Name: Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Apprenez l'analyse transcriptomique RNASeq chez Danio rerio pour identifier les profils d'expression génique et comparer quantitativement les changements entre échantillons. Cette méthode permet d'étudier les voies biologiques perturbées.

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<ol><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Disease+Models+and+Chemical+Screens%22">The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens</a>. , 4th ed, Academic Press. (2017).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics%2C+and+Transcriptomics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics</a>. , 4th ed, Academic Press. (2016).</li>
<li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , 3rd ed, Academic Press. (2011).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cpdb.molgen.mpg.de/">http://cpdb.molgen.mpg.de/</a> (2017).</li>
<li>Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneontology.org/">http://www.geneontology.org/</a> (2017).</li>
<li>IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li>
<li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li>
<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’approche décrite dans le présent protocole offre une stratégie relativement rapide et rentable pour l’analyse du transcriptome-niveau des animaux entiers ou des populations spécifiques de cellules triées. Le poisson-zèbre est un modèle avantageux pour ce type d’étude en raison de la facilité et la rapidité dans la production de grandes quantités d’à partir de matériau, la facilité de mise en œuvre de génétique ou environnementales conditions expérimentales et la disponibilité d’une grande spectre des lignées transgéniq...

Analyse comparative de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier de nouveaux gènes qui contribuent à des phénotypes observés. Ces analyses s’appuient généralement sur l’évaluation quantitative de l’abondance de transcription comparé entre expérimental et échantillons de contrôle. Des approches ciblées, telles que qRT-PCR sont relativement rapide et précis pour l’étude des modifications de l’expression génique unique. Séquençage de RNA (RNASeq) propose une approche large et exempt d’hypothèse pour identifier des changements significatifs dans l’expression génétique entre les échantillons, ce qui en fait désormais la norme pour de telles enquêtes à travers des systèmes expérimentaux.
Poisson zèbre sont apparus comme un modèle important sur de nombreux domaines de la maladie. Développé à l’origine pour leur utilité dans les études de biologie du développement, en raison de leur forte fécondité et relativement faible coût d’entretien, utilisation expérimentale du poisson-zèbre a évolué pour inclure un large éventail de phénotypes d’embryonnaire au stade adulte aussi bien comme un large éventail de moléculaire dosages1,2,3. En effet, ces atouts font des études mécanistes moléculaires rapide et rentable en raison de la facilité d’acquisition de grandes quantités de matériel combiné avec la facilité des manipulations génétiques et environnementale à tous les stades de la vie. En outre, le caractère transparent des embryons de poisson-zèbre et des larves le rendent idéal pour générer les lignes de journaliste transgéniques spécifiques aux cellules et tissus permettant en vivo visualisation des cellules discrètes des populations4. L’exploitation de ces lignes permet analyse d’expression génique global dans les types spécifiques de cellules isolées, basés sur l’expression du gène rapporteur.
Nous présentons ici un protocole complet pour l’analyse d’expression de gène global à l’aide de RNASeq après la culture d’embryons de poisson-zèbre. Des manipulations expérimentales génétiques, y compris morpholino (MO)-base de gène transitoire ou génome induite par CRISPR édition, ont été présentés ailleurs5,6,7. Nous donc se concentrer sur un protocole détaillé pour l’isolement de l’ARN d’embryons entiers ou trier des cellules transgéniques exprimant le journaliste suivies par simple analyse computationnelle des résultats RNASeq à l’aide d’outils de voie et termes de gene ontology (GO). Enfin, nous avons inclus une stratégie pour la validation des modifications de l’expression génique par transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles sont applicables aux embryons de poisson-zèbre soumis à un large éventail de conditions expérimentales, y compris la comparaison des mutants génétiques ou des conditions environnementales.

<table><tbody><tr><td><Réactifs > commerciaux forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>Réactif de lyse</td><td>15596026</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>tampon de dissociation 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>tampon de dissociation 2</td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Conversion de l’ADNc FirstStrand</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>kit de conversion de l’ADNc</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACIS tampon</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>acétate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td> Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Zebrafish Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a :mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micron strainer</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube BD</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hémocytomètre</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td> Microscope inversé <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs d’accouplement 1,0 L Crossing Tank Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>tube FACS 5 mL tube en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>Analyse d’enrichissement http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’expression génique à base rnaseq de poisson-zèbre

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

L’analyse des modifications de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier les nouvelles voies qui sous-tendent les phénotypes observés. Le poisson-zèbre est un excellent modèle pour une évaluation rapide du transcriptome entier de populations cellulaires de tout animal ou individuels en raison de la facilité d’isolement de l’ARN du grand nombre d’animaux. Un protocole pour l’analyse de l’expression génique global chez les embryons de poisson-zèbre RNA séquençage (RNASeq) est présenté ici. Nous décrivons la préparation de l’ARN d’embryons entiers ou de populations de cellules obtenues à l’aide de cellules tri chez les animaux transgéniques. Nous décrivons également une approche pour l’analyse des données RNASeq pour identifier les voies enrichis et termes de Gene Ontology (aller) dans les ensembles de données d’expression génique global. Enfin, nous fournissons un protocole pour la validation des modifications de l’expression génique à l’aide de la transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles peuvent être utilisés pour une analyse comparative du contrôle et de coffrets de poisson zèbre pour identifier les modifications de l’expression des gènes nouveaux et donnent un aperçu moléculaire de phénotypes d’intérêt.

Tri de façon différentielle des gènes exprimés :
Pour identifier les gènes différentiellement exprimés dans le stade larvaire des modèles de poisson-zèbre de Syndrome d’Alström et Syndrome de Bardet-Biedl (BBS), nous avons ciblé soit alms1 ou bbs1 transcriptions en injectant déjà validés MOs en bloquant d’épissage embryons de poisson-zèbre sauvage16,17. 5 ...

Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

L'objectif général de cette analyse RNASeq sur des échantillons de larves de poisson zèbre est d'identifier les profils d'expression génique chez les embryons et les larves de poisson zèbre et de formuler des comparaisons quantitatives des modifications d'expression génique entre échantillons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans n'importe quel domaine où les embryons ou larves de poisson zèbre sont informatifs, par exemple comment la suppression d'un gène ciblé entraîne des changements d'expression génique ou une perturbation de certaines voies métaboliques par rapport à d'autres conditions. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le poisson zèbre se prête bien à la production d'un grand nombre d'individus, et que des données de transcriptome entier peuvent être facilement obtenues.En outre, l'isolement de types cellulaires spécifiques peut être réalisé facilement par tri d'animaux transgéniques. Les procédures seront démontrées par Lain Hostelley, étudiante diplômée, et Jessica Nesmith, post-doctorante de mon laboratoire. Pour commencer, cultiver les embryons jusqu'à l'âge de trois mois, correspondant à la maturité reproductive.Sé

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L'isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l'extraction d'ARN à partir d'embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l'ADNc pour l'application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l'analyse des microréseaux d'expression génique.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Microarrays Gene sont des outils puissants en matière de profilage d'expression génique au niveau du génome entier. Cette technologie a des applications dans une variété de disciplines biologiques, y compris la biologie du développement et de la toxicologie. Dans cette vidéo, nous détaillons un protocole d'analyse d'expression génique globale à l'aide d'une plateforme complète d'oligonucléotides biopuces pour le poisson zèbre.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

L’article décrit un protocole pour générer des embryons de poisson-zèbre par accouplement naturel et tri de leurs stades de développement. Le protocole est également utilisé pour l’analyse des cellules β pancréatiques à l’aide de poissons transgéniques.

L’accouplement et la mise en scène des ovules : une méthode pour générer des embryons et les trier par stade de développement

Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Nous présentons un protocole visant à isoler les neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre dans des conditions physiologiques et pathologiques. Après isolement, l’ARN est extrait de ces cellules à analyser leur profil d’expression génique. Ce protocole permet à la collection de l’ARN haute qualité pour effectuer des analyses en aval comme qPCR et transcriptomique.

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

Nous présentons ici un protocole à la tuberculose humaine de modèle dans un poisson-zèbre adulte à l’aide de son naturel pathogène Mycobacterium marinum. Extraits ADN et l’ARN des organes internes du poisson-zèbre infecté peuvent servir à révéler que le total mycobactériens charge dans le poisson et les réponses immunitaires de l’hôte avec le qPCR.

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Le poisson zèbre ciblant les électrophiles et les oxydants réactifs (Z-REX) est une méthode basée sur la biologie chimique pour l’étude de la signalisation réactive des petites molécules. Cette technique peut être appliquée à des poissons vivants de différents stades de développement. Ici, nous associons des tests standard chez le poisson zèbre avec Z-REX pour l’analyse de la voie de signalisation.

Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Apprenez l'analyse transcriptomique RNASeq chez Danio rerio pour identifier les profils d'expression génique et comparer quantitativement les changements entre échantillons. Cette méthode permet d'étudier les voies biologiques perturbées.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

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