sur le gel et la membrane. </li><li> Pour confirmer que les partenaires de liaison identifiés ne sont pas des artefacts, une IP réciproque devrait être effectuée. REMARQUE: ceci est effectué en répétantÉtapes 2.2.1-2.2.20 avec le même lysat mais précipitant l&#39;un des partenaires de liaison identifiés à l&#39;étape 3.8. Ensuite, les étapes 3.1-3.8 sont répétées en utilisant l&#39;anticorps primaire contre la première protéine d&#39;intérêt. </li></ol></li></ol>

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<li>Bertocchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+cadherin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions.</a> Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Fredriksson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+proteins+surrounding+occludin+and+claudin-4+reveals+their+proximity+to+signaling+and+trafficking+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li>
<li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à déclarer.

Les interactions cellule-cellule par des jonctions sont nécessaires pour la bonne fonction et le développement de nombreux organes, comme la glande mammaire. Des études ont montré que les protéines de jonction peuvent réguler la fonction et la stabilité l&#39;une de l&#39;autre et activer la transduction du signal en s&#39;attachant mutuellement à la membrane 10 de la cellule. Les protocoles présentés dans le manuscrit actuel ont fourni des résultats intéressants sur l&#39;expression, la localisa...

La croissance et le développement des glande mammaire surviennent principalement après la naissance. Cet organe se remodèle constamment tout au long de la vie reproductive d&#39;un mammifère 1 . L&#39;épithélium de la glande mammaire adulte est constitué d&#39;une couche interne de cellules épithéliales luminescentes et d&#39;une couche externe de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, entourée d&#39;une membrane basale 2 . Pour une bonne évaluation de la structure et du développement des glandes mammaires, le lecteur peut se référer à Sternlicht 1 . Les interactions cellule-cellule via l&#39;intervalle (GJ), les contraintes (TJ) et les adhérences (AJ) sont nécessaires pour le développement normal et le fonctionnement de la glande 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les principaux composants de ces jonctions dans la glande mammaire murine sont Cx26, Cx30, Cx32 et Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 et -7 etZO-1 (TJ); Et E-cadhérine, P-cadhérine et β-caténine (AJ) 7 , 8 . Les niveaux d&#39;expression de ces différentes protéines de jonction varient d&#39;une manière dépendant de la phase pendant le développement de la glande mammaire, suggérant des besoins différentiels d&#39;interaction cellule-cellule 9 . GJ, TJ et AJ sont liés structurellement et fonctionnellement et attachent d&#39;autres protéines structurales ou réglementaires aux sites voisins des cellules adjacentes, créant ainsi un lien de jonction 10 . La composition du lien de jonction peut influer sur le pontage avec le cytosquelette sous-jacent, ainsi que sur la perméabilité et la stabilité du nexus et peut influencer la fonction de la glande 8 , 9 , 10 , 11 . Les composants des jonctions intercellulaires résidant dans les nexus de jonction ou interagissent les uns avec les autres à la différenceDes stades de développement importants du développement de la glande mammaire ont été analysés récemment en utilisant une co-immunofluorescence (co-IF) et une co-immunoprécipitation (co-IP) 9 . Bien que d&#39;autres techniques permettent d&#39;évaluer l&#39;association fonctionnelle entre les protéines, ces méthodes ne sont pas présentées dans ce manuscrit. Comme les protéines fonctionnent simplement pour fonctionner, l&#39;étude des interactions protéine-protéine (IPP), telles que les transductions de signaux et les cascades biochimiques, est essentielle pour de nombreux chercheurs et peut fournir des informations importantes sur la fonction des protéines. La co-IF et l&#39;analyse microscopique permettent d&#39;évaluer quelques protéines qui partagent le même espace sous-cellulaire. Cependant, le nombre de cibles est limité par les anticorps, qui doivent être élevés chez différents animaux et par l&#39;accès à un microscope confocal équipé de différents lasers à longueurs d&#39;onde et un détecteur spectral pour le multiplexage. Co-IP confirme ou révèle des interactions physiques à haute affinité entreDeux protéines ou plus résidant dans un complexe protéique. Malgré le développement de nouvelles techniques, telles que le transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET) 12 et le test de ligature de proximité (PLA) 13 , qui peuvent simultanément détecter la localisation et les interactions des protéines, la co-IP reste une technique appropriée et abordable pour étudier les interactions entre Protéines endogènes. La méthode étape par étape décrite dans ce manuscrit facilitera l&#39;étude de la localisation des protéines et des IPP et soulignera les pièges à éviter lors de l&#39;étude des PPI endogènes dans les glandes mammaires. La méthodologie commence par la présentation des différentes procédures de conservation des tissus requis pour chaque technique. La partie 1 présente comment étudier la co-localisation des protéines en trois étapes: i) la section des glandes mammaires, ii) l&#39;étiquetage double ou triple de différentes protéines utilisant la technique co-IF, et iii) l&#39;imagerie deLocalisation des protéines. La partie 2 montre comment précipiter une protéine endogène et identifier ses protéines qui interagissent en trois étapes: i) préparation de lysat, ii) immunoprécipitation indirecte de protéines, et iii) identification de partenaire de liaison par SDS-PAGE et Western Blot. Chaque étape de ce protocole est optimisée pour les tissus de glandes mammaires des rongeurs et génère des résultats de haute qualité, spécifiques et reproductibles. Ce protocole peut également être utilisé comme point de départ pour les études de PPI dans d&#39;autres tissus ou lignées cellulaires.

St<table><tbody><tr><td></td><td>. Constant, Québec, Canada</td><td></td><td>C57BL/6 Femals ; jour de gestation 18 (P18) et jour de lactation 14 (L14), Charles River Canada&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissoudre 80 g de NaCl (F.W. : 58,44), 2 g de KCl (F.W. 74,55), 26,8 g de Na2HPO4&#183 ; 7H2O (F.W. 268.07) et 2,4 g KH2PO4 (F.W. : 136.09) dans 800 mL d’eau distillée ; 2) Ajustez le PH à 7,4 ; 3) Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final de 1 L.</td></tr><tr><td>TBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissoudre 60,5 g de TRIS, 87,6 g de NaCl dans 800 mL d’eau distillée ; 2) Ajuster le pH à 7,5 ; 3) Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final de 1 L.</td></tr><tr><td colspan="4">Part 1 : Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Milieu de congélation</td><td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td><td>95067-840</td><td>Composé de sections congelées VMR&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Mississauga, ON, Canada</td><td>956640</td><td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz</td></tr><tr><td>Lames</td><td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&nbsp ; Scientifiques&nbsp ; ESBE&nbsp ; St-Laurent, QC, Canada</td><td>BLM1001C</td><td>Lames recouvertes d’or à profil haut</td></tr><tr><td>Stylo Pap</td><td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td><td>8899</td><td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td></tr><tr><td>Lames microscopiques</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>12-550-15</td><td>Fisherbrand&nbsp ; Superfrost Plus Lames de microscope</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td><td>FOR201.1</td><td>Forlmadehyde</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, Californie, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution bloquante</td><td></td><td></td><td>3 % BSA dans la</td></tr><tr><td>solution</td><td></td><td></td> de lavage <td>TBS-Tween 20 0,1 %</td></tr> <tr><td>Polysorbate 20</td><td>Oakville, ON, Canada</td><td>P 9416</td><td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Supports de montage</td><td>Cedarlane, Burlington, ON</td><td>17984-25(EM)</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Anticorps premiers et secondaires</td><td>Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis</td><td>Voir les commentaires</td><td>E-Cadherin (4A2) Souris mAb (#14472s) 1/50 (Signalisation cellulaire) avec anti-souris IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Signalisation cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie, Waltham, MA, États-Unis & Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>Voir les commentaires</td><td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) avec IgG anti-lapin Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Signalisation cellulaire)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires&nbsp ;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc., Californie, États-Unis ; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada.</td><td>Voir les commentaires</td><td>&beta ;-Anticorps anti-caténine (C-18) : sc-1496 (SANTA CRUZ) avec IgG anti-chèvre (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Sonde moléculaire (Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie, Waltham, MA, États-Unis & Cell Signaling, Beverly, MA, États-Unis</td><td>Voir les commentaires</td><td>Connexin26&nbsp ; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) avec anti-souris IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Coloration des noyaux</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>D1306</td><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate) 1/1 000 po Microscope fluorescent PBS</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Canada, Mississauga, ON, Canada</td><td></td><td>Laser microscopique confocal Nikon A1R+ équipé d’un détecteur spectral&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images IF</td><td>Nikon Canada, Mississauga, ON, Canada</td><td></td><td>Logiciel NIS-elements (version 4)</td></tr><tr><td colspan="4">Part 2 : Immunoprécipitation</td></tr><tr><td>Triple-detergent Tampon de lyse (100&nbsp ; mL) pH = 8,0</td><td></td><td></td><td>1) Mélanger 50 mM TRIS (P.F. : 121,14), 150&nbsp ; mM NaCl (F.W. : 58,44), 0,02 % d’azoture de sodium, 0,1 % de SDS, 1 % de NONIdET P40, 0,5 % de désoxycholate de sodium dans 80 mL de H2O. 2) Ajuster le pH à 8,0 avec HCl 6&nbsp ; N (~0,5&nbsp ; mL). 3) Réglez le volume à 100&nbsp ; mL. Conservez-le au réfrigérateur. Le jour de l’extraction des protéines, utilisez 1/100 de NaVo3, 1/100 d’inhibiteur de protéase/phosphatase et 1/25 de NAF dans la quantité calculée de tampon de lyse au détergent triple : solution de fluorure de sodium (mère) 1,25&nbsp ; M (P.F. : 41,98), Orthovanadate de sodium (stock) Solution 1 M (F.W. : 183.9)</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase/phosphatase</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>78441</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Stop, sans EDTA (100x)</td></tr><tr><td>Dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, États-Unis</td><td>23225</td><td>Kit de dosage des protéines Pierce BCA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>FTH-115</td><td>Power 125, Modèle FTH-115</td></tr><tr><td>Perles magnétiques et support</td><td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td><td></td><td>Système de billes magnétiques PureProteome Protein G (LSKMAGG02)</td></tr><tr><td>Solution de lavage pour IP</td><td></td><td></td><td>PBS ou PBS-Tween20 0,1 % selon l’étape</td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation</td><td>Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis</td><td>Voir les commentaires</td><td>IgG Lapin (lapin (DA1E) mAb IgG Contrôle des isotypes (#3900s) (Signalisation cellulaire) 0.5 &micro ; L/200 et micro ; L</td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation</td><td>Signalisation cellulaire, Beverly, MA, USA</td><td>Voir les commentaires</td><td>IgG Souris souris (G3A1) mAb IgG Contrôle des isotypes (#5415s) (Signalisation cellulaire) 0,5 & micro ; L/200 et micro ; L</td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td><td>Voir les commentaires</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4&nbsp ; et micro ; L/200&nbsp ; et micro ; L</td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation</td><td>Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis</td><td>Voir les commentaires</td><td>E-cadhérine (4A2) Souris mAb (#14472s) (Signalisation cellulaire) 1 &micro ; L/200 et micro ; L</td></tr><tr><td>Laemmli buffer&nbsp ;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td><td>1610747</td><td>4x Laemmli Sample Buffer (Ajouter du &beta ;-mercaptoéthanol selon les recommandations du fabricant)</td></tr><tr><td>Glycine acide&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>PB381-5</td><td>0,2 M de glycine ; ajuster le pH = 2,5 avec HCl&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific, Burlington (Ontario)</td><td>BP152-1</td><td>1 M (pH = 8)&nbsp ;</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gels d’acrylamide&nbsp ;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1610180 -5</td><td>TGX Solutions d’acrylamide FastCast sans taches (7,8 %, 10 %, 12 %)</td></tr><tr><td>Tampon de fonctionnement 10x&nbsp ;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>Tris 30.3&nbsp ; g/glycine 144,1&nbsp ; g /FDS 10&nbsp ; g dans 1 L d’eau distillée</td></tr><tr><td>Membranes</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>Membranes PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Méthode</td></tr><tr>de<td>transfert</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704155</td><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td></tr><tr><td>Dry Milk</td><td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td><td></td><td>Lait écrémé instantané sans gras en poudre, Carnation</td></tr><tr><td>Solution bloquante pour Lait</td><td></td><td></td><td>en poudre 5 % dans le TBS-Tween 20 0,1 %</td></tr><tr><td>Solutions de lavage pour les transferts</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0,1 %</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires contre les transferts (10 % mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario et Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>Voir les commentaires</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2 500 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10&nbsp ; mL)</td><td>Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>Voir les commentaires</td><td>E-cadhérine (24E10) mAb de lapin 1/1 000 (#3195s) (signalisation cellulaire) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10&nbsp ; mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>Voir les commentaires</td><td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10&nbsp ; mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>Voir les commentaires</td><td>Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Solution de luminol pour la détection de signaux sur les transferts</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1705061</td><td>Clarity Western ECL Blot</td></tr><tr><td>Substrate Imaging blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1708280</td><td>Imagerie ChemiDoc MP système</td></tr><tr><td>Analyse des transferts</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td></td><td>Logiciel ImageLab 5.2</td></tr></tbody></table>

analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de gap, tight et adherens junctions dans les glandes mammaires murines

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Les interactions cellule-cellule jouent un rôle central dans la préservation de l&#39;intégrité tissulaire et la barrière entre les différents compartiments de la glande mammaire. Ces interactions sont fournies par des protéines de jonction qui forment des liens entre des cellules adjacentes. La délocalisation des protéines jonctionnelles et la réduction des associations physiques avec leurs partenaires de liaison peuvent entraîner une perte de fonction et, par conséquent, une dysfonction organique. Ainsi, l&#39;identification de la localisation des protéines et des interactions protéines-protéines (IPP) dans les tissus normaux et liés à la maladie est essentielle pour trouver de nouvelles preuves et des mécanismes conduisant à la progression des maladies ou des altérations du statut de développement. Ce manuscrit présente une méthode en deux étapes pour évaluer les IPP dans les glandes mammaires murines. Dans la section de protocole 1, on décrit un procédé pour effectuer une co-immunofluorescence (co-IF) en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines d&#39;intérêt, suivi d&#39;anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes. Bien que co-IF tousPour la démonstration de la proximité des protéines, il permet d&#39;étudier leurs interactions physiques. Par conséquent, un protocole détaillé pour la co-immunoprécipitation (co-IP) est fourni dans la section de protocole 2. Cette méthode est utilisée pour déterminer les interactions physiques entre les protéines, sans confirmer si ces interactions sont directes ou indirectes. Au cours des dernières années, les techniques de co-IF et co-IP ont démontré que certaines composantes des jonctions intercellulaires co-localisent et interagissent ensemble, créant des liens de jonction dépendant de la scène qui varient au cours du développement de la glande mammaire.

Pour déterminer si les composants GJ, AJ et TJ peuvent interagir ensemble dans la glande mammaire, les analyses de co-IF ont d&#39;abord été effectuées. Cx26, une protéine GJ et une β-Catenine, une protéine AJ, ont été sondées avec des anticorps spécifiques et ont révélé des anticorps à base de souris fluorés-647 (vert, pseudocolor) et chèvre-568 (rouge) respectivement ( figure 1B et C ) . Les données ont montré qu&#39;ils co-localisent à la membrane cel...

Les jonctions inter-cellulaires sont indispensables pour les fonctions et le développement de la glande mammaire. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour l&#39;étude des interactions protéines-protéines (IPP) et la co-localisation à l&#39;aide de glandes mammaires murines. Ces techniques permettent d&#39;étudier la dynamique de l&#39;association physique entre les jonctions intercellulaires à différents stades de développement.

Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

L'objectif général de cette méthode est de déterminer si deux protéines ou plus de jonction intercellulaire se co-localisent au sein des cellules et d'évaluer davantage leur interaction physique par co-immunoprécipitation. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en biologie du tissu mammaire, notamment les rôles joués par les jonctions dans le développement normal et dans des pathologies telles que le cancer du sein. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à fournir des informations significatives sur les interactions protéine-protéine in vivo à un coût relativement faible.Pour effectuer une coloration immunofluorescente double, sortez les lames microscopiques appropriées du congélateur. Fixez immédiatement les sections en les immergeant dans du formaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, immergez les lames dans du tampon salin phosphate à température ambiante.Laisser les lames en place jusqu'à la prochaine étape. Entourer chaque section de la lame à l’aide d’une barrière hydrophobe disponible dans le commerce ou d’un stylo imperméable pour laboratoire. Ajouter immédiatement des gouttes de PBS sur le tis

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette méthode décrit comment disséquer et d'évaluer le développement des glandes mammaires et de la fonction de souris. Excisées glandes mammaires sont évalués pour le degré de développement en utilisant mount ensemble, tandis que l'éjection du lait est évaluée en utilisant une ocytocine essai basé sur la contraction des cellules myoépithéliales.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

Nous présentons une approche de recalage d’images pour la reconstruction volumique histologique tridimensionnelle (3D), qui facilite l’étude des modifications d’un organe au niveau des macrostructures constituées de cellules. En utilisant cette approche, nous avons étudié les changements 3D entre les glandes mammaires de type sauvage et Igfbp7-null.

Reconstruction de 3-Dimensional Volume histologique et son application à l&#39;étude de souris glandes mammaires

Cette présentation démontre une méthode dans laquelle l’électroporation de cellules adhérentes et cultivées est utilisée pour l’étude de la communication intercellulaire et jonctionnelle, tandis que les cellules se développent sur une lame recouverte d’oxyde d’indium-étain conducteur et transparent.

Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Nous avons développé une méthode pour éliminer, traiter, sectionner et tacher avec succès, pour l'évaluation histopathologique, des tissus mammaires qui avaient initialement été fixés sur des diapositives en tant que supports complets. Cette méthode peut favoriser la collecte et l'évaluation des montants entiers de la glande mammaire dans les études de référence sur les tests reproductifs et de développement.

Section des pansements mammaires complets pour l&#39;identification des lésions

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Ce protocole décrit une nouvelle fenêtre d’imagerie mammaire avec un couvercle remplaçable (R.MIW). La microscopie intravitale après implantation du R.MIW permet une imagerie longitudinale et multi-jours de la glande mammaire saine et malade avec une résolution cellulaire au cours des différents stades de développement.

Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

Le présent protocole décrit une technique simple d’imagerie intravitale de la glande mammaire de la souris allaitante par balayage laser, microscopie confocale et multiphotonique.

Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

Découvrez l'analyse des interactions protéine-protéine et la co-localisation des jonctions intercellulaires dans les glandes mammaires murines. Cette méthode par co-immunoprécipitation et co-immunofluorescence révèle les mécanismes du développement mammaire et du cancer du sein.

Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines

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