Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

L'expression de marqueurs fluorescents chez des animaux transgéniques permet de suivre les réponses cellulaires aux manipulations expérimentales dans des modèles vivants de maladies. Ici, une perte cellulaire sélective est induite pharmacologiquement chez le poisson zèbre, et des images multicolores en microscopie confocale à haute résolution sont acquises avant, immédiatement après, et à des intervalles réguliers suivant le traitement par le médicament. L'analyse d'images démontre l'activation de populations de cellules souches endogènes et le remplacement ultérieur des cellules ciblées au cours de la phase de récupération.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie régénérative, telles que quelles sont les mécanismes cellulaires et moléculaires utilisés pour régénérer des types cellulaires précis. Commencez par transférer les œufs transgéniques recueillis à partir de croisements vers une boîte de Pétri contenant une solution 0,3 x danio, 16 heures après la fécondation. AJOUTER DU PTU pour inhiber l'activité de la tyrosine ACE avant toute apparition de pigmentation dans le tissu d'intérêt. Si l'embryon n'est pas albinos, incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius.

Une fois les marqueurs visibles, placer la boîte de Pétri sous un microscope stéréo à zoom fluorescent et trier selon l'expression du transgène souhaitée. Avant l'acquisition d'images, préparer une solution de montage à base d'agarose à bas point de fusion à 0,5 % dans le milieu pour embryons et la conserver à 40 degrés Celsius.

Ajouter du trica et du PTU si nécessaire. Mélanger délicatement et remettre à 40 degrés Celsius. Anesthésier les poissons en les plaçant dans du milieu d'embryon contenant du trica.

Pendant environ trois minutes, les poissons deviendront inactifs. Pour les manipuler à l’aide d’une micropipette, aspirez individuellement chaque poisson dans une pointe de pipette coupée, contenant environ 30 microlitres de solution anesthésiante. Ensuite, retournez la pipette et laissez le poisson s’accumuler au fond.

Toucher la pointe à la solution de montage et laisser les échantillons transférer par gravité. Veiller à ne pas diluer l'agro afin qu'elle puisse être réutilisée. Jeter la solution anesthésique restante provenant de la micropipette.

Ensuite, à l’aide de la même pipette, transférez le poisson dans une boîte de Pétri. Dans environ 30 microlitres de solution de montage, orientez délicatement le poisson de manière à ce que la région d’intérêt soit centrée dans la goutte d’aérosol. Veillez à ce que le poisson conserve l’orientation souhaitée jusqu’à ce que l’aérosol durcisse.

Plusieurs poissons peuvent être montés dans une seule boîte de Pétri si désiré. Une fois que l'agarose est solidifiée, transporter les poissons sur la platine du microscope confocal et ajouter délicatement du milieu pour embryons contenant de la trica avec ou sans PTU dans la boîte jusqu'à ce que les poissons soient complètement immergés. Ouvrir le logiciel d'acquisition d'images et focaliser sur la région d'intérêt pour une observation optimale des détails cellulaires et/ou moléculaires.

Utilisez des objectifs à longue distance de travail et à haute ouverture numérique dans le logiciel. Sélectionnez les lampes à fluorescence appropriées dans la liste déroulante. Cliquez sur les paramètres spectraux et ajustez les plages d'émission.

Pour obtenir une séparation nette des signaux des capteurs et maximiser les rapports signal sur bruit, sélectionnez l'objectif approprié dans le menu déroulant afin de garantir un ajustement correct des préréglages définis par le logiciel. Pour focaliser les lasers et régler les niveaux de puissance, sélectionnez une sortie dans le tableau de correspondance qui indique la saturation des pixels pour chaque canal.

Ensuite, réglez la sensibilité du détecteur pour obtenir la qualité d'image souhaitée, puis augmentez progressivement la puissance du laser jusqu'à ce que l'intensité de l'image soit satisfaisante. Évitez la saturation des pixels dans la région d'intérêt et maintenez les niveaux de laser aussi bas que possible afin de réduire les problèmes de photoblanchiment et de phototoxicité.

Veillez à ce que chaque ligne laser produise un signal détectable uniquement dans le canal approprié en activant et désactivant manuellement les lasers tout en surveillant tous les canaux d'imagerie. Si aucun crosstalk n'est observé, tous les canaux peuvent être acquis simultanément. Ensuite, cadrer la zone d'intérêt à l'aide des fonctions de zoom et de rotation.

Ensuite, réglez la vitesse de balayage et la taille de l'image : des vitesses de balayage plus rapides permettent de minimiser le temps de séjour du laser et d'augmenter la résolution temporelle. Réglez la taille du pas selon les besoins expérimentaux pour la dimension Z. Ici, une taille de pas de 10 micromètres est utilisée pour acquérir sept sections optiques de tissu rétinien.

Une fois les paramètres appropriés déterminés, acquérez les images de Zack et enregistrez-les. Puis passez au poisson suivant. Un examen successif avec relâcher peut être effectué pour suivre les changements cellulaires au fil des jours successifs, conformément aux instructions du document écrit joint.

Lorsqu'on réalise une expérience d'imagerie multiparamétrique, il est préférable d'utiliser des fluorophores dont les spectres sont bien séparés. Toutefois, cela n'est pas toujours pratique. Ici, nous présentons une méthode simple de soustraction d'images utilisant le logiciel libre ImageJ afin de séparer des fluorophores dont les profils d'excitation et d'émission se chevauchent. Dans notre cas, GFP et YFP.

Les techniques d'imagerie temporelle décrites dans cette vidéo ont été utilisées pour surveiller les cellules souches rétiniennes marquées avec la GFP pendant l'ablation et la régénération des neurones bipolaires rétiniens. Pour effectuer la séparation spectrale, acquérez des images en utilisant des modes d'imagerie séquentielle et des réglages variables de filtres d'interférence, ce qui permet d'acquérir indépendamment et de séparer partiellement les signaux de fluorescence superposés. Une fois les images acquises, utilisez l'importation ImageJ loci bio formas pour ouvrir les fichiers d'images et lancer l'outil d'importation. Glissez le fichier d'intérêt dans la fenêtre d'ImageJ.

Séparez les canaux en piles individuelles en utilisant la case à cocher « split channels » dans la fenêtre d'importation pour lancer le plugin align three TP. Cliquez sur plugins, puis sur align stacks. Ensuite, sélectionnez align three tp.

Les empilements doivent être alignés pour garantir une soustraction correcte. Sélectionnez l'empilement de référence dans la première zone déroulante et l'empilement désaligné dans la seconde. Cochez les cases utiliser l'origine relative XY et utiliser l'origine relative Z, puis cliquez sur OK.

Pour commencer le processus d'alignement, cliquez sur le bouton d'enregistrement du volume. Une nouvelle fenêtre apparaîtra, contenant les paramètres d'alignement. Cliquez sur OK.

Cette section a été optimisée par le distributeur du plugin, aucune modification n'est donc nécessaire. Une fois terminé, une fenêtre de piles alignées apparaîtra. Sélectionnez la sortie à partir de la fenêtre alignée pour ouvrir la fenêtre de sortie.

Cette fenêtre est également optimisée et ne nécessite aucune modification. Cliquez sur OK. Une nouvelle pile apparaîtra dans l'espace de travail, avec « aligné » ajouté à la fin du titre du fichier.

Pour éliminer le couplage parasite à l'aide de la calculatrice d'image, cliquez sur Traitement, puis sur Calculatrice d'image. Sélectionnez dans le menu déroulant Image 1 la pile à soustraire et la pile à utiliser pour la soustraction. Dans le menu déroulant Image 2, sélectionnez Soustraction dans le menu déroulant Opération, puis cliquez sur OK.

Image J demandera de traiter la pile. Sélectionnez oui. Une nouvelle pile devrait apparaître, dans laquelle les interférences entre les canaux superposés ont été éliminées.

Fusionnez les piles pour recréer la même structure d'image avant l'alignement et la soustraction. En sélectionnant les canaux fusionnés dans la fenêtre d'outils de canal, l'outil permet de combiner jusqu'à quatre piles en une hyperpile. Enfin, colorez les canaux, ajustez la luminosité et le contraste, puis enregistrez les fichiers au format tiff pour examiner la perte ciblée et la régénération de la nitro-réductase.

Cellules bipolaires rétiniennes exprimant M cherry. Une série temporelle d'images confocales a été réalisée chez des zebrafish individuels avant traitement. On observe une expression en mosaïque du rapporteur YFP marqué sur la membrane dans les cellules bipolaires contrôlées, en jaune, et la protéine de fusion nitro-réductase cherry dans les cellules bipolaires ciblées, en rouge.

Le transgène marqué par CFP membranaire illustré en cyan fournit des informations contextuelles sur la plupart des autres cellules rétiniennes, offrant ainsi une clarté accrue. La même image, sans le signal CFP, est présentée après traitement par la métronidazole. Les cellules bipolaires exprimant la nitro-réductase en rouge sont éliminées, tandis que les cellules bipolaires contrôles en jaune sont préservées.

Ceci démontre la nature hautement spécifique de cette méthodologie d'ablation. À nouveau, la même image sans CFP est présentée pour plus de clarté. Lorsque metro NIAZ est retiré, les cellules exprimant NTR reviennent à cet endroit.

Un exemple de la méthode de soustraction G-F-P-Y-F-P est montré dans cette figure GFP marquant Mueller. Les cellules GL sont représentées en vert et les cellules bipolaires marquées YFP apparaissent en violet. Le chevauchement entre les deux produit du blanc afin d'effectuer la soustraction.

Les images GFP et YFP doivent d'abord être alignées. Le processus de soustraction permet ensuite d'éliminer les cellules bipolaires marquées en YFP de l'image GFP, ce qui permet de représenter clairement les cellules de Mueller marquées en GFP et de détecter les cellules de Mueller plus faibles. Le chevauchement entre les cellules de Mueller faibles, ggl et les cellules bipolaires marquées en M cherry, indiqué en rouge, peut désormais être vérifié.

Les données présentées ici suggèrent que l'ablation des cellules bipolaires déclenche les cellules gliales de Müller (mullar ggl) à remplacer les cellules perdues. Cette interprétation est conforme aux études récentes sur la régénération rétinienne, qui impliquent les cellules gliales de Müller (Mueller Ggl) comme des progéniteurs induits par la lésion chez les mammifères et les poissons. Cette technique permet aux chercheurs d'explorer les mécanismes régulant la régénération de types cellulaires spécifiques grâce à la visualisation des cellules souches chez le poisson zèbre.