Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

L’expression de rapporteurs fluorescents chez des animaux transgéniques permet de suivre les réponses cellulaires à des manipulations expérimentales dans des modèles vivants de maladies. Ici, la perte cellulaire sélective est induite pharmacologiquement chez le poisson zèbre, confocal multicolore à haute résolution. Des images des cellules ciblées et de leurs voisins immédiats sont acquises avant et immédiatement après, et leurs intervalles espacés après l’analyse des images du traitement médicamenteux démontrent l’activation des populations de cellules souches endogènes et le remplacement ultérieur des cellules ciblées pendant la phase de récupération.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la régénération, telles que Quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires utilisés pour régénérer les types de cellules discrètes Commencez par transférer les œufs transgéniques collectés lors des accouplements dans une boîte de Pétri contenant 0,3 x solution de danio 16 heures après la fécondation. AJOUTER du PTU pour inhiber l’activité de la tyrosine ECA avant tout signe de pigmentation dans le tissu d’intérêt. Si l’embryon n’est pas albinos, incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius.

Une fois que les rapporteurs sont évidents, placez la boîte de Pétri sous un microscope à zoom stéréo fluorescent et triez pour l’expression transgénique souhaitée. Avant l’imagerie. Préparez une solution de montage aérodynamique à faible point de fusion à 0,5 % dans un milieu embryonnaire et conservez-la à 40 degrés Celsius.

Ajouter du trica et du PTU si nécessaire. Mélangez délicatement et remettez à 40 degrés Celsius. Anesthésiez les poissons en les plaçant dans un milieu embryonnaire contenant des triques.

Pendant environ trois minutes, le poisson ne répondra plus. Pour toucher à l’aide d’une micro-pipette, aspirez chaque poisson dans une pointe de pipette taillée dans un volume d’environ 30 microlitres de solution anesthésique. Ensuite, retournez la pipette et laissez le poisson se déposer au fond.

Touchez la pointe à la solution de montage et laissez-les se transférer par gravité. Veillez à ne pas diluer l’agro afin qu’il puisse être réutilisé. Jeter la solution anesthésique restante de la micropipette.

Ensuite, à l’aide de la même pointe, transférez le poisson dans une boîte de Pétri. Dans environ 30 microlitres de solution de montage, orientez doucement le poisson de manière à ce que la région d’intérêt soit centrée dans la gouttelette aérodynamique. Assurez-vous que le poisson reste dans l’orientation souhaitée jusqu’à ce que l’aéros se solidifie.

Plusieurs poissons peuvent être montés dans une seule boîte de Pétri si vous le souhaitez. Une fois que l’aéros s’est solidifié, transportez le poisson au stade du microscope confocal et ajoutez doucement un milieu embryonnaire contenant du trica plus ou moins PTU dans la boîte jusqu’à ce que les poissons soient complètement immergés. Ouvrez le logiciel d’imagerie et concentrez-vous sur la région d’intérêt pour une imagerie optimale des détails cellulaires et/ou moléculaires.

Utilisez des objectifs à longue distance de travail avec des ouvertures numériques élevées dans le logiciel. Choisissez les quatre flores appropriés dans la liste des cadrans. Cliquez sur le réglage spectral et ajustez les plages d’émission.

Obtenir une séparation nette des signaux rapporteurs et maximiser les rapports signal/bruit. Sélectionnez l’objectif approprié dans le menu déroulant pour vous assurer que tous les préréglages définis par logiciel sont correctement ajustés. Pour focaliser les lasers et définir les niveaux de puissance, sélectionnez une sortie dans la table de correspondance qui révèle la saturation des pixels pour chaque canal.

Ensuite, réglez la sensibilité du détecteur pour obtenir la qualité d’image souhaitée, augmentez progressivement la sortie laser jusqu’à ce que l’intensité de l’image soit acceptable. Évitez la saturation des pixels dans la région d’intérêt et maintenez les niveaux de laser aussi bas que possible. Pour réduire les problèmes de photoblanchiment et de phototoxicité.

Assurez-vous que chaque ligne laser produit un signal détectable uniquement dans le canal approprié en allumant et en éteignant manuellement les lasers tout en surveillant tous les canaux d’imagerie. Si aucune diaphonie n’est évidente, tous les canaux peuvent être acquis simultanément. Ensuite, cadrez la zone d’intérêt à l’aide des fonctions de zoom et de rotation.

Réglez ensuite la vitesse de numérisation et la taille de l’image à l’aide de vitesses de numérisation plus rapides, minimisez le temps de séjour du laser et augmentez la résolution temporelle. Définissez la taille du pas de la dimension Z en fonction des besoins expérimentaux. Ici, une taille de pas de 10 microns est utilisée pour imager sept coupes optiques de tissu rétinien.

Une fois que les paramètres appropriés ont été déterminés, acquérez des images Zack et enregistrez-les. Passez ensuite au poisson suivant. Des images de capture et de remise à l’eau en série peuvent être effectuées pour suivre les changements cellulaires au cours des jours successifs, conformément aux instructions du document écrit d’accompagnement.

Lors de la réalisation d’une expérience d’imagerie multi-reporters, il est préférable d’utiliser des sols bien séparés, spectraux, mais ce n’est pas toujours pratique. Ici, nous montrons une méthode simple de soustraction d’image utilisant le logiciel open source image J pour séparer les étages avec des profils d’excitation et d’émission qui se chevauchent. Dans notre cas, GFP et YFP.

Les techniques d’imagerie chronologique décrites dans cette vidéo ont été utilisées pour surveiller les cellules souches rétiniennes marquées à la GFP pendant l’ablation et la régénération des neurones bipolaires rétiniens. Pour effectuer la séparation spectrale, collectez des images à l’aide de modes d’imagerie séquentiels et de paramètres de filtre de barrière variables, qui permettent d’acquérir des étages quatre qui se chevauchent indépendamment et partiellement séparés, respectivement. Une fois les images acquises, utilisez l’importation ImageJ loci bio formas pour ouvrir les fichiers image afin de démarrer l’outil d’importation. Faites glisser le fichier qui vous intéresse dans la fenêtre de l’image J.

Divisez les canaux en piles individuelles à l’aide de la case à cocher Diviser les canaux dans la fenêtre d’importation pour démarrer le plugin Align Three TP. Cliquez sur les plugins, puis alignez les piles. Alignez ensuite trois tp.

Les piles doivent être alignées pour assurer une soustraction correcte. Sélectionnez la pile de référence dans la première liste déroulante et la pile mal alignée dans la seconde. Cochez les cases Utiliser l’origine relative XY et Utiliser l’origine relative Z, puis cliquez sur OK.

Pour démarrer le processus d’alignement, cliquez sur le bouton d’enregistrement du volume. Une nouvelle fenêtre contenant les paramètres d’alignement s’affichera. Cliquez sur OK.

Cette section a été optimisée par le distributeur du plugin, aucune modification n’est donc nécessaire. Une fois terminé, une fenêtre de piles alignées apparaîtra. Sélectionnez Sortie dans la fenêtre alignée pour ouvrir la fenêtre de sortie.

Cette fenêtre est également optimisée et ne nécessite aucune modification. Cliquez sur OK. Une nouvelle pile apparaîtra dans l’espace de travail avec un alignement ajouté à la fin du titre du fichier.

Pour supprimer la diaphonie à l’aide de la calculatrice d’image, cliquez sur traiter puis calculatrice d’image. Sélectionnez la pile à soustraire dans la liste déroulante de l’image un et la pile à utiliser dans la soustraction. Dans la liste déroulante de l’image deux, sélectionnez soustraire dans la liste déroulante de l’opération et cliquez sur OK.

L’image J demandera à traiter la pile. Sélectionnez oui. Une nouvelle pile devrait apparaître, qui a supprimé la diaphonie entre les canaux qui se chevauchent.

Fusionnez les piles pour recréer la même structure d’image avant l’alignement et la soustraction. En sélectionnant des canaux fusionnés dans la fenêtre des outils de canal, l’outil permet de fusionner jusqu’à quatre piles en une hyper-pile. Enfin, colorisez les canaux, ajustez la luminosité et le contraste, et enregistrez les fichiers sous forme de tiffs pour examiner la perte ciblée et la régénération de la nitro réductase.

Cerise M exprimant les cellules bipolaires rétiniennes. Une série chronologique d’images confocales a été prise chez des poissons-zèbres avant le traitement. Il y a une expression en mosaïque du rapporteur YFP marqué par membrane dans les cellules bipolaires contrôlées montrées en jaune et la protéine de fusion de cerise nitro réductase dans les bipolaires ciblés montrés en rouge.

Le transgène CFP marqué à la membrane, illustré en cyan, fournit des informations contextuelles sur la plupart des autres cellules rétiniennes pour plus de clarté. La même image sans le signal CFP est montrée après un traitement par métronidazole. Les cellules bipolaires rouges exprimant la nitro réductase sont perdues tandis que les cellules bipolaires contrôlées jaunes sont épargnées.

Cela démontre le caractère très spécifique de cette méthodologie d’ablation. Encore une fois, la même image sans CFP est affichée pour plus de clarté. Lorsque le métropolite NIAZ est retiré, les cellules exprimant NTR reviennent ici.

Un exemple de la méthode de soustraction G-F-P-Y-F-P est illustré dans cette figure GFP étiquetée Mueller. Les cellules GL sont indiquées en vert et les cellules bipolaires marquées YFP sont indiquées en violet. Le chevauchement entre les deux produit du blanc pour effectuer la soustraction.

Les images GFP et YFP doivent d’abord être alignées. Le processus de soustraction permet ensuite de retirer les cellules bipolaires marquées YFP de l’image GFP, ce qui permet de représenter proprement Mueller ggl marqué GFP et de détecter les cellules Mueller plus faibles. Le chevauchement entre les cellules bipolaires marquées Mueller, ggl et M cherry indiquées en rouge peut maintenant être vérifié.

Les données présentées ici suggèrent que l’ablation des cellules bipolaires déclenche le mullar ggl pour remplacer les cellules perdues. Cette interprétation est conforme aux études récentes sur la régénération rétinienne, qui impliquent Mueller Ggl comme progéniteurs induits par des lésions chez les mammifères et les poissons. Cette technique permet aux chercheurs d’explorer les mécanismes régulant la régénération de types cellulaires spécifiques grâce à la visualisation de cellules souches chez le poisson zèbre.