L'analyse de l'ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

Cette vidéo démontre une méthode permettant de mesurer l’efficacité et la précision de la réparation des freins à double brin de l’ADN par NHEJ ou HR dans une lignée cellulaire de mammifère. La procédure commence par la génération d’une lignée cellulaire contenant une copie unique chromosomiquement intégrée de la cassette de rapporteur NHEJ ou HR. Ces cellules rapporteures sont ensuite transfectées avec un mélange de I SCE, un plasmide exprimant le plasmide et le rouge DS et un plasmide.

Je sce. Une endonucléase produit une rupture double brin dans la construction du rapporteur et DS RED sert de contrôle de transfection. Le pourcentage de globules rouges positifs à la GFP et de globules rouges positifs au SD est ensuite analysé par fax afin de quantifier l’efficacité de la NHEJ ou de la HR si on le souhaite.

La fidélité de la réparation est analysée en sauvant les produits rapporteurs dans E coli et en séquençant les produits de réparation. De cette façon, l’efficacité et la fidélité de la rupture du brin doublet ou de la réparation de la CDB dans une lignée cellulaire donnée sont déterminées sur la base de la quantification cytométrique en flux des événements de réparation et du séquençage des produits de réparation. Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes existantes pour l’analyse de la réparation des freins à double corde.

Tout d’abord, cette méthode permet de différencier spécifiquement une recombinaison homologue d’une recombinaison non homologue et d’une jonction. Ensuite, la méthode est hautement quantitative, permettant l’analyse de millions de cellules par cytométrie en flux, puis la méthode ne nécessite pas d’emballage étendu des cellules une fois la réparation terminée pour la sélection des CL résistants aux antibiotiques. Et enfin, l’achèvement de la réparation peut être surveillé en temps réel en regardant l’apparence des cellules vertes.

Et cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation, telles que la mesure de la FC et de l’efficacité de réparation HEGA dans les types de cellules mutantes du virus ou après des traitements médicamenteux. Examinez la réparation A à différents stades du cycle cellulaire et mesurez le taux de réparation Si général. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est important d’obtenir une bonne efficacité de transfection.

Dans cette procédure. Deux cassettes rapporteures sont utilisées pour tester la réparation des cassures d’ADN double brin. Une cassette est utilisée pour examiner l’assemblage d’extrémités non homologues ou la réparation N-H-E-J-D-N-A.

L’autre est utilisé pour examiner la recombinaison homologue ou la réparation de l’ADN HR à l’extrémité non homologue. La cassette rapporteure d’assemblage contient un gène GFP avec un intron de trois kilobases modifié à partir du gène PEM un ou GFP PEM un. En bref, l’intro P one contient un exon adénoviral flanqué de séquences de reconnaissance pour l’endonucléase hindi trois et I SCE une pour l’induction de cassures double brin.

Les sites I SCE one ont une orientation inversée I SCE one a une séquence de reconnaissance non palindromique, donc deux sites inversés génèrent des incompatibles. Les extrémités de l’ADN sont incompatibles. Les extrémités de l’ADN imitent le mieux le dss naturel.

Une cassette NAEJ non arrangée est GFP négative car l’exon adénoviral perturbe le G-F-P-O-R-F. Lors de l’induction de cassures d’ADN double brin par ISEE un, l’exon adénoviral est retiré et NHEJ restaure la fonction du gène GFP. La cassette rapporteuse de recombinaison homologue est également basée sur la construction GFP PEM one dans la cassette HR.

Le premier exon de la PEM G FP contient une délétion de 22 paires de bases combinée à l’insertion de trois sites de restriction. I SCE un hindi trois I SCE E un. La suppression garantit que GFP ne peut pas être reconstitué par un événement NHEJ ici aussi.

Les sites I SCE one sont en orientation inversée. Ainsi, la digestion laisse des fins incompatibles. La première copie de GFP PMM est suivie d’un promoteur moins un TG, moins le premier exon et l’introduction de GFP M1. La construction intacte est GFP négative lors de l’induction d’une rupture double brin par une digestion.

Le gène GFP fonctionnel est reconstitué par un événement de conversion génique entre les deux copies mutées du premier exon GFP PMM, d’autres types de réparation de DSB, tels que le croisement sur un seul brin à genoux. Et NHEJ ne reconstituera pas le gène GFP. Puisque la deuxième copie du gène GFP est absente.

Le premier codon A TG et la résolution de l’exon second par croisement ou agenouillage simple brin ne restaure pas l’activité GFP. Cette conception permet donc la détection exclusive de la résolution par conversion génique, qui est la voie HR prédominante dans les cellules de mammifères. Pour commencer cette procédure, utilisez le kit endo free de Kyogen pour préparer un stock de haute qualité de plasmide rapporteur NHEJ ou HR, linéariser 10 microgrammes du plasmide et purifier l’ADN de la solution de digestion.

Consultez le protocole écrit ci-joint pour les détails de la préparation du plasmide. En préparation à la transfection. Assurez-vous que les fibroblastes humains normaux sont maintenus dans les meilleures conditions de croissance.

Si vous partez d’un flacon congelé, divisez les cellules deux fois avant la transfection. Si, à partir d’une plaque de confluence, les cellules se divisent, les cellules poussent une fois à 70 à 80 % de confluence. Cela prend environ deux jours pour cinq fois 10 à la cinquième cellules plaquées dans une plaque de 100 millimètres.

Pour une meilleure efficacité de transfection, amenez les cellules en croissance logarithmique. La culture en croissance active contient des cellules au stade M, vues comme des cellules arrondies attachées à la surface pour la récolte par transfection, environ deux fois 10 des six cellules à partir de deux plaques de 100 millimètres. Il est essentiel de ne pas trop trypsine, les cellules arrêtent la trypsine dès que 80 % des cellules se sont détachées de la plaque.

Mettez à nouveau les cellules en suspension dans la solution NHDF. Étant donné que les cellules sont sensibles à la solution NHDF, minimisez le temps d’incubation et mélangez doucement les cellules. Ensuite, utilisez l’effecteur nucléogène amaxa pour transfecter les cellules avec 0,5 microgramme de construction rapporteure linéarisée pour les fibroblastes humains normaux.

Ces conditions de transfection entraînent l’intégration d’une seule copie d’une construction rapporteure pour la majorité de l’intégr 24 heures après la transfection à un milligramme par millilitre de génétique ou G quatre 18. Afin de sélectionner les cellules avec des constructions rapporteures intégrées chromosomiquement, continuez la sélection pendant sept à 10 jours, puis choisissez soit des colonies individuelles résistantes G 4 1 8, soit regroupez les clones résistants. Étendez la culture à environ cinq plaques de 100 millimètres.

Congelez trois plaques pour une utilisation future et élargissez les deux plaques restantes à cinq fois 10 puissance cinq cellules par plaque de 100 millimètres. Dix plaques de cent millimètres suffisent généralement pour cinq transfects. Deux jours après le placage, les cellules contenant la construction rapporteure ont atteint 70 à 80 % de confluence avec un mélange de cinq microgrammes de plasmide d’expression, un plasmide exprimant et 0,1 microgramme de plasmide rouge SD.

Pour contrôler l’efficacité de la transfection, utilisez l’effecteur de nucléo AM maxon pour transfecter environ deux fois 10 des six cellules d’une culture à croissance logarithmique. Étant donné que l’efficacité de la DSP est mesurée par le rapport entre les cellules GFP positives et les cellules rouges SD positives, les variations dans le mélange de l’ISCE un et du plasmide rouge SD peuvent affecter les résultats. La qualité du plasmide peut également affecter les résultats en modifiant l’efficacité de la transfection.

Par conséquent, pour obtenir des mesures cohérentes, il est important d’utiliser le même mélange de plasmides dans une seule expérience. Transfectez environ deux fois 10 des six cellules. Les trois témoins sont cinq microgrammes de plasmide exprimant l’EGFP, cinq microgrammes de DS, plasmide rouge et cinq microgrammes.

Plasmide de contrôle qui n’exprime pas de protéine fluorescente. Trois jours après la transfection, vérifier l’efficacité de la transfection et de l’expression des protéines rouges GFP et DS par microscope inversé fluorescent avec filtres pour la détection de la GFP et de la DS. Les cellules sont cultivées pendant un jour supplémentaire avant l’analyse par télécopieur, quatre jours après la transplantation, récoltent les cellules transfectées I SCE one et les cellules témoins. À ce stade, il est essentiel de récolter toutes les cellules et d’avoir des cellules de forme ronde.

Pour ce faire, utilisez un temps de trypsinisation plus long ou une concentration plus élevée de trypsine. Examinez les cellules au microscope pour confirmer que 99 % des cellules sont détachées de la plaque et ont une forme ronde. Mettre à nouveau les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS et les transférer dans des tubes de fax.

Gardez les cellules sur de la glace et protégez-les de la lumière pendant qu’il est possible de stocker les cellules sur de la glace pendant quelques heures. Pour de meilleurs résultats, analysez les cellules immédiatement après la récolte. Ensuite, calibrez les faits avec TFP DS RED et les commandes négatives.

Ajustez la tension et la compensation de couleur afin d’inclure toutes les cellules fluorescentes dans l’analyse. Gardez à l’esprit que l’intensité fluorescente des échantillons expérimentaux est inférieure à celle des témoins. Après avoir calibré les faits avec les témoins, analysez les cellules transfectées I SCE one compter au moins 20 000 cellules pour chaque traitement afin d’éviter les interférences potentielles entre GFP et ds.

La fluorescence rouge maintient le pourcentage de globules rouges positifs à la GFP ou à un taux positif pour les cellules rouges en dessous de 25 %Si le pourcentage est supérieur, réduisez la quantité de plasmide RED ou d’un plasmide. Le pourcentage de cellules GFP positives correspond à l’efficacité de la réparation D-N-A-D-S-P et le pourcentage de cellules rouges positives SD indique l’efficacité de la transfection. Calculez l’efficacité relative de la réparation D-N-A-D-S-P en tant que rapport entre les cellules GFP positives et les cellules rouges SD positives.

Afin de déterminer la précision des injonctions réparées, sauvez les constructions rapporteures en digérant l’ADN génomique avec la circularisation de l’enzyme eco R one et la transformation en cellules e coli compétentes. Ce sauvetage est possible puisque les constructions originales contiennent une origine bactérienne de réplication analysée par restriction, digestion et séquençage. Il s’agit de faits typiques, résultats des transsections de contrôle et des expériences NHEJ et HR.

L’intensité de la fluorescence et le nombre de cellules fluorescentes sont plus faibles dans les cellules transfectées I SCE one par rapport aux témoins. La différence dans le signal de fluorescence est due à la différence dans le nombre de copies des constructions GFP et DS RED dans ces cellules. Chaque cellule de l’expérience contient une copie de la construction du rapporteur intégré.

Ainsi, les événements de réparation réussis reconstituent le gène GFP dans une fraction des cellules. L’efficacité de NHEJ et HR est calculée comme un rapport entre les cellules GFP positives et les cellules rouges SD positives. La NHEA est un processus plus efficace que la HR dans les cellules humaines, dans les fibroblastes humains, l’efficacité de la NHEJ est généralement de 0,6 à 1,3 et l’efficacité de la HR est de 0,05 à 0,3.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la réparation de l’ADN pour explorer les rôles de divers facteurs dans la HEG et la HR et étudier la cinétique et la régulation de la NHEG et de la HR dans les cellules de mammifères. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’efficacité et la précision de la FC et de la GJ dans les cellules de mammifères à l’aide d’un test fluorescent.