Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de Xenopus laevis

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les changements de calcium dans les neurones du bulbe olfactif en réponse aux baisses de température induites au niveau de l’épithélium nasal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des affections, telles que la façon dont le bulbe olfactif intègre et traite les informations de température acquises dans le nez. Les neurones du premier et du deuxième ordre du bulbe olfactif sont colorés de manière différentielle et les effets des fluctuations de température au niveau de l’épithélium nasal sont mesurés par imagerie calcique.

La démonstration visuelle de l’électroporation cellulaire, du chargement en bolus et de l’imagerie de corrélation d’activité facilitera la mise en œuvre de ces techniques dans des réseaux cérébraux autres que le bulbe olfactif. Pour commencer cette procédure, placez un têtard sur un coussin de gel. Réparez-le en plaçant des aiguilles autour et veillez à ne pas piquer les aiguilles à travers sa peau.

Ensuite, placez l’animal sous le stéréomicroscope et concentrez-vous sur les narines. Ensuite, placez un cristal de colorant dans l’une des cavités nasales et attendez qu’il se dissolve complètement, ce qui devrait prendre moins d’une minute. Si les cristaux sont plus petits, ajoutez-en deux ou trois dans chaque cavité jusqu’à ce qu’ils produisent une solution non translucide et très concentrée.

Après cela, placez la cathode sur la peau du têtard et l’anode dans l’une des narines. Appliquez six impulsions de 20 volts et 20 millisecondes avec environ 0,5 seconde d’intervalle de stimulus. Pour les colorants ayant une polarité différente, les résultats de coloration peuvent être améliorés en plaçant la cathode dans les narines.

En cas de doute sur la polarité du colorant, les deux électrodes peuvent être placées simultanément dans les narines et alterner la polarité entre des impulsions de tension unique. Après avoir sacrifié l’animal, utilisez un scalpel pour disséquer un bloc de tissu contenant les cavités nasales, les nerfs olfactifs et les bulbes olfactifs. Faites la première incision près de la narine gauche et déplacez la lame vers l’avant, en coupant le long du nerf olfactif gauche et du bulbe jusqu’à la bordure télencéphale-diencéphalique.

Répétez l’opération de même sur le côté droit. Ensuite, isolez la préparation du reste du système nerveux en faisant une coupe finale à l’arrière du télencéphale. Épinglez à nouveau le bloc de tissu en insérant deux aiguilles entre les nerfs olfactifs.

Ensuite, mettez une goutte de solution Frog Ringer sur le tissu. Baigner la préparation dans une solution Ringer empêchera les tissus cérébraux de s’effondrer lors de la dissection. Après cela, retirez les méninges recouvrant la zone de tri axonal et les bulbes olfactifs en faisant trois incisions.

En partant du bord postérieur du bloc tissulaire, coupez étroitement la cage caudatostrale le long du bulbe olfactif gauche jusqu’au point d’entrée des nerfs olfactifs dans les bulbes. Répétez cette procédure pour l’hémisphère droit. Par la suite, soulevez les méninges à l’aide d’une pince et faites la troisième coupe perpendiculairement aux précédentes au niveau de la zone de tri axonal.

Après cela, transférez l’échantillon dans une chambre d’enregistrement remplie de Frog Ringer pour un traitement et une imagerie ultérieurs. Assurez-vous que la face ventrale est tournée vers le haut et fixez l’échantillon avec un filet de fibres de nylon enjambé sur un petit cadre en platine. Pour une application plus facile des stimuli, placez les cavités nasales sur l’une des fibres de nylon.

Dans cette procédure, remplissez la micropipette avec 10 microlitres de solution et éliminez les bulles d’air en agitant la micropipette. Ensuite, montez la micropipette dans un porte-pipette. Assurez-vous que la pression peut être appliquée manuellement à l’aide d’une seringue ou d’un dispositif d’éjection pneumatique des médicaments et surveillez la pression appliquée à l’aide d’un manomètre.

Ensuite, abaissez la pipette sur la surface du bulbe olfactif avec la pointe pointant dans la direction rostrale de la préparation. Appliquez une petite pression positive constante sur la micropipette pour éviter l’obstruction de la pipette. Insérez doucement la micropipette dans le tissu et appliquez une pression positive.

Confirmez l’écoulement de la pipette en surveillant les légers mouvements tissulaires visibles sous un éclairage lumineux lorsque la pression est appliquée. Après 10 minutes de chargement, réduisez la pression appliquée à zéro et vérifiez les taches. La taille de la zone colorée varie considérablement et dépend de plusieurs paramètres, tels que la quantité de colorant injecté et l’emplacement du site d’éjection.

Une bonne coloration couvre une zone d’environ 100 micromètres sur 100 micromètres. Surveillez le chargement progressif du colorant des somates des cellules mitrales au fil du temps pendant le chargement du bolus. Si l’intensité de la coloration ou le nombre de cellules mitrales colorées n’augmentent pas, vérifiez que la pipette n’est pas obstruée et remplacez-la si nécessaire.

Dans cette étape, surveillez la température de la sonnerie refroidie en insérant la sonde du thermomètre propre dans le tube. Attendez que la température descende en dessous d’un degré Celsius avant de commencer l’expérience. Ensuite, utilisez un applicateur en entonnoir permettant l’administration concomitante du stimulus à la sonnerie de perfusion afin que le débit d’eau dans la chambre reste constant et ininterrompu pendant la libération de la solution de stimulus.

Ensuite, positionnez l’entonnoir de manière à ce que la sortie distale soit à moins d’un millimètre de l’épithélium olfactif. Ensuite, placez un capteur de température nichrome connecté à un thermomètre numérique près de l’épithélium et de la sortie de l’applicateur d’entonnoir. Câblez le port de sortie du thermomètre à un ordinateur pour enregistrer et afficher visuellement les changements de tension reflétant de petites fluctuations de température.

Après cela, démarrez l’acquisition d’images et appliquez séquentiellement 200 à 400 microlitres de Ringer froid, de L-histidine et de Ringer à température ambiante à l’aide d’une pipette électronique avec un intervalle interstimulus de 20 à 30 secondes. Pour un meilleur contrôle de l’application du stimulus, relâchez le stimulus avec un signal de déclenchement envoyé par la configuration d’imagerie choisie à la pipette si possible. Dans cette procédure, chargez les données brutes acquises sous forme de variable dans l’espace de travail de l’utilisateur MATLAB, organisées sous la forme d’une matrice x, y, z, t, x et y, x faisant référence aux dimensions latérales, z, la direction axiale, et t, le cours du temps.

Ensuite, appelez ACI à partir de la ligne de commande MATLAB. Dans l’interface utilisateur, sélectionnez Préparer les données, puis sélectionnez la variable contenant les données et un répertoire dans lequel les résultats seront enregistrés. Faites défiler les couches z mesurées en déplaçant le curseur correspondant dans l’interface utilisateur pour obtenir une vue d’ensemble de la carte de variance affichée.

Après cela, entrez la taille du retour sur investissement dans l’interface utilisateur. Pour un soma de cellules mitrales, ajustez le retour d’intérêt pour qu’il s’étende sur environ 10 micromètres dans la direction latérale et cinq micromètres dans la direction axiale. Pour un glomérule, les valeurs légèrement plus élevées de 20 micromètres latéralement et de 10 micromètres axialement sont appropriées. Ensuite, sélectionnez une zone d’intérêt contenant le gamma glomérule et des régions supplémentaires pour chaque soma visible des cellules mitrales environnantes en cliquant avec le bouton central de la souris sur le centre de la cellule ou du glomérule.

Ensuite, fermez l’interface utilisateur principale, ce qui déclenche le calcul des cartes de corrélation pour toutes les traces de référence. Le résultat est automatiquement enregistré et affiché. Cette image montre que les axones des ORN se terminant dans le petit amas ont été colorés par électroporation avec un colorant non sensible au calcium, Alexa 647 Dextran.

La ligne pointillée délimite le gamma glomérule. Voici une image de la même région dans le deuxième canal de mesure après chargement en bolus avec un colorant sensible au calcium, Fluo-8 AM. Quelques somates de cellules mitrales étaient visibles, mais le contraste était limité. Deux traces de réponse ont été tracées pour l’imagerie de corrélation d’activité, les barres bleues, rouges et noires sous les traces décrivent le début de l’application de Ringer froid, d’histidine à 10 micromolaires et de Ringer à température ambiante comme contrôle négatif, respectivement.

Le résultat ACI de la trace dans les zones mises en évidence répondant principalement à Ringer froid est montré ici. Et voici le résultat de l’ACI de la trace dans les zones mises en évidence répondant principalement à l’histidine. Cette image montre la superposition des deux cartes de l’ACI.

Les cellules mitrales répondant à l’histidine et le glomérule innervé étaient facilement distinguables des cellules mitrales thermosensibles du gamma glomérule. Cette procédure peut être effectuée pour déterminer si la thermosensibilité et la chimiosensibilité se trouvent dans des réseaux neuronaux cachés et chevauchants du bulbe olfactif. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer le traitement de la température dans le bulbe olfactif à l’aide de l’électroporation cellulaire chez les animaux vivants, du chargement en bolus et de l’imagerie de corrélation d’activité, également appelée ACI.

Le chargement en bolus et l’ACI sont des outils puissants pour observer et comparer l’activité et la connectivité de dizaines de neurones en 3D, ce qui les rend facilement applicables à différentes régions du cerveau et réseaux neuronaux.