G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome

L’objectif global de cette procédure de séquençage profond de l’ADN à partir de cellules qui ont été triées en flux selon la phase du cycle cellulaire est d’identifier les régions du génome qui se répliquent extrêmement tard dans le cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réplication de l’ADN, telles que les régions du génome qui ont du mal à terminer la réplication de l’ADN et sont donc particulièrement vulnérables aux réarrangements du génome. Le principal avantage de cette technique est que, même si elle est très simple d’un point de vue expérimental, elle offre une vision étonnamment riche de la dynamique de la réplication génomique.

Pour commencer, inoculez des tubes à essai de 15 millilitres contenant huit millilitres de YEPD avec des cellules de levure d’intérêt. Un milieu synthétique ou riche est acceptable. Cultivez les cellules pendant une nuit pendant au moins 12 heures pour les collecter lors de leur distribution réelle en phase logarithmique.

Le lendemain, lorsque les cultures ont une densité de cinq à 15 millions de cellules par millilitre, faites tourner les cellules et mettez-les en suspension dans 1,5 millilitre d’éthanol à 70 %. Transférez ensuite la suspension dans un tube microfuge de 1,6 millilitre et laissez les cellules incuber à température ambiante pendant une heure ou pendant au moins trois heures sur de la glace. Après l’inoculation, faites tourner les cellules et mettez-les en suspension dans un millilitre de citrate de sodium.

Enfin, soniquez brièvement les cellules deux fois. Répétez ensuite le cycle de centrifugation et remettez la levure en suspension dans un millilitre de citrate de sodium contenant de la RNase. Laissez la RNase réagir avec la levure à 50 degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un bloc de chaleur ou un bain-marie.

Après le traitement à la RNase, ajoutez 50 microlitres de solution de protéinase K au mélange et continuez la réaction pendant une heure à 50 degrés Celsius. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de citrate de sodium. Ensuite, centrifugez les cellules et aspirez le surnageant à l’aide d’un vide.

Puis, dans la pénombre, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de citrate de sodium avec coloration verte à l’acide nucléique. Maintenant, incubez dans la levure à l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Pour continuer, comptez les cellules à l’aide d’un trieur de cellules utilisant des données d’émission de 530 nanomètres.

Triez-les en fonction de leur contenu en ADN dans leurs phases de cycle cellulaire, G1 S, G2 précoce et G2 tardif. Collecter au moins 1,6 million de cellules haploïdes de chaque phase. Rapidement après avoir trié les cellules, faites-les tourner pendant 20 minutes. Aspirez le surnageant et congelez la pastille à moins 20 degrés Celsius pour le stockage.

Nous avons constaté que l’étape la plus critique de cette procédure consiste simplement à faire tourner les cellules rapidement après les avoir collectées, une heure au maximum après le tri. Cette extraction est basée sur un kit d’extraction d’ADN génomique de levure. Commencez par ajouter 120 microlitres de tampon de digestion et cinq microlitres d’enzyme lytique de levure.

Mélangez ensuite les cellules dans le mélange réactionnel à l’aide d’un vortex et incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Ensuite, ajoutez 120 microlitres de tampon de lyse et vortex le mélange à grande vitesse pendant 10 à 20 secondes. Ajoutez ensuite 250 microlitres de chloroforme et pendant une minute, mélangez soigneusement le contenu du tube.

Ensuite, faites tourner le tube à vitesse maximale pendant deux minutes. Transférez ensuite le surnageant sur la colonne de liaison à l’ADN. Faites tourner le surnageant à travers la colonne en utilisant un cycle de centrifugation à vitesse maximale d’une minute.

Pour laver l’ADN sur la membrane de la colonne, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et appliquez 300 microlitres de tampon de lavage de l’ADN. Répétez ensuite la centrifugation à vitesse maximale pendant une minute. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.

Pour collecter l’ADN, transférez la colonne de spin dans un tube frais. Ajoutez 60 microlitres d’eau et attendez une à trois minutes. Ensuite, centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant 10 secondes pour isoler l’eau contenant l’ADN élué.

Ajoutez maintenant entre cinq et 195 microlitres de tampon d’ADN double brin à haute sensibilité contenant un réactif à une concentration de un à 200. Mesurez ensuite la fluorescence de l’échantillon pour calculer le rendement. Attendez-vous à collecter entre 10 et 50 nanogrammes d’ADN.

Utilisez maintenant la sonication pour décomposer l’ADN en fragments compris entre 250 et 350 paires de bases. Ensuite, utilisez un kit standard pour préparer une banque d’ADN et séquencez-la à l’aide d’au moins 10 millions de lectures à une extrémité de 50 paires de bases. La procédure décrite a été utilisée pour identifier les sites de réplication tardive chez les levures bourgeonnantes.

Les cellules normales ont été comparées à celles dépourvues de Sir2, une protéine désacétylase. Les données brutes contenaient de grands pics principalement dus à la présence d’éléments TY. Ces pointes ont été éliminées en plafonnant les profondeurs de lecture à 2,5 fois la profondeur médiane rouge pour chaque échantillon.

Les données dédominées ont ensuite été lissées à l’aide d’une fenêtre glissante de 20 Ko. Enfin, les données ont été normalisées et tracées sous forme de ratios aux niveaux en G1. Une cellule complètement non répliquée apparaîtrait à 0,5 et une cellule complètement répliquée apparaîtrait à un. Dans ces données du chromosome sept, il y avait des preuves d’une région de réplication tardive connue chez le mutant Sir2.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication de l’ADN et qui sont donc particulièrement vulnérables aux cassures de l’ADN et à d’autres problèmes associés à la réplication tardive.