Name: Identification des empreintes de pas de lARN: Complexes protéiques par lintermédiaire de limmunoprécipitation dARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Découvrez la méthode RIPiT-Seq pour identifier les régions d'ARN liées par des complexes protéiques dans les cellules mammifères. Cette technique d'immunoprécipitation en tandem permet d'étudier les interactions ARN:protéines sans UV-crosslinking.

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<ol><li>Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li>
<li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+UPF1%2C+eRFs%2C+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li>
<li>Papasaikas, P., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spliceosome%3A+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li>
<li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).</li>
<li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mRNA+Decay%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+%28iCLIP%29+to+Determine+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Detection%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li>
<li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome%E2%80%90wide+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li>
<li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li>
<li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPiT-Seq%3A+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA%3Aprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li>
<li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li>
<li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li>
<li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li>
<li>Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li>
<li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Argonaute+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li>
<li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2(2015).</li>
<li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237(2015).</li>
<li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li>
<li>Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPmap%3A+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).</li>
<li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li>
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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous discutons ici de quelques considérations clés pour effectuer avec succès RIPiT. Tout d'abord, les adresses IP individuelles doivent être optimisées pour atteindre la plus grande efficacité possible à chaque étape. La quantité de perles d'agarose DE FLAG pour le nombre d'entrées de cellules décrites ici s'est avérée robuste pour un large éventail de protéines que nous avons testées. Comme seule une petite fraction des protéines partenaires est co-immunoprécipitée avec la protéine FLAG, la quantité d'anticorps nécessa...

Dans les cellules, l'ARN existe dans le complexe avec des protéines pour former des complexes ARN:protéines (RNP). Les RRP sont assemblés autour de protéines liant l'ARN (RBPs, celles qui lient directement l'ARN) mais comprennent également des non-RRP (ceux qui lient les RRP mais pas l'ARN), et sont souvent de nature dynamique. Les RRP et leurs cofacteurs fonctionnent collectivement au sein des RNi pour exécuter des fonctions réglementaires. Par exemple, dans la voie de désintégration de l'ARNm médiée par l'absurdité (NMD), les protéines UPF (UPF1, UPF2 et UPF3b) reconnaissent le ribosome prématurément terminé. Chacune des protéines de l'UPF peut se lier à l'ARN, mais ce n'est que lorsqu'elles s'assemblent ensemble qu'un complexe actif de NMD commence à se former. Dans ce complexe, UPF1 est encore activé par la phosphorylation par un SMG1 non-RBP, et une telle activation UPF1 conduit finalement au recrutement de la désintégration de l'ARNm induisant des facteurs1,2. Dans cet exemple, les RRP exigent des cofacteurs non-RBP pour le recrutement et l'activation du complexe RNP qui déclenche la MNM. Une autre propriété des RNP est leur hétérogénéité compositionnelle. Considérez le spliceosome, qui existe dans les complexes E, A, B ou C distincts. Différents complexes épiscédsome ont des protéines qui se chevauchent et des protéines distinctes3. Pour étudier les fonctions RNP, il est important d'élucider quels ARN sont liés par un RBP et ses protéines associées. De nombreuses méthodes existent pour y parvenir, chaque approche ayant ses avantages et inconvénients distincts4,5,6,7.
Les méthodes très populaires pour identifier les sites de liaison RBP — liaisons croisées suivies par l'immunoprécipitation (CLIP) et ses diverses variations - s'appuient sur la lumière ultraviolette (UV) pour relier un RBP à l'ARN8. Cependant, ce n'est pas une approche efficace pour les non-RPP dans les RNP, qui ne contactent pas l'ARN directement. Ici, nous décrivons une approche alternative qui s'applique aux RRP et aux non-RPR, pour isoler et identifier leurs sites de liaison d'ARN. Cette approche appelée immunoprécipitation d'ARN en tandem (RIPiT) se compose de deux étapes d'immunoprécipitation, qui aident à atteindre une spécificité plus élevée par rapport à une seule purification (Figure 1)9,10. Comme les étapes individuelles d'immunoprécipitation (IP) peuvent être effectuées à une chaîne inférieure par rapport à CLIP, RIPiT ne dépend pas de la disponibilité d'anticorps qui peuvent résister à la présence de détergents forts pendant l'immunoprécipitation. L'avantage le plus unique de RIPiT est la capacité de cibler deux protéines différentes en deux étapes de purification; ceci fournit un moyen puissant d'enrichir un complexe RNP compositionnellement distinct d'autres complexes similaires11.
De petites variations à la procédure RIPiT peuvent encore améliorer l'enrichissement RNP. Par exemple, certaines interactions ARN-protéines ou protéines-protéines au sein des RNP sont transitoires et il peut être difficile de purifier efficacement les empreintes de ces complexes. Pour stabiliser de telles interactions, les RNR peuvent être reliés entre eux à l'intérieur des cellules avec du formaldéhyde avant la lyse cellulaire et le RIPiT. Par exemple, nous avons observé qu'une faible interaction entre le facteur de base du complexe de jonction d'exon (EJC), EIF4AIII et le facteur de désassemblage de l'EJC, PYM12 peut être stabilisée avec un traitement au formaldéhyde de telle sorte que plus d'empreintes d'ARN sont enrichies (données non montré). Avant la récolte cellulaire et le RIPiT, les cellules peuvent également être traitées avec des médicaments pour stabiliser ou enrichir les RNi dans un état particulier. Par exemple, lors de l'étude des protéines qui sont retirées de l'ARNm pendant la traduction (p. ex., l'EJC13, UPF114), le traitement avec des inhibiteurs de traduction tels que la puromycine, le cycloheximide ou la harringtonine peut entraîner une augmentation de l'occupation de protéines sur les ARN.
La quantité d'ARN récupérée dans le RIPiT est généralement faible (0,5-10 pmoles, c'est-à-d.- 10-250 ng ARN compte tenu d'une longueur moyenne d'ARN de 75 nt). La principale raison en est que seule une petite fraction d'une protéine donnée est présente en complexe avec d'autres protéines dans les RNP (toute protéine ip'ed "libre" dans la première étape est perdue au cours de la deuxième PI). Pour générer des bibliothèques RNA-Seq à partir de cet ARN, nous avons également décrit ici une adaptation du protocole précédemment publié adapté à ces faibles entrées d'ARN15,16 (Figure 2), qui donne des échantillons prêts à sequencing à haut débit dans 3 Jours.

<table><tbody><tr><td>Anti-FLAG Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma ;-32P]- 3 000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &micro ; Ci</td><td>PerkinSeringues</td> jetables <td>Elmer BLU502A250UC</td><td></td></tr><tr><td>BD avec embouts Luer-Lok (200)</td><td>Fisher</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Bétaïne 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>biotin-dATP</td><td>TriLink</td><td>N-5002</td><td></td></tr><tr><td>biotin-dCTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL540001EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier, Modèle SSE-1</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CircLigase I</td><td>VWR</td><td>76081-606</td><td>ssDNA ligase I</td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>ThermoFisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de charge d’ADN NEB</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>LifeTech</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In-T-REx 293 Lignée cellulaire</td><td>ThermoFisher</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA Ladder</td><td>ThermoScientific</td><td>FERSM1203</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE Gel 10 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>4565013</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td></td></tr><tr><td>adaptateur miRCAT-33 5&prime ;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>Mirus transIT-X2 réactif de transfection</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td></td></tr><tr><td>Mth RNA ligase</td><td>NEB</td><td>E2610S</td><td></td></tr><tr><td>PE1.0 5&prime ;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plate-forme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>PE2.0 5&prime ;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCTCTCTCCCGATC*T-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage</td></tr><tr><td>Illumina Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)</td><td>Fisher</td><td>BP1752I-100</td><td></td></tr><tr><td>Purple Gel Loading Dye (6x)</td><td>NEB</td><td>NEB #7025</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491S/L</td><td></td></tr><tr><td>RNase I, E. coli, 1,000 U</td><td>Eppicenter</td><td>N6901K</td><td></td></tr><tr><td>Colonne SPIN-X</td><td>Corning</td><td>CLS8160-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Perles de streptavidine</td><td>ThermoFisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III (SSIII)</td><td>ThermoScientific</td><td>18080044</td><td>enzyme de transcriptase inverse</td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td>colorant gel d’acide nucléique d’or</td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide Kinase-2500U</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4RNL2 Tr. K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Thermostable 5&acute ; Application DNA/ARN Ligase</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq_SE1 5&prime ;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE10 5&prime ;-pGGTGTTCNNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE11 5&prime ;-pGGTAAGTNNNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE12 5&prime ;-pGGAGATGNNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE2 5&prime ;-pGGGTAGCNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE35&prime ;-pGGTCGATNNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE4 5&prime ;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE5 5&prime ;-pGGTGACANNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE6 5&prime ;-pGGTAGACNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE7 5&prime ;-pGGGCCCTNNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE8 5&prime ;-pGGATCGGNNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE9 5&prime ;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ce protocole n’est compatible qu’avec la plateforme de séquençage Illumina</td></tr><tr><td>Typhoon 5, l’imageur bimoléculaire</td>, <td>GE Healthcare, Life Science</td><td>, 29187191</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des empreintes de pas de l'arn: complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'arn dans tandem suivi du séquençage (ripit-seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

L'immunoprécipitation d'ARN en tandem (RIPiT) est une méthode pour enrichir des empreintes d'ARN d'une paire de protéines dans un complexe d'ARN:protéine (RNP). RIPiT emploie deux étapes de purification. Tout d'abord, l'immunoprécipitation d'une sous-unité marquée de RNP est suivie de la digestion douce de RNase et de l'élution d'affinité non dénaturante suivante. Une deuxième immunoprécipitation d'une autre sous-unité RNP permet l'enrichissement d'un complexe défini. À la suite d'une suppression dénaturante des ARN et des protéines, les empreintes d'ARN sont converties en bibliothèques de séquençage de l'ADN à haut débit. Contrairement à l'ultraviolet plus populaire (UV) crosslinking suivie par l'immunoprécipitation (CLIP) approche pour enrichir les sites de liaison RBP, RIPiT est UV-crosslinking indépendant. Par conséquent RIPiT peut être appliqué à de nombreuses protéines présentes dans l'interagiome ARN et au-delà qui sont essentiels à la régulation de l'ARN, mais ne pas entrer directement en contact avec l'ARN ou UV-crosslink mal à l'ARN. Les deux étapes de purification du RIPiT offrent un avantage supplémentaire d'identifier les sites de liaison où une protéine d'intérêt agit en partenariat avec un autre cofactor. La stratégie de double purification sert également à améliorer le signal en limitant le fond. Ici, nous fournissons une procédure progressive pour effectuer RIPiT et pour générer des bibliothèques de séquençage à haut débit à partir d'empreintes d'ARN isolées. Nous exposons également les avantages et les applications du RIPiT et discutons de certaines de ses limites.

Un RIPiT réussi se traduira par l'immunoprécipitation des protéines d'intérêt et d'autres protéines en interaction connues, et l'absence de protéines non-interagissant. Comme on le voit à la figure 3A, Magoh et EIF4AIII ont été détectés dans l'élution du RIPiT, mais HNRNPA1 ne l'était pas (voie 6). En parallèle, les empreintes d'ARN qui ont co-purifié avec les complexes RNP ont été détectées par autoradiographie (figure3B) ou bi...

Ici, nous présentons un protocole pour enrichir les sites endogènes de liaison d'ARN ou « empreintes » des complexes d'ARN:protéines (RNP) des cellules mammifères. Cette approche implique deux immunoprécipitations des sous-unités de RNP et est donc surnommée immunoprécipitation d'ARN en tandem (RIPiT).

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

L’immunoprécipitation de l’ARN en tandem suivie du séquençage, ou RIPiT-Seq, est une méthode pour identifier quelles régions de l’ARN sont liées par une paire particulière de protéines liant l’ARN. L’avantage le plus unique de RIPiT est sa capacité à cibler deux protéines différentes en deux purifications. Cela fournit un moyen puissant d’enrichir pour un complexe de protéines ARN distincte sur le plan de la composition d’autres complexes.En outre, RIPiT-Seq est indépendant de croisement UV, et peut être appliqué à beaucoup de protéines qui agissent sur l’ARN sans le lier directement. Bien que cette méthode ne s’étende pas directement vers la thérapie ou le diagnostic, les protéines liant l’ARN et le traitement de l’ARN ont été associés à plusieurs maladies comme les neuropathies et le cancer. RIPiT-Seq fournit un outil pour étudier les fonctions des protéines liant l’ARN liées à la maladie.RIPiT-Seq nécessite un système où une protéine marquée par l’épitope peut être exprimée. Il n’a été testé que dans les cellules HEK293, et est le plus agréable à la culture cellulaire. Cependant, maintenant avec notre capacité à étiqueter les protéines à l’aide de CRISPR, RIPiT-Seq peut être applicable à divers systèmes modernes.Le succès du RIPiT dépend de deux immunoprécipices efficaces, il sera donc essentiel d’optimiser les conditions d’immunoprécipice pour l’anticorps utilisé. En outre, travailler avec l’ARN exige des précautions appropriées, de sorte que les reagents sans RNase devraient être utilisés pendant et après l’extraction de l’ARN. Lauren Woodward, étudiante diplômée dans mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par laver délicatement les cellules monocouches avec 15 millilitres de PBS réfrigéré par plaque de 15 centimètres. Puis racler les cellules en 30 millilitres de PBS et les recueillir dans un tube conique de 50 millilitres. Pelleter les cellules en centrifugant à 400 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, et jeter le supernatant.Ajouter quatre millilitres de tampon de lyse hypotonique glacée et utiliser une pipette P1000 pour suspendre à nouveau les cellules. Transférer le lysate dans un tube de cinq millilitres et incuber sur la glace pendant 10 minutes. Placez le lysate dans un bain de glace et sonicate selon les instructions manuscrites.Ajouter ensuite 108 microlitres de cinq molaires de chlorure de sodium pour ajuster la concentration de sel à 150 milli molaires. Ensuite, centrifugez le lysate à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et recueillez 20 microlitres du supernatant pour l’analyse des taches occidentales. Pré-laver les perles d’agarose FLAG selon les instructions manuscrites et appliquer le surnatant restant à 750 microlitres de perles dans un tube de cinq millilitres.Incuber les perles d’agarose FLAG avec l’extrait cellulaire pendant une à trois heures à quatre degrés Celsius avec un mélange doux. Après l’incubation, pelleter les perles par centrifugation à 400 g pendant une minute à quatre degrés Celsius, et recueillir 20 microlitres du supernatant pour l’analyse des taches occidentales. Jetez le supernatant restant et lavez les perles en les résusant en quatre millilitres de tampon de lavage iso.Pelleter les perles à nouveau et enlever le supernatant. Diluer RNase I en 750 microlitres de tampon de lavage iso selon les instructions manuscrites, et l’ajouter aux perles d’agarose FLAG. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius avec un mélange doux, puis pelleter les perles par centrifugation.Recueillir 20 microlitres de supernatant pour l’analyse des taches occidentales, et jeter le reste. Ensuite, lavez les perles avec le tampon de lavage d’iso comme décrit précédemment. Ensuite, effectuez l’élitution d’affinité en ajoutant 375 microlitres de tampon d’élitution aux perles, et en secouant doucement le mélange à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures.Après l’incubation, pelleter les perles et recueillir un aliquot de 15 microlitres de l’élitution pour l’analyse des taches occidentales. Tandis que l’elution d’affinité est en cours, exécutez la conjugaison magnétique d’anticorps de perle. Commencez par laver 50 microlitres de perles magnétiques en un millilitre de tampon de lavage iso.Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de conjugaison et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps. Ensuite, incuber les perles pendant au moins 10 minutes à température ambiante. Lavez les perles magnétiques deux fois avec le tampon de conjugaison et réutilisez les perles dans 375 microlitres de tampon de dilution RIPiT.Conserver les perles sur la glace jusqu’à l’immunoprécipice. Appliquer l’élitution d’affinité FLAG sur les perles magnétiques couplées aux anticorps et incuber avec un mélange doux pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius. Capturez les perles magnétiques à l’aide d’un aimant et recueillez 15 microlitres de supernatant pour l’analyse des taches occidentales.Ensuite, lavez les perles sept fois avec le tampon de lavage d’iso. Procéder à l’allongement de l’allongement en réutilisant les perles magnétiques dans 100 microlitres de tampon d’échantillon clair et en incubant la suspension sur la glace pendant 10 minutes. Pendant l’incubation, feuilletez périodiquement les perles pour les résuser.Capturez les perles magnétiques sur un aimant et recueillez 15 microlitres d’élitution pour l’analyse des taches occidentales. Transférer l’élitution restante dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour extraire l’ARN, ajouter 320 microlitres d’eau sans RNase et 400 microlitres d’alcool d’isoamyle phénol-chloroforme à l’élitution du RIPiT.Vortex le mélange, puis le centrifuger à 12 000 g pendant cinq minutes. Recueillir 350 microlitres de la phase aqueuse dans un tube séparé. Ajouter l’acétate de sodium, le chlorure de magnésium, le glycogène et l’éthanol à l’échantillon prélevé et incuber le mélange pendant la nuit à 20 degrés Celsius négatifs.Le lendemain, pelleter l’ARN par centrifugation à 12 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et le laver à 70% d’éthanol. Après le lavage à l’éthanol, traiter l’ARN avec la kinase polynucléotide T4, ou PNK, sans ATP, et effectuer la purification phénol-chloroforme selon les instructions manuscrites. Resuspendez l’ARN propre dans 4,5 microlitres d’eau sans RNase.Pour quantifier le rendement de l’ARN, radiolabel l’ARN avec PNK et 32P étiquetés ATP selon les instructions manuscrites. Utilisez une échelle d’ADN de faible portée et un oligo synthétique nucléotide de 20 à 40 pour les normes de taille et de quantité. Résoudre l’ARN étiqueté sur un gel 26%urée-polyacrylamide.Séchez le gel selon les instructions manuscrites et exposez le gel à un écran de phospho jusqu’à ce qu’un signal adéquat soit détecté. Cette technique a été utilisée pour étudier les interactions du complexe de jonction d’exon ou EJC. L’analyse occidentale des taches de protéines purifiées à chaque étape majeure de la procédure RIPiT montre que l’EJC purifié contient à la fois eIF4A3 et MAGOH.Le contrôle négatif, HNRNPA1, n’est pas détecté dans l’élitution. La force du signal d’empreinte arn est corrélée avec la quantité d’interaction entre les protéines ARN. Une empreinte plus forte est observée lorsque ripit a été effectuée sur les cellules traitées avec de la puromycine, ce qui augmente l’occupation de l’EJC sur l’ARN.Pour s’assurer que le RIPiT a été efficace, il est important de tester l’efficacité de la propriété intellectuelle par tache occidentale. Il est également important d’évaluer la quantité et la qualité de l’ARN avant de procéder à un séquençage profond. En 2018, le laboratoire Singh a utilisé avec succès cette technique pour purifier deux variations distinctes sur le plan de la composition du complexe de jonction d’exon et identifier les modèles de liaison arn.Si les chercheurs choisissent de détecter les empreintes de l’ARN par autoradiographie, toutes les procédures et protocoles appropriés de radioprotecteur devraient être suivis.

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