Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

L'objectif général de cette analyse RNASeq sur des échantillons de larves de poisson zèbre est d'identifier les profils d'expression génique chez les embryons et les larves de poisson zèbre et de formuler des comparaisons quantitatives des modifications d'expression génique entre échantillons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans n'importe quel domaine où les embryons ou larves de poisson zèbre sont informatifs, par exemple comment la suppression d'un gène ciblé entraîne des changements d'expression génique ou une perturbation de certaines voies métaboliques par rapport à d'autres conditions. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le poisson zèbre se prête bien à la production d'un grand nombre d'individus, et que des données de transcriptome entier peuvent être facilement obtenues.

En outre, l'isolement de types cellulaires spécifiques peut être réalisé facilement par tri d'animaux transgéniques. Les procédures seront démontrées par Lain Hostelley, étudiante diplômée, et Jessica Nesmith, post-doctorante de mon laboratoire. Pour commencer, cultiver les embryons jusqu'à l'âge de trois mois, correspondant à la maturité reproductive.

Séparez deux poissons mâles adultes et trois femelles de la souche souhaitée dans des aquariums de reproduction divisés contenant de l'eau fraîche du système la veille de la collecte des embryons. Le lendemain matin, après allumage des lumières, retirez la cloison et laissez les poissons se reproduire naturellement jusqu'à l'observation d'embryons au fond de l'aquarium. Collectez les embryons par intervalles de 30 minutes dans des boîtes de Pétri distinctes contenant du milieu pour embryons, jusqu'à obtention du nombre souhaité.

Pour stager les embryons, les cultiver par groupes de 50 à 75 par boîte de Pétri de 10 centimètres afin de favoriser une synchronisation constante du développement de tous les embryons. Ensuite, maintenir les boîtes à 28,5 degrés Celsius. Mesurer l'âge des embryons à l'aide du nombre de somites après la segmentation jusqu'à environ 24 heures post-fécondation, ou HPF, et séparer les embryons selon leur âge de développement.

Après avoir euthanasié les embryons au stade souhaité conformément au protocole décrit dans le texte, transférez un lot de 20 embryons dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre étiqueté. Ensuite, retirez tout excès de milieu d'embryons du tube micro-centrifuge. Ajoutez 200 microlitres de réactif de lyse dans le tube.

Et utilisez un pilon pour homogénéiser mécaniquement les embryons. Ensuite, ajoutez 800 microlitres supplémentaires de réactif de lyse afin d'obtenir un volume total d'un millilitre. Pour extraire l'ARN, ajoutez le réactif de lyse à l'échantillon recueilli et incubez-le à température ambiante pendant 5 minutes.

Ajouter 0,2 millilitre de chloroforme pour chaque millilitre de réactif de lyse utilisé, puis retourner les tubes manuellement pendant 15 secondes. Après une incubation des échantillons à température ambiante pendant deux à trois minutes, centrifuger les échantillons à 12 000 ×g et à 4 °C pendant 15 minutes. Transférer la phase aqueuse séparée dans un tube neuf et ajouter 0,5 millilitre d'isopropanol pour chaque millilitre de réactif de lyse utilisé.

Après avoir incubé les tubes à température ambiante pendant 10 minutes, centrifuger les échantillons pendant 10 minutes. Ensuite, ajouter de l'éthanol à 75 % à l'ARN et centrifuger les tubes à 7 500 × g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Retirer complètement le surnageant et laisser sécher l'échantillon à l'air à température ambiante.

Ensuite, re-suspendez l'ARN dans 15 à 30 microlitres d'eau traitée au DEPC. Pour purifier un ARN de haute qualité après avoir extrait le culot et lavé l'échantillon conformément au protocole décrit, utilisez un spectrophotomètre d'absorption pour doser la concentration et la pureté de l'ARN extrait. Assurez-vous que la valeur du rapport 260 sur 230 est d'environ 2,0 avant d'envoyer les échantillons d'ARN à un prestataire ou à une entreprise pour un séquençage ARN (RNASeq) et une analyse des variations d'expression génique basée sur la quantification des lectures de séquençage.

Pour comparer une condition expérimentale unique à un témoin, ouvrez les données des gènes différentiellement exprimés dans un logiciel de gestion de feuille de calcul. Sélectionnez la flèche déroulante à côté du bouton de tri et choisissez « tri personnalisé » dans la feuille de calcul. Dans la fenêtre qui s'affiche, cochez la case sous « colonne » et choisissez de trier par la colonne LFC.

Dans la colonne de tri, assurez-vous que « valeurs » est sélectionné. Dans la colonne ordre, choisissez de trier du plus grand au plus petit et cliquez sur OK. Pour déterminer les gènes exprimés de manière différentielle présents dans deux conditions expérimentales, sur le tableau comparant l'une des expériences au témoin, sélectionnez la première cellule d'une colonne vide.

Ensuite, saisissez l'équation suivante dans la cellule. Appuyez sur Entrée pour exécuter l'équation. Sélectionnez la cellule contenant l'équation et cliquez sur la case située dans le coin inférieur droit de la cellule.

Gardez le bouton de la souris enfoncé et faites glisser la zone sélectionnée jusqu’en bas de la colonne, en sélectionnant le dernier identifiant de caractéristique, afin de copier l’équation dans chaque cellule de la colonne. Sélectionnez à nouveau le tri personnalisé et ajoutez un deuxième niveau de tri en cliquant sur l’icône plus située dans le coin inférieur gauche. Au premier niveau, sous colonne, sélectionnez doublon.

Sous « Trier par », sélectionnez « valeurs », puis sous « Ordre », sélectionnez « de Z à A ». Au deuxième niveau, dans « puis par », sous « Colonne », sélectionnez LFC. Sous « Trier par », sélectionnez « valeurs », puis sous « Ordre », sélectionnez « du plus grand au plus petit », puis cliquez sur « OK ». Pour supprimer les parenthèses éventuelles de la colonne des symboles géniques avant de poursuivre, sélectionnez toute la colonne contenant les symboles géniques.

Sélectionnez « Modifier », puis « Remplacer » dans le menu déroulant Fichier. Saisissez une parenthèse ouvrante, une astérisque, une parenthèse fermante dans la barre « Rechercher » de la fenêtre de remplacement, et laissez la barre « Remplacer par » vide. Cliquez sur « Remplacer tout » pour supprimer toutes les occurrences des parenthèses.

Pour déterminer les voies enrichies, copiez les symboles génétiques souhaités dans le presse-papiers. Rendez-vous sur ConsensusPathDB, puis sélectionnez l'analyse de jeu de gènes dans la barre latérale gauche de la page web, suivie par l'analyse de sureprésentation. Dans la zone coller une liste d'identifiants de gènes et de protéines, collez la liste des gènes.

Sélectionnez le symbole du gène dans la zone de type d'identifiant gène/protéine et cliquez sur continuer. Dans la section ensembles basés sur les voies métaboliques, cochez la case située à côté des voies définies par les bases de données de voies métaboliques. Sélectionnez rechercher les ensembles enrichis pour obtenir la liste des voies contenant des gènes de la liste d'entrée.

Sélectionnez tous les voies enrichies à visualiser dans un réseau de voies en cochant chaque case située à côté des noms des voies ou, sous « sélectionner » dans l'en-tête de colonne au-dessus des cases à cocher, cliquez sur « tout sélectionner ». Ensuite, sélectionnez « visualiser les ensembles sélectionnés ». Ajustez les filtres de chevauchement relatif et de candidats partagés en cochant l'une des cases situées en haut au centre de la page et en indiquant le pourcentage souhaité, le chevauchement relatif ou le nombre de candidats partagés, puis sélectionnez « appliquer ».

Pour déterminer les ontologies géniques enrichies, copiez les symboles des gènes du groupe respectif dans le presse-papiers. Rendez-vous sur l'outil d'analyse d'enrichissement GO du Consortium pour l'ontologie génique. À gauche de la page, dans la section « vos identifiants de gènes ici », collez la liste des symboles de gènes dans la zone prévue à cet effet.

Sous la zone des identifiants de gènes, sélectionnez le terme GO « processus biologique ». Ensuite, sélectionnez « danio rerio » sous la zone des termes GO et cliquez sur soumettre. Réalisez une PCR quantitative en temps réel et comparez les résultats à ceux de l'ARNseq, conformément au protocole décrit dans le texte.

Le séquençage de l'ARN extrait de larves injectées avec des morpholinos ciblant soit alms1 soit bbs1 a révélé les gènes qui étaient respectivement surexprimés et sous-exprimés de manière unique dans les modèles d'Alström et de BBS, ainsi que les gènes significativement modifiés dans les deux modèles. Afin d'élucider plus clairement le profil moléculaire du modèle d'Alström, les voies métaboliques et les ontologies géniques enrichies parmi les gènes différentiellement exprimés ont été identifiées. Comme indiqué ici, un total de 31 voies ont été uprégulées.

Outre le regroupement général du métabolisme, les voies les plus fortement affectées étaient celles du système immunitaire inné et adaptatif, avec respectivement 32 et 20 gènes. Les événements de signalisation en aval de la voie du récepteur des lymphocytes B étaient également enrichis. Plusieurs voies de signalisation étaient également enrichies parmi les gènes surexprimés, ce qui est compatible avec l'association du syndrome d'Alström à un dysfonctionnement du cil primaire.

En outre, trois voies associées à la sécrétion d'insuline ont été régulées à la hausse : les acides gras liés à GPR40, les acides gras libres et l'acétylcholine. Enfin, six termes GO ont été enrichis parmi les gènes régulés à la hausse dans le modèle d'Alström, notamment la différenciation des érythrocytes, l'homéostasie des érythrocytes, l'homéostasie des cellules myéloïdes et les processus homéostatiques. Une fois maîtrisées, l'analyse des voies et l'analyse des termes GO peuvent être réalisées en moins d'une heure.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le choix des paramètres du chemin de signalisation et des valeurs seuils constituent les considérations les plus importantes pour interpréter les résultats des comparaisons d'expression issues de l'ARNseq. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'utilisation de lignées mutantes et l'analyse du transcriptome de types cellulaires individuels, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le profilage du transcriptome des types cellulaires ou les modifications de l'expression génique sous le contrôle de gènes spécifiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser les données transcriptomiques de poisson zèbre générées par l'ARNseq afin d'identifier des changements significatifs d'expression génique entre des échantillons expérimentaux.