Name: Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Découvrez l'enregistrement de l'activité neuronale induite par la température dans le bulbe olfactif de Xenopus laevis. Cette méthode utilise l'imagerie calcique pour étudier la sensibilité thermique des neurones olfactifs.

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Ce projet a été financé par le DFG Excellence Cluster 171, le Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, le Bernstein Center for Computational Neuroscience et l’ENC-Network, un programme doctoral conjoint Erasmus Mundus. Les auteurs remercient Stephan Junek, Mihai Alevra et Guobin Bao d’avoir fourni des codes MATLAB et des programmes personnalisés pour l’évaluation d’images et l’analyse de données.

<ol><li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Grueneberg+ganglion+neurons+share+molecular+and+functional+features+with+C.+elegans+amphid+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons.</a> Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).</li>
<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
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<li>Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-controlled+device+for+the+application+of+odors+to+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrophysiol+Tec%22%5BJournal%5D)">A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals.</a> J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).</li>
<li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSONE%22%5BJournal%5D)">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li>
<li>Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+cytoskeletal+elements+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).</li>
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<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical Calcium Indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Salome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+using+acousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+imaging+for+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet imaging for systems neuroscience.</a> Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).</li>
<li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+silent+cells%2C+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes présentées ici visent à la transformation de la température d&#39;enregistrement dans le bulbe olfactif de têtards de Xenopus laevis. Les taches de premier protocole et des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif et fournit une préparation de l&#39;échantillon, dans lequel le système olfactif reste essentiellement intact. Ainsi, l&#39;activation de la γ-glomérule sensible à la température peut être contrôlée et comparée à ses glomérules voisins chimio-sensibles. L&#39;innervation bilatérale unique de cette glomérule est visualisée par électroporation cellulaire avec spectralement différents colorants. En outre, bolus de chargement permet la coloration des cellules mitrales couvrant un grand volume dans le bulbe olfactif. Les signaux induits par la température de traitement de réseau de neurones est révélée par la prise de mesures de calcium avec des applications répétées de relance et d&#39;analyser ensuite les données avec l&#39;imagerie activité de corrélation. Le protocole met en évidence deux coloration sophistiquée proce<html> dures, qui exigent tous deux la manipulation et à la pratique prudente afin d&#39;obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles. Au cours de l&#39;électroporation toute blessure des animaux doit être évitée, en particulier lors du positionnement des électrodes dans les narines. De manière optimale, sans contact avec l&#39;épithélium olfactif doit se produire. Notez que les animaux sont encore vivants après la procédure d&#39;électroporation et de leur temps de récupération doivent être prises en compte. Si la coloration est encore trop faible après un tour de l&#39;électroporation, qui peut se produire en fonction des types de colorants utilisés, son intensité peut être améliorée en augmentant la concentration de colorant dans les narines. Etant donné que les molécules de dextrane couplées sont transportés par l&#39; intermédiaire de plusieurs mécanismes , y compris le transport axonal lent (à une vitesse de 1 à 2 mm / jour 10) et la diffusion passive, une autre solution consiste à attendre 48 heures après l&#39; électroporation avant de sacrifier les animaux. En variante, l&#39;électroporation peut être répétée après un jour de récupération. jove_content &quot;&gt; Bolus chargement est une étape cruciale puisque la quantité de colorant entrant dans les cellules mitrales est difficile à réguler et dépend de différents paramètres tels que la taille de la pointe de la pipette et l&#39;emplacement de l&#39;application. Le suivi de la procédure sous un microscope à fluorescence confocale se révèle être utile pour le réglage de la durée d&#39;application de colorant et générant ainsi des résultats de coloration similaires dans les préparations. en outre, les têtards précédemment électroporation devrait être utilisé pour déterminer la meilleure position pour l&#39;application du colorant en identifiant la position du petit groupe (comprenant le γ-glomérule). la plupart étape critique lors des mesures est d&#39;éviter à la fois décalage et le blanchiment de l&#39;échantillon. le décalage peut être évité en positionnant soigneusement le flux Ringer sous le microscope. Comme pour limiter le blanchiment de la zone d&#39;intérêt, le temps de mesure doit être réduite à l&#39;essentiel . Bolus chargement de coloration avec des colorants sensibles au calcium ne fournit qu&#39;une trèscontraste limité puisque les cellules saines ont généralement faible taux de calcium et donc montrer faible fluorescence basale. L&#39;application de l&#39;imagerie activité de corrélation contourne cette limitation en générant contraste sur la base de l&#39;activité et met en évidence les structures avec des signaux calciques similaires. Cette méthode d&#39;analyse post-acquisition calcule le facteur de corrélation entre le signal de calcium d&#39;une région sélectionnée d&#39;intérêt (trace de référence) et celle de chaque pixel individuel dans le volume 3D. Par conséquent, les résultats obtenus dépendent fortement sur le modèle d&#39;activité sélectionnée comme trace de référence. Si l&#39;objectif principal est de visualiser les modèles d&#39;innervation des cellules mitrales, un signal de référence dérivé de l&#39;activité neuronale spontanée est préférable, et en choisissant les cellules mitrales les plus actifs produira les meilleurs résultats. Pour révéler les réseaux chimio- ou thermosensibles de cellules mitrales, des traces de référence ne contenant que des réponses aux deux histidine ou Ringer à froid doivent être choisis. La sélection d&#39;un ensemble de glomérule or soma cellulaire mitrale comme région d&#39;intérêt ne peuvent pas toujours fournir une trace de référence clair, surtout si les structures répondant aux deux stimuli différents sont couchés les uns sur les autres. Dans un tel cas, il est souvent utile de sélectionner une zone plus petite du glomérule ou le corps cellulaire comme région d&#39;intérêt. Au cours des dernières décennies, l&#39; électroporation a été décrite comme une méthode efficace pour colorer les cellules uniques ou multiples 11,12. Ici, il est utilisé pour marquer spécifiquement les neurones récepteurs olfactifs. Des molécules de dextrane conjuguées donnent le rendement le plus élevé, et la non-colorants sensibles au calcium, la gamme de choix est large et couvre tout le spectre généralement utilisé dans la microscopie à fluorescence 13. Cependant, les colorants sensibles au calcium, qui sont soumises à une électroporation avec succès dans les neurones récepteurs olfactifs sont actuellement limitées à dextran de calcium-vert, et Fluo-4 dextran si elle est toujours disponible dans le commerce. En outre, les enregistrements ciblent principalement superficial couches sur la face ventrale du bulbe olfactif seulement, car la profondeur des techniques de mesure rapides de pénétration est limitée. l&#39;imagerie à deux photons peut partiellement surmonter cette limitation mais manque souvent de vitesse et limite la quantité de colorants sensibles au calcium sélectionnables davantage. Nous avons décrit ici un protocole de mesure de l&#39;activité induite par la température dans le bulbe olfactif. Le neuropile du cerveau est analysé comme un volume en trois dimensions pour visualiser les réseaux cellulaires complexes impliqués dans le traitement olfactif de la température. Mesure de l&#39; activité induite par la température dans le bulbe olfactif a été très récemment rapporté 5 et nécessite une procédure spécialement personnalisée combinant différentes techniques. Un atout majeur des techniques présentées ci-dessus est que des centaines de cellules sont imagées en trois dimensions dans une préparation où la majeure partie du système olfactif reste intact. Ces avantages ont des exigences élevées sur les techniques de coloration, ainsi que le cerveau pla réparation et l&#39;imagerie. Par exemple, l&#39;électroporation des cellules et un bol de chargement ont atteint une grande quantité de cellules dans l&#39;épithélium olfactif et du bulbe, et permettent ainsi la visualisation des réseaux cellulaires complets. En outre, la fourniture d&#39;indicateurs chimiques via bolus chargement au lieu de fluorophores génétiquement encodés permet des mesures dans un ensemble potentiellement plus d&#39;espèces. D&#39;autres alternatives comme l&#39;incubation de bain avec des colorants AM travaillent principalement dans les tranches qui endommagent le bulbe olfactif sévèrement, ne laissant que quelques centaines de micromètres de tissu intact. En comparaison, l&#39;ensemble de la préparation de montage utilisé dans notre protocole garantit par exemple que l&#39;innervation bilatérale du γ-glomérule reste intacte et les enregistrements sont ainsi pris dans un système encore en vigueur. Enfin, l&#39;imagerie elle-même est effectuée par microscopie ligne d&#39;éclairage permettant l&#39;acquisition de volumes 3D. La microscopie Ligne-éclairage est l&#39; une des techniques confocales fournissant les taux d&#39;acquisition plus élevés possibles 6 &lt;/ Sup&gt; qui sont nécessaires pour couvrir une grande partie du bulbe olfactif. Les systèmes d&#39;acquisition plus lentes peuvent être utilisés mais présentent l&#39;inconvénient que la taille du volume nominal doit être réduite. Au cours des dernières années, d&#39; autres méthodes pour l&#39; acquisition rapide d&#39;images ont été développées et peuvent être utilisés comme solutions de rechange 14,15. Néanmoins, la microscopie line-éclairage reste l&#39;une des méthodes les plus simples pour gagner de la vitesse et une résolution suffisante. Voici quelques informations suivantes comme lignes directrices pour la sélection des configurations d&#39;imagerie appropriés. Depuis l&#39;imagerie de calcium se fait dans des préparations de cerveau épais, la configuration devrait fournir confocalité décent et les objectifs devraient avoir des ouvertures numériques de 1.0 ou supérieur. Pour un point de référence, les enregistrements effectués avec le microscope d&#39;éclairage linéaire correspondent à des images prises avec un microscope à balayage laser standard avec une taille sténopé de 0,5-1 unités spacieuses. la vitesse d&#39;acquisition rapide est souhaitable. Un volume d&#39;une épaisseur de 20 um recouverte d&#39;au moins 5 layers, un champ latéral de vue de 100 um x 100 um et une taille de pixel de 0,5 um ou moins doit être balayé à une vitesse minimale de 1 Hz par pile. La réduction de la confocalité peut augmenter la quantité de photons comptés et permet ainsi des acquisitions plus rapides si nécessaire, mais présente l&#39;inconvénient d&#39;enregistrer plus de lumière out-of-focus. Toutefois, étant donné qu&#39;une telle approche augmente l&#39;épaisseur des tranches optiques, il peut effectivement faciliter le traçage des dendrites à travers les différents plans z après l&#39; application de l&#39; ACI 6. Les outils nécessaires pour étudier intensivement le traitement de la température dans les réseaux de bulbe olfactif sont présentés ici. l&#39;activité induite par la température est enregistrée dans les première et deuxième neurones d&#39;ordre par l&#39;intermédiaire des colorants et des signaux à la fois arrivée et au départ de la γ-glomérule sensibles au calcium. En outre, la mesure dans laquelle les processus à la fois chimique et thermique des informations peuvent être évaluées cellules mitrales individuelles. Depuis la préparation de leafs le bulbe olfactif intact, le rôle de l&#39;innervation bilatérale dans le traitement olfactif peut encore être étudiées. La procédure est également utile pour révéler si et comment thermo- et chemoinformation est codé dans les réseaux qui se chevauchent 5 olfactifs. Enfin, les techniques mentionnées ci-dessus ne sont pas limitées à l&#39;étude des réponses de température dans le bulbe olfactif, mais peuvent être appliqués à une évaluation plus générale du système olfactif, en particulier les réseaux de traitement cellulaires en trois volumes de grandes dimensions. Bolus chargement et imagerie activité de corrélation sont des outils puissants pour observer et comparer l&#39;activité de dizaines de neurones, ce qui les rend applicables aux différents réseaux cérébraux 16.

Au cours des dernières années, la sensibilité à la température n’a plus été décrite comme un sens seulement somesthésique, mais aussi comme une fonction physiologique pertinente pour le système olfactif. Chez les rongeurs, le bulbe olfactif principal reçoit des informations du ganglion de Grueneberg (GG), un organe de la cavité nasale, composé de neurones thermosensibles. Les neurones GG réagissent aux températures froides1 ainsi qu’aux stimuli chimiques, et leur chimiosensibilité est modulée par les fluctuations de température2. Ces observations suggèrent que le bulbe olfactif peut intégrer des informations chimiques et de température recueillies au nez. Afin d’explorer cette hypothèse, nous présentons ici un ensemble d’expériences permettant de détecter des réponses thermiques dans le bulbe olfactif d’animaux non transgéniques, en utilisant la larve de Xenopus laevis comme modèle. L’organisation du système olfactif chez ces animaux ressemble beaucoup à celle des mammifères. Les neurones récepteurs olfactifs de X. laevis prémétamorphique se terminent en touffes et établissent des contacts synaptiques avec les dendrites des neurones de second ordre, les cellules mitrales. Les fibres pré- et postsynaptiques s’entremêlent et forment des structures neurosensorielles en forme d’écheveau appelées glomérules3. Les synapses abondantes de la couche glomérulaire représentent le premier centre de traitement de l’information olfactive. Les cellules mitrales intègrent davantage l’entrée sensorielle et la transmettent aux zones olfactives supérieures.
Nous avons développé un protocole combinant l’électroporation des neurones récepteurs olfactifs (ORN) avec des colorants sensibles et non sensibles au calcium, suivie d’une mise en charge en bolus du réseau postsynaptique des cellules glomérules et mitrales. La coloration par électroporation de deux colorants spectralement distincts chargés dans les cavités nasales sert à distinguer le γ-glomérule3 par son innervation bilatérale par les ORN des deux épithéliums olfactifs. Ainsi, l’emplacement du γ-glomérule est identifié avant d’autres mesures. Par la suite, le chargement en bolus4 avec du Fluo-8 acétoxyméthyle (Fluo-8 AM) est effectué dans un volume comprenant le γ-glomérule. L’imagerie des changements calciques avec la microscopie confocale rapide permet de visualiser les réponses thermiques dans le neuropil 3D entourant le γ-glomérule, un glomérule sensible à la température unique dans ce système5. Les cellules mitrales innervant cette structure spécifique peuvent également être identifiées par leurs signaux Ca2+ répondant aux baisses de température induites. Ensuite, l’imagerie de corrélation d’activité6 utilise les traces spécifiques Ca2+ de ces cellules pour révéler la morphologie dendritique des cellules mitrales thermosensibles. L’alternance d’applications répétées de solution froide de Ringer et d’odorisants chimiques dans une mesure peut être utilisée pour visualiser les réseaux de cellules mitrales pour le traitement des odeurs et de la température entourant le γ-glomérule et identifier les chevauchements potentiels. Pour attribuer sans ambiguïté les réponses au stimulus chimique ou à la température, nous surveillons constamment la température au niveau de l’épithélium olfactif.

<table><tbody><tr><td><Chlorure de sodium ></ fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck Millipore</td><td>1064040500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Merck Millipore</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>1023820250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>1058330250</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck Millipore</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Millipore</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>Vert de calcium 10 kDa Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22914</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>TEFlabs</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>MK571</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>340-021-M005</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Acide pluronique F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>poudre</td></tr><tr><td>L-Histidine monochlorhydrate monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck Millipore</td><td>1029522500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette électronique</td><td>BrandTech</td><td>HandyStep Pipette</td><td></td>électronique à répétition</tr><tr><td>NiCr-Ni thermocouple</td><td>Greisinger Elektronik</td><td>GTF 300</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Narishige</td><td>Modèle PC-10</td><td>extracteur en deux étapes</td></tr><tr><td>Applicateur d’entonnoir</td><td>(Sur mesure)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à éclairage linéaire</td><td>(Sur mesure)</td><td></td><td>Sinon, un microscope à disque rotatif disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>Objectif W Plan-Apochromat 63X/1.0&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>441470-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Objectif W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>à partir de la version R2010b</td></tr></tbody></table>

enregistrement neuronal activité induite de température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; xenopus laevis</em

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Le système olfactif, spécialisé dans la détection, l’intégration et le traitement des molécules chimiques, est probablement le système sensoriel le plus étudié. Cependant, il existe de plus en plus de preuves que l’olfaction ne se limite pas uniquement à la sensibilité chimique, mais inclut également la sensibilité à la température. Les Xenopus laevis prémétamorphiques sont des animaux translucides, avec des cavités nasales saillantes privées de la plaque cribriforme séparant le nez et le bulbe olfactif. Ces caractéristiques les rendent bien adaptés à l’étude de l’olfaction, et en particulier de la thermosensibilité. Le présent article décrit la procédure complète de mesure des réponses thermiques dans le bulbe olfactif des larves de X. laevis. Tout d’abord, l’électroporation des neurones récepteurs olfactifs (ORN) est réalisée avec des colorants spectralement distincts chargés dans les cavités nasales afin de colorer leurs terminaisons axonales dans le neuropil bulbaire. La coloration différentielle entre les neurones récepteurs gauche et droit sert à identifier le γ-glomérule comme la seule structure innervée par les afférences présynaptiques prélatérales. Deuxièmement, l’électroporation est combinée à une charge en bolus focal dans le bulbe olfactif afin de colorer les cellules mitrales et leurs dendrites. Le volume cérébral 3D est ensuite scanné sous microscopie à illumination linéaire pour l’acquisition rapide de données d’imagerie calcique tandis que de petites baisses de température sont induites au niveau de l’épithélium olfactif. Enfin, l’analyse post-acquisition permet la reconstruction morphologique du réseau thermosensible constitué du γ-glomérule et de ses cellules mitrales innervantes, à partir de traces spécifiques de Ca2+ induites par la température. L’utilisation d’odorisants chimiques comme stimuli en plus des sauts de température permet de comparer les réseaux thermosensibles et chimiosensibles dans le bulbe olfactif.

L&#39;électroporation des neurones récepteurs olfactifs (NRO) a été réalisée avec des colorants Alexa Fluor ou des indicateurs de calcium conjugués avec des molécules Dextran pour l&#39;étiquetage antérograde via le transport axonal actif. Alors que les anciens colorants fournissent une coloration brillante des neurones sensoriels et leurs terminaux axone ramification dans la couche glomérulaire du bulbe, ce dernier permettent la mesure de l&#39; activité neuronale dans ces cellules (figures 1 et 2). En premier lieu , la position de la γ-glomérule thermosensibles et de son innervation a été visualisé par électroporation de Alexa Fluor 647 Dextran et Alexa Fluor 546 Dextran dans l&#39;épithélium olfactif gauche et à droite, respectivement (figure 1A). Vingt-quatre heures après la procédure, les Orns dans les narines, les deux nerfs olfactifs et les glomérules, dans les deux hémisphères sont visibles en microscopie à fluorescence. Les différents groupes de glomérulaire étaient Identifiable par leurs positions respectives, notamment le petit groupe comprenant le γ-glomérule (figure 1B). Un petit nombre de fibres olfactives controlatérale a couru à travers le bulbe olfactif controlatéral, traversé la commissure antérieure et terminée dans le ipsilatéral γ-glomérule (figure 2A). Afin d&#39;enregistrer les réponses calciques présynaptiques des fibres de la γ-glomérule, le calcium vert Dextrane a été électroporé dans Orns, selon la même procédure. Négatif sauts de température ont été induites à la narine par la libération contrôlée de solution de Ringer glacée (0-1 ° C). Un volume 3D comprenant le γ-glomérule a été imagée sous une ligne à illumination microscope confocal rapide. ATS de -1 ° C sont suffisantes pour déclencher des réponses froides dans le γ-glomérule et ses afférences, reconnaissables comme des pics réversibles dans les AF / F Ca 2+ traces (figure 2B &lt;/ strong&gt;, C). D&#39;autres étapes expérimentales ont été réalisées pour mesurer l&#39;activité induite par le froid dans les cellules mitrales reliées à la γ-glomérule par l&#39;intermédiaire de leurs terminaisons dendritiques ramifiées. Ces fibres postsynaptiques et le neuropile environnant ont effectivement été colorées par bolus de chargement du colorant sensible au calcium Fluo-huit heures, effectuées quelques jours après Alexa 647 Dextran avait été électroporation dans ORNs (figure 3A, B). mitrale cellules ont été remplis avec du Fluo-huit heures, et l&#39;épithélium olfactif a été stimulé deux fois selon le modèle suivant: Ringer froid, l&#39;histidine (10 pM) et la température ambiante de Ringer, appliqué par la suite. Deux traces de référence ont été prélevés dans des régions d&#39;intérêt dans le volume enregistré, un répondant exclusivement aux baisses de température, l&#39;autre, à l&#39;histidine seulement. Activité corrélation imagerie (ACI) 6 a été calculé basé sur la référence sélectionnéetraces pour visualiser avec un contraste élevé de la morphologie dendritique des réseaux postsynaptiques correspondant soit à la température ou le signal de Ca2 + histidine sensible (figure 3C, D). Enfin, des cartes thermosensibles et chimiosensibles étaient codés par couleur et superposées les unes sur les autres, en montrant comment la température et de l&#39; information chimique est transporté de glomérules individu aux neurones de second ordre olfactifs (Figure 3E). Pour une description de l&#39;intégration et de traitement des deux types d&#39;information dans les réseaux olfactifs partagés, consultez Kludt et al. 5 <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> Figure 1: Vue d&#39; ensemble de l&#39;ORN électroporation et bolus chargement (A) neurones récepteurs olfactifs dans les deux cavités nasales de X.. laevis larves ont été électroporation avec des colorants Alexa ou Calcium sensibles à des colorants couplés à des molécules de dextrane. Les indicateurs fluorescents ont été transportés anterogradely jusqu&#39;à ce que l&#39;arborisation axonale terminal. 24 heures après l&#39;électroporation, la couche glomérulaire dans les deux hémisphères a présenté une coloration fluorescente. (B) Représentation schématique de l&#39;organisation cellulaire du bulbe olfactif dans un hémisphère. La couche glomérulaire couvre l&#39;ampoule en grappes: les grappes médiales, petites, intermédiaires et latérales. informations olfactives sont transférées à partir des neurones récepteurs de cellules mitrale via les synapses excitatrices glomérules. cellules periglomerular et les cellules granulaires sont des neurones inhibiteurs modulant le traitement et le codage olfactif. Le γ-glomérule (cyan) a été facilement identifié comme étant le petit neuropile où ipsilatéral (rouge) et de fibres olfactives (orange) controlatéral fusionnés. (C) Bolus chargement a été réalisé au voisinage de la γ-glomérule pour colorer le neuropile post-synaptique comprenant principalement des cellules mitrales et leur dendriarbres tic ramification considérablement dans la couche glomérulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> Figure 2: Electroporation de Orns révèle une connectivité structurelle et fonctionnelle (A) innervation bilatérale du γ-glomérule par ipsilatéral (vert) et (rouge) neurones récepteurs olfactifs controlatérale (NRO).. Barre d&#39;échelle = 50 pm. (B) le bulbe olfactif après électroporation avec le colorant Calcium sensible au calcium vert dextran. Le intermédial (IMC), médian (MC) et le petit groupe (SC) sont visibles. L&#39;image est une projection maximale de 100 um volume de mesure d&#39;épaisseur. Barre d&#39;échelle = 50 pm. (C) Vue rapprochée du petit groupe. Le volume enregistré (12 pm) estreprésentée dans une projection maximale. L&#39;image représente le niveau de fluorescence basale sur la carte grise et le AF code couleur / F comme une superposition. La réponse maximale à la stimulation avec une solution de Ringer à froid est tracée. Le γ-glomérule a réagi fortement tandis que les deux glomérules voisins restent silencieux. L&#39;encart montre le tracé AF / F pour la γ-glomérule correspondant à la région d&#39;intérêt indiqués. La barre bleue représente l&#39;application du stimulus. Barre d&#39;échelle = 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> Figure 3:. Bolus chargement et ACI dissocient thermosensible et réseaux chimiosensibles (A) axones des ORNs se terminant dans le petit groupe ont été colorées par électroporation avec le non-calcium colorant sensible Alexa 647 Dextran. La ligne en pointillés indique le γ-glomérule. (B) Image de la même région que dans (A) dans le second canal de mesure après un bolus de chargement avec le colorant sensible au calcium Fluo-huit heures. Certains corps cellulaires mitrale étaient visibles, mais le contraste était limité. Suivant les flèches, deux traces de réponse ont été tracées, qui ont été utilisés pour l&#39;imagerie activité de corrélation (ACI). Bleu, barres rouges et noirs en dessous des traces représentent le début d&#39;application de Ringer froide, histidine (10 uM) et la température ambiante Ringer de contrôle négatif, respectivement. Les traces des deux Ca ont été prises à partir de différentes régions d&#39;intérêt du volume mesuré. (C) Le résultat ACI de la trace dans (B) mettant en évidence les zones répondant principalement à Ringer froide. (D) Le résultat ACI de la trace dans (B) en soulignant les domaines qui répondent principalement à l&#39; histidine. (E) Superposition des deux cartes ACI. cellules mitrales répondant à histidine et le glomérule innervé (rouge) étaient faciles à distinguer des cellules mitrales thermosensibles et le γ-glomérule (cyan). Toutes les images de cette figure sont des projections d&#39;intensité maximale d&#39;un volume de 28 um d&#39;épaisseur. Barre d&#39;échelle = 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons ici un protocole de mesure et d’analyse des réponses de température dans le bulbe olfactif de Xenopus laevis. Les neurones récepteurs olfactifs et les cellules mitrales sont colorés de manière différentielle, après quoi des modifications du calcium sont enregistrées, reflétant une sensibilité de certains réseaux neuronaux du bulbe aux baisses de température induites au niveau du nez.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les variations du calcium dans les neurones du bulbe olfactif en réponse à des baisses de température induites au niveau de l'épithélium nasal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des affections, telles que la manière dont le bulbe olfactif intègre et traite l'information thermique captée dans le nez. Les neurones de premier et de second ordre du bulbe olfactif sont différemment colorés, et les effets des fluctuations de température au niveau de l'épithélium nasal sont mesurés par imagerie calcique.La démonstration visuelle de l'électroporation cellulaire, du chargement en bolus et de l'imagerie de corrélation d'activité facilitera la mise en œuvre de ces techniques dans d'autres réseaux cérébraux que le bulbe olfactif. Pour commencer cette procédure, placez une têtard sur un coussin de gel. Fixez-le en positionnant des aiguilles autour, en prenant garde de ne pas percer sa peau avec les aiguilles.Ensuite, placer l'animal sous le microscope stéréo et focaliser sur les narines. Puis, placer un cristal de colorant dans l'une des cavités nasales et attendre qu'il soit complètement dissous, ce qui devrait prendre moins d'une minute. Si les cristaux sont plus petits, en ajouter deux ou trois dans chaque cavité jusqu'à l'obtention d'une solution concentrée non translucide.Ensuite, placer la cathode sur la peau de la têtard et l'anode dans l'une des narines. Appliquer six impulsions de 20 volts et 20 millisecondes avec un intervalle de stimulation d'environ 0,5 seconde. Pour les colorants ayant une polarité différente, les résultats de marquage peuvent être améliorés en plaçant la cathode dans les narines.Si la polarité du colorant est incertaine, placez simultanément les deux électrodes dans les narines et inversez alternativement la polarité entre les impulsions de tension uniques. Après avoir sacrifié l'animal, utilisez un scalpel pour disséquer un bloc de tissu contenant les cavités nasales, les nerfs olfactifs et les bulbes olfactifs. Effectuez la première incision près de la narine gauche et déplacez la lame vers l'avant, en coupant le long du nerf et du bulbe olfactifs gauches jusqu'à la limite télocéphalique-diéncéphalique.Répétez de la même manière du côté droit. Ensuite, isolez la préparation du reste du système nerveux en effectuant une dernière incision en arrière du télencéphale. Épinglez à nouveau le fragment de tissu en insérant deux aiguilles entre les nerfs olfactifs.Ensuite, déposez une goutte de solution de Ringer pour grenouille sur le tissu. Le fait de maintenir la préparation dans la solution de Ringer empêchera l'effondrement des tissus cérébraux lors de la dissection. Puis, retirez les méninges recouvrant la zone de tri des axones et les bulbes olfactifs en effectuant trois incisions.En partant du bord postérieur du bloc de tissu, sectionner de façon caudo-rostrale en longeant étroitement le bulbe olfactif gauche jusqu’au point d’entrée des nerfs olfactifs dans les bulbes. Répéter cette procédure pour l’hémisphère droit. Ensuite, soulever les méninges à l’aide de forceps et effectuer la troisième incision perpendiculairement aux précédentes au niveau de la zone de tri des axones.Ensuite, transférez l'échantillon dans une chambre d'enregistrement remplie de Ringer pour grenouille pour un traitement supplémentaire et une imagerie. Assurez-vous que la face ventrale est orientée vers le haut et fixez l'échantillon à l'aide d'un filet de fibres de nylon tendu sur un petit cadre en platine. Pour faciliter l'application des stimuli, placez les cavités nasales au-dessus de l'une des fibres de nylon.Dans cette procédure, remplissez la micropipette avec 10 microlitres de la solution et éliminez les bulles d'air en tapotant délicatement la micropipette. Ensuite, fixez la micropipette sur un support pour micropipette. Assurez-vous qu'une pression peut être appliquée manuellement à l'aide d'une seringue ou d'un dispositif pneumatique d'éjection de produit, et surveillez la pression appliquée à l'aide d'un manomètre.Ensuite, abaissez la pipette sur la surface du bulbe olfactif en orientant la pointe vers la direction rostrale de la préparation. Appliquez une légère pression positive constante sur la micropipette afin d'éviter son obstruction. Insérez délicatement la micropipette dans le tissu et appliquez une pression positive.Confirmez l'écoulement sortant de la pipette en observant de légers mouvements du tissu visibles sous un éclairage lumineux lorsque la pression est appliquée. Après 10 minutes de chargement, réduisez la pression appliquée à zéro et vérifiez la coloration. La taille de la zone colorée varie considérablement et dépend de plusieurs paramètres, tels que la quantité de colorant injecté et l'emplacement du site d'éjection.Une bonne coloration couvre une surface d'environ 100 micromètres sur 100 micromètres. Surveillez au fil du temps le chargement progressif en colorant des corps cellulaires des cellules mitrales pendant le chargement en bolus. Si l'intensité de la coloration ou le nombre de cellules mitrales colorées n'augmente pas, vérifiez si la pipette est bouchée et remplacez-la si nécessaire.À cette étape, surveillez la température du Ringer refroidi en insérant la sonde propre du thermomètre dans le tube. Attendez que la température descende en dessous d'un degré Celsius avant de commencer l'expérience. Ensuite, utilisez un applicateur entonnoir permettant une administration concomitante du stimulus au Ringer perfusé, afin que le débit d'eau dans la chambre reste constant et ininterrompu pendant la libération de la solution de stimulus.Ensuite, positionnez l'entonnoir de manière à ce que l'orifice distal se trouve à moins d'un millimètre de l'épithélium olfactif. Placez ensuite un capteur de température en nichrome relié à un thermomètre numérique près de l'épithélium et de l'orifice de l'entonnoir applicateur. Connectez le port de sortie du thermomètre à un ordinateur pour enregistrer et afficher visuellement les variations de tension reflétant de légères fluctuations de température.Ensuite, démarrez l'acquisition d'images et appliquez successivement de 200 à 400 microlitres de Ringer froid, de L-histidine et de Ringer à température ambiante à l’aide d’une pipette électronique, avec un intervalle interstimulus de 20 à 30 secondes. Pour un meilleur contrôle de l'application du stimulus, libérez celui-ci à l’aide d’un signal déclencheur envoyé par le système d’imagerie choisi vers la pipette, si possible. Dans cette procédure, chargez les données brutes acquises sous forme de variable dans l’espace de travail MATLAB de l’utilisateur, organisées sous la forme d’une matrice x, y, z, t, où x et y correspondent aux dimensions latérales, z à la direction axiale et t au cours du temps.Ensuite, appelez ACI depuis la ligne de commande de MATLAB. Dans l'interface utilisateur, sélectionnez Préparer les données, puis choisissez la variable contenant les données et un répertoire dans lequel les résultats seront enregistrés. Parcourez les couches z mesurées en déplaçant le curseur correspondant dans l'interface utilisateur afin d'obtenir un aperçu de la carte de variance affichée.Ensuite, saisissez la taille de la région d'intérêt (ROI) dans l'interface utilisateur. Pour le soma d'une cellule mitrale, ajustez la ROI afin qu'elle couvre environ 10 micromètres dans la direction latérale et cinq micromètres dans la direction axiale. Pour un glomérule, des valeurs légèrement supérieures de 20 micromètres dans la direction latérale et 10 micromètres dans la direction axiale sont appropriées. Ensuite, sélectionnez une ROI englobant le glomérule gamma ainsi que des régions supplémentaires pour chaque soma visible des cellules mitrales environnantes en cliquant avec le bouton central de la souris sur le centre de la cellule ou du glomérule.Ensuite, fermez l'interface utilisateur principale, ce qui déclenche le calcul des cartes de corrélation pour toutes les traces de référence. Le résultat est automatiquement enregistré et affiché. Cette image montre que les axones des neurones olfactifs se terminant dans le petit groupe ont été marqués par électroporation à l'aide d'un colorant insensible au calcium, le dextran Alexa 647.La ligne pointillée délimite le glomérule gamma. On voit ici une image de la même région dans le deuxième canal de mesure après chargement par bolus avec un colorant sensible au calcium, le Fluo-8 AM. Certains corps cellulaires de cellules mitrales étaient visibles, mais le contraste était limité. Deux tracés de réponse ont été représentés pour l'imagerie de corrélation d'activité ; les barres bleue, rouge et noire situées sous les tracés illustrent respectivement le début de l'application de Ringer froid, d'histidine à 10 micromolaire et de Ringer à température ambiante servant de contrôle négatif.Le résultat de l'ACI de la trace dans les zones surlignées réagissant principalement au Ringer froid est montré ici. Et voici le résultat de l'ACI de la trace dans les zones surlignées réagissant principalement à l'histidine. Cette image montre la superposition des deux cartes d'ACI.Les cellules mitrales répondant à l'histidine et au glomérule innervé étaient facilement distinguables des cellules mitrales thermosensibles du glomérule gamma. Cette procédure peut être réalisée afin d'étudier si la thermosensibilité et la chimiosensibilité font partie de réseaux neuronaux cachés et superposés du bulbe olfactif. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'enregistrer le traitement de la température dans le bulbe olfactif à l'aide de l'électroporation cellulaire chez des animaux vivants, du chargement par bolus et de l'imagerie de corrélation d'activité, également appelée ACI.Le chargement en bolus et l'ACI sont des outils puissants permettant d'observer et de comparer l'activité et la connectivité de dizaines de neurones en 3D, ce qui les rend facilement applicables à différentes régions cérébrales et réseaux neuronaux.

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Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal

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