Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

L’objectif global de cette analyse RNASeq dans des échantillons de larves de poisson-zèbre est d’identifier les profils d’expression génique des embryons et des larves de poisson-zèbre et de faire des déclarations comparatives quantitatives sur les changements d’expression génique entre les échantillons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans tous les domaines pour lesquels les embryons ou les larves de poisson-zèbre sont informatifs, comme comment la suppression d’un gène ciblé entraîne des changements d’expression génique ou une perturbation de certaines voies par rapport à d’autres conditions. Le principal avantage de cette technique est que le poisson-zèbre se prête à la production d’un grand nombre d’animaux, et que les données du transcriptome de l’animal entier peuvent être facilement obtenues.

De plus, l’isolement de types cellulaires spécifiques peut être réalisé facilement en utilisant le tri des animaux transgéniques. Lain Hostelley, un étudiant diplômé, et Jessica Nesmith, une post-doctorante de mon laboratoire, feront la démonstration des procédures. Pour commencer, cultivez des embryons jusqu’à l’âge de trois mois, c’est-à-dire la maturité reproductive.

Séparez deux poissons mâles adultes et trois poissons femelles de la souche désirée dans des bassins d’accouplement divisés d’eau douce la veille de la collecte des embryons. Le lendemain matin, après l’allumage des lumières, retirez le séparateur et laissez les poissons s’accoupler naturellement jusqu’à ce que des embryons soient observés au fond de l’aquarium. Prélever les embryons à intervalles de 30 minutes dans des boîtes de Pétri séparées du milieu embryonnaire jusqu’à ce que le nombre souhaité soit collecté.

Pour stadifier les embryons, cultivez-les en groupes de 50 à 75 par boîte de Pétri de 10 centimètres afin de favoriser un calendrier de développement cohérent de tous les embryons. Ensuite, gardez les plaques à 28,5 degrés Celsius. Mesurez l’âge de l’embryon à l’aide du nombre de somites après segmentation jusqu’à environ 24 heures après la fécondation, ou HPF, et séparez les embryons en fonction de l’âge de développement.

Après avoir euthanasié les embryons au stade souhaité selon le protocole textuel, transférez un pool de 20 embryons dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté. Ensuite, retirez tout excès de milieu embryonnaire du tube de micro-centrifugeuse. Ajoutez 200 microlitres de réactif de lyse dans le tube.

Et utilisez un pilon pour homogénéiser mécaniquement les embryons. Ensuite, ajoutez 800 microlitres supplémentaires de réactif de lyse pour porter le volume total à un millilitre. Pour extraire l’ARN, ajoutez le réactif de lyse à l’échantillon collecté et incubez-le à température ambiante pendant 5 minutes.

Ajoutez 0,2 millilitre de chloroforme pour 1 millilitre de réactif de lyse utilisé et retournez les tubes à la main pendant 15 secondes. Après avoir incubé les échantillons à température ambiante pendant deux à trois minutes, centrifugez-les à 12 000 fois G et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez la phase aqueuse séparée dans un tube frais et ajoutez 0,5 millilitre d’isopropanol pour chaque millilitre de réactif de lyse utilisé.

Après avoir incubé les tubes à température ambiante pendant 10 minutes, centrifugez les échantillons pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 75 % d’éthanol à l’ARN et centrifugez les tubes à 7 500 fois G et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Retirez complètement le surnageant et laissez l’échantillon sécher à l’air libre à température ambiante.

Ensuite, remettre l’ARN en suspension dans 15 à 30 microlitres d’eau traitée au DEPC. Pour purifier l’ARN de haute qualité après avoir extrait la pastille et lavé l’échantillon conformément au protocole textuel, utilisez un spectrophotomètre d’absorption pour tester la concentration et la pureté de l’ARN extrait. Assurez-vous que la valeur 260 sur 230 est d’environ 2,0 avant d’envoyer les échantillons d’ARN à un fournisseur ou à un corps pour l’analyse RNASeq et l’analyse des changements d’expression génique basée sur la quantification des lectures de séquençage.

Pour comparer une seule condition expérimentale à un contrôle, ouvrez les données des gènes exprimés de manière différentielle dans un logiciel de gestion de tableur. Sélectionnez la flèche déroulante en regard du bouton de tri, puis sélectionnez le tri personnalisé dans la feuille de calcul. Dans la fenêtre qui s’affiche, cochez la case sous la colonne et choisissez de trier par la colonne LFC.

Dans la colonne trier sur, assurez-vous que values est sélectionné. Dans la colonne Ordre, choisissez de trier du plus grand au plus petit et cliquez sur OK. Pour déterminer les gènes exprimés de manière différentielle trouvés dans deux conditions expérimentales, sur la feuille de calcul expérimentale par rapport au contrôle, sélectionnez la première cellule dans une colonne vide.

Ensuite, tapez l’équation suivante dans la cellule. Appuyez sur Entrée ou Retour pour exécuter l’équation. Sélectionnez la cellule contenant l’équation et cliquez sur la case dans le coin inférieur droit de la cellule.

Maintenez le bouton de la souris enfoncé et faites glisser la zone sélectionnée tout le long de la colonne jusqu’à ce que vous sélectionniez le dernier ID de caractéristique pour copier l’équation dans chaque cellule de la colonne. Sélectionnez à nouveau le tri personnalisé et ajoutez un deuxième niveau de tri en cliquant sur l’icône plus dans le coin inférieur gauche. Dans le premier niveau, trier par, sous colonne, sélectionnez Dupliquer.

Sous Trier sur, sélectionnez Valeurs, puis sous Ordre, sélectionnez Z pour A.In le deuxième niveau, puis par, sous colonne, sélectionnez LFC. Sous Trier sur, sélectionnez Valeurs, puis sous Ordre, sélectionnez du plus grand au plus petit, puis sélectionnez OK. Pour supprimer les parenthèses de la colonne des symboles de gène avant de continuer, sélectionnez la colonne entière contenant les symboles de gène.

Sélectionnez modifier, puis remplacer dans le menu déroulant Fichier. Tapez parenthèse ouvrante, étoile, parenthèse fermée, dans la barre de recherche de la fenêtre de remplacement, et baillez la barre de remplacement avec vide. Sélectionnez Remplacer tout pour supprimer toutes les instances de parenthèses.

Pour déterminer les voies enrichies, copiez les symboles de gènes souhaités dans le presse-papiers. Allez sur ConsensusPathDB, puis sélectionnez l’analyse des ensembles de gènes dans la barre latérale gauche de la page Web, suivie de l’analyse de surreprésentation. Dans la zone Coller une liste d’identificateurs de gènes et de protéines, collez la liste des gènes.

Sélectionnez le symbole du gène dans la case du type d’identificateur de gène/protéine et cliquez sur Continuer. Dans la section Ensembles basés sur les parcours, cochez la case en regard des parcours tels que définis par les bases de données de parcours. Sélectionnez Rechercher des ensembles enrichis pour obtenir la liste des voies contenant des gènes dans la liste d’entrée.

Sélectionnez tous les chemins enrichis à visualiser dans un réseau de chemins en cochant chaque case à côté des noms de chemins ou, sous Sélectionner dans l’en-tête de colonne au-dessus des zones de sélection, cliquez sur tout. Ensuite, sélectionnez visualiser les ensembles sélectionnés. Ajustez les filtres de chevauchement relatif et de candidats partagés en sélectionnant l’une des cases en haut au centre de la page et en saisissant le pourcentage, le chevauchement relatif ou le nombre de candidats partagés souhaités, puis sélectionnez Appliquer.

Pour déterminer les ontologies de gènes enrichies, copiez les symboles de gènes du groupe respectif dans le presse-papiers. Accédez à l’outil d’analyse d’enrichissement GO dans le Gene Ontology Consortium. Sur le côté gauche de la page, sous vos identifiants de gènes, collez la liste des symboles de gènes dans la case.

Sous la case ID de gène, sélectionnez le terme go, processus biologique. Ensuite, sélectionnez danio rerio sous la case des conditions d’utilisation et cliquez sur Soumettre. Effectuez une PCR QRT et comparez-la à RNASeq, selon le protocole texte.

Le séquençage de l’ARN extrait de larves injectées avec des Morpholinos contre alms1 ou bbs1 a révélé les gènes qui étaient uniquement régulés à la hausse et à la baisse dans les modèles Alstrom et BBS, ainsi que les gènes qui ont été significativement modifiés dans les deux modèles. Pour élucider plus clairement le profil moléculaire du modèle Alstrom, les voies et les ontologies génétiques enrichies dans les gènes exprimés de manière différentielle ont été identifiées. Comme le montre ici, 31 voies au total ont été régulées à la hausse.

Mis à part le large groupe du métabolisme, les voies les plus touchées étaient le système immunitaire inné et adaptatif, avec respectivement 32 et 20 gènes. Les événements de signalisation des récepteurs des lymphocytes B en aval ont également été enrichis. Plusieurs voies de signalisation ont également été enrichies parmi les gènes régulés à la hausse, ce qui correspond à l’association du syndrome d’Alstrom avec un dysfonctionnement primaire du cil.

De plus, trois voies associées à la sécrétion d’insuline ont été régulées à la hausse, les acides gras liés au GPR40, les acides gras libres et l’acétylcholine. Enfin, six termes GO ont été enrichis parmi les gènes régulés à la hausse dans le modèle Alstrom, notamment la différenciation des érythrocytes, l’homéostasie des érythrocytes, l’homéostasie des cellules myéloïdes et les processus homéostatiques. Une fois maîtrisé, l’analyse du parcours et des termes GO peut être effectuée en moins d’une heure.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la sélection des paramètres de voie et des valeurs seuils sont les considérations les plus importantes dans l’interprétation des résultats des comparaisons d’expression de RNASeq. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’application avec des lignées mutantes et l’analyse du transcriptome de types de cellules uniques, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le profilage du transcriptome des types de cellules et les modifications de l’expression génique sous le contrôle de gènes spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les données transcriptomiques du poisson-zèbre générées par RNASeq pour l’identification de changements significatifs d’expression génique entre les échantillons expérimentaux.