G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome
22 mars 2018
Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.
L'objectif général de cette procédure de séquençage profond de l'ADN provenant de cellules triées en flux selon la phase du cycle cellulaire est d'identifier les régions du génome qui se répliquent très tardivement au cours du cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réplication de l'ADN, telles que les régions du génome ayant des difficultés à terminer la réplication de l'ADN et qui sont donc particulièrement vulnérables aux réarrangements génomiques. Le principal avantage de cette technique est que, bien qu'elle soit très simple du point de vue expérimental, elle offre une vision étonnamment détaillée des dynamiques de réplication génomique.
Pour commencer, ensemencez des tubes à essai de 15 millilitres contenant huit millilitres de YEPD avec les cellules de levure d'intérêt. Un milieu synthétique ou riche est acceptable. Incubez les cellules toute la nuit pendant au moins 12 heures afin de les récolter durant leur phase de croissance exponentielle réelle.
Le jour suivant, lorsque les cultures atteignent une densité de cinq à 15 millions de cellules par millilitre, centrifuger les cellules et les resuspendre dans 1,5 millilitre d'éthanol à 70 %. Transférer ensuite la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,6 millilitre et laisser les cellules s'incuber pendant une heure à température ambiante ou pendant au moins trois heures sur de la glace. Après l'ensemencement, centrifuger les cellules et les resuspendre dans un millilitre de citrate de sodium.
Enfin, soniquer brièvement les cellules deux fois. Répéter ensuite le cycle de centrifugation et resuspendre la levure dans un millilitre de citrate de sodium contenant de l'ARNase. Laisser l'ARNase réagir avec la levure à 50 degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un bloc chauffant ou un bain-marie.
Après le traitement par la RNase, ajouter 50 microlitres de solution de protéinase K au mélange et poursuivre la réaction pendant une heure à 50 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger les cellules et resuspendre les cellules dans un millilitre de citrate de sodium. Puis centrifuger les cellules et aspirer le surnageant à l’aide d’un vide.
Ensuite, en lumière tamisée, resuspendre les cellules dans un millilitre de citrate de sodium avec un colorant vert pour les acides nucléiques. Incuber ensuite la levure à l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Pour continuer, compter les cellules à l’aide d’un trieur cellulaire en utilisant des données d’émission à 530 nanomètres.
Les trier en fonction de leur contenu en ADN selon les phases du cycle cellulaire : G1, S, début de G2 et fin de G2. Récupérer au moins 1,6 million de cellules haploïdes de chaque phase. Immédiatement après le tri, centrifuger les cellules pendant 20 minutes. Aspirer le surnageant et congeler le culot à -20 °C pour stockage.
Nous avons constaté que l'étape la plus critique de cette procédure consiste simplement à centrifuger rapidement les cellules après leur collecte, au plus une heure après le tri. Cette extraction est basée sur un kit d'extraction d'ADN génomique de levure. Commencez par ajouter 120 microlitres de tampon de digestion et cinq microlitres d'enzyme lytique de levure.
Ensuite, homogénéisez les cellules dans le mélange réactionnel à l’aide d’un vortex et incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Ajoutez ensuite 120 microlitres de tampon de lyse et vortexez le mélange à grande vitesse pendant 10 à 20 secondes. Puis ajoutez 250 microlitres de chloroforme et mélangez soigneusement le contenu du tube pendant une minute.
Ensuite, centrifuger le tube à vitesse maximale pendant deux minutes. Puis transférer le surnageant sur la colonne de liaison de l'ADN. Faire passer le surnageant à travers la colonne par une centrifugation d'une minute à vitesse maximale.
Pour laver l'ADN sur la membrane de la colonne, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage de l'ADN. Ensuite, répétez la centrifugation à vitesse maximale pendant une minute. Répétez cette étape de lavage une fois supplémentaire.
Pour recueillir l'ADN, transférez la colonne de centrifugation dans un tube propre. Ajoutez 60 microlitres d'eau et laissez reposer une à trois minutes. Puis, centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant 10 secondes afin d'isoler l'eau contenant l'ADN élué.
Ajoutez maintenant entre cinq et 195 microlitres de tampon à haute sensibilité pour ADN bicaténaire contenant le réactif à une concentration de un sur 200. Ensuite, mesurez la fluorescence de l'échantillon pour calculer le rendement. Prévoyez d'obtenir entre 10 et 50 nanogrammes d'ADN.
Utilisez maintenant la sonication pour fragmenter l'ADN en morceaux de 250 à 350 paires de bases. Ensuite, utilisez un kit standard pour préparer une bibliothèque d'ADN et séquencer avec au moins 10 millions de lectures simples de 50 paires de bases. La procédure décrite a été utilisée pour identifier les sites de réplication tardive chez la levure en bourgeonnement.
Des cellules normales ont été comparées à celles dépourvues de Sir2, une protéine désacétylase. Les données brutes contenaient de grands pics, principalement dus à la présence d'éléments TY. Ces pics ont été éliminés en plafonnant les profondeurs de lecture à 2,5 fois la profondeur médiane de lecture rouge pour chaque échantillon.
Les données débarrassées des pics ont ensuite été lissées à l'aide d'une fenêtre glissante de 20 kb. Enfin, les données ont été normalisées et représentées sous forme de rapports par rapport aux niveaux en phase G1. Une cellule complètement non répliquée apparaîtrait à 0,5, tandis qu'une cellule complètement répliquée apparaîtrait à 1. Dans ces données provenant du chromosome sept, on observait une région connue de réplication tardive chez le mutant Sir2.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier les régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication de l'ADN et qui sont par conséquent particulièrement vulnérables aux cassures d'ADN et à d'autres problèmes associés à une réplication tardive.
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Aperçu
Cet article décrit une technique qui combine la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit afin d'identifier les régions du génome qui se répliquent tardivement. Cette méthode fournit des informations sur la dynamique de la réplication génomique et aide à répondre à des questions clés dans le domaine de la réplication de l'ADN.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génomique
- Analyse du cycle cellulaire
- Réplication de l'ADN
Contexte
- La compréhension des régions du génome qui se répliquent tardivement est essentielle pour l'étude de la réplication de l'ADN.
- Ces régions pourraient être vulnérables aux réarrangements génomiques.
- Le tri en flux permet l'isolement de cellules en fonction de leur phase du cycle cellulaire.
- Le séquençage à haut débit offre une vision complète des dynamiques génomiques.
Objectif de l'étude
- Identifier les régions du génome qui se répliquent en fin de cycle cellulaire.
- Explorer les conséquences d'une réplication incomplète de l'ADN.
- Approfondir la compréhension de la stabilité génomique et des réarrangements.
Méthodes utilisées
- Cytométrie en flux pour trier les cellules selon la phase du cycle cellulaire.
- Séquençage profond de l'ADN provenant des cellules triées.
- Culture de cellules de levure en milieu YEPD.
- Incertion nocturne pour obtenir une distribution en phase logarithmique.
Résultats principaux
- La technique offre une vision détaillée des dynamiques de réplication génomique.
- Les régions identifiées comme se répliquant tardivement pourraient indiquer des zones sujettes à l'instabilité.
- Un dispositif expérimental simple permet d'obtenir des résultats significatifs.
- Fournit un cadre pour des recherches ultérieures sur la réplication de l'ADN.
Conclusions
- Cette méthode est efficace pour l'étude de la réplication tardive dans le génome.
- Elle peut aider à identifier les vulnérabilités de la réplication de l'ADN.
- L'approche est accessible et informative pour les chercheurs du domaine.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'identification des régions génomiques à réplication tardive fournit des informations essentielles sur l'instabilité chromosomique, un facteur clé dans l'ontogenèse et les pathologies liées au vieillissement. Cette technique permet la détection précoce des régions génomiques sujettes aux cassures et aux mutations, soutenant ainsi la validation ciblée des voies de réponse aux dommages de l'ADN. En associant le moment de la réplication à la vulnérabilité fonctionnelle, elle améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques de maintien du génome.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier le moment de la réplication en tant que biomarqueur d'instabilité génomique dans les modèles de maladies.
- Valeur opérationnelle : Associe la cytométrie en flux au séquençage afin d'isoler et d'analyser des populations d'ADN spécifiques à chaque phase.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des profils quantitatifs de l'ordre de réplication à l'échelle du génome pour le criblage comparatif.
- Valeur opérationnelle : Un flux de travail standardisé utilisant le tri selon la teneur en ADN et la préparation de bibliothèques favorise la reproductibilité du test.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Révèle les régions présentant des taux accrus de cassures et de mutations, fournissant ainsi des informations pour la détection mécanistique des cibles liées à la stabilité du génome.
- Valeur opérationnelle : Permet la comparaison entre des souches sauvages et des mutants (par exemple, Sir2) afin d’évaluer les modificateurs génétiques du moment de réplication.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux premières phases de découverte en fournissant des données génomiques fonctionnelles qui éclairent le choix des cibles et l'analyse des voies métaboliques avant l'identification du composé directif.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les effets du moment de réplication concernant la stabilité génomique et l'intégrité chromosomique.
- Tri : Fournit des données de séquençage normalisées et corrigées des biais liés aux étalons internes, permettant des comparaisons quantitatives de l'achèvement de la réplication entre différentes conditions.
- Analyse : Utilise un lissage par fenêtre glissante et des rapports normalisés par rapport à la phase G1 pour produire des cartes de chronologie de réplication facilement interprétables.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la réplication tardive et des résultats phénotypiques tels que les cassures et les mutations, renforçant ainsi la pertinence translationnelle des biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Adaptable à tout type cellulaire pouvant être trié par cytométrie en flux, permettant une application transversale dans des projets utilisant des systèmes de mammifères ou de levures.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans l'identification des loci génomiques mécaniquement vulnérables.
- Valeur opérationnelle : Protocole normalisé et évolutif allant du tri cellulaire à la préparation de la bibliothèque de séquençage.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon en mettant en évidence les cibles associées au stress de réplication et à l'instabilité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles de maintenance du génome fondée sur la vulnérabilité liée au moment de réplication.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise en cytométrie en flux, extraction des acides nucléiques et préparation de bibliothèques pour séquençage de nouvelle génération.
- Instrumentation pour le tri cellulaire, la sonication et les plateformes de séquençage à haut débit.
- Standardisation des paramètres de suppression des pics (limitation de la profondeur de lecture) et de lissage entre les échantillons.
- Considérations d'adaptation selon les tailles de génome et les types cellulaires autres que la levure.
- Limite pratique : nécessite un nombre suffisant de cellules (1,6 million par phase) et un chronométrage précis après le tri pour éviter la dégradation.
