Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

L’objectif global de ce modèle préclinique humain in vitro d’ostéoclastogenèse dérivé de monocytes de sang périphérique, ou PBMC, cultivés avec des lignées cellulaires de cancer du sein est d’imiter les interactions des ostéoclastes des cellules cancéreuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases osseuses sur les effets de l’interaction des cellules cancéreuses et des cellules osseuses dans le microenvironnement osseux. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un modèle préclinique entièrement humain.

En outre, cette méthode peut donner un aperçu des métastases osseuses. Il peut également être appliqué à l’étude d’autres mécanismes pathologiques liés aux os, tels que l’ostéoporose. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la variabilité entre les donneurs sains et de la sélection de la densité cellulaire appropriée de PBMC.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car ils ont besoin de voir notre sélection PBMC et les étapes d’ensemencement nécessitent une certaine expérience manuelle avant de pouvoir atteindre la compétence. Commencez par diluer au moins 20 millilitres de sang total de donneur sain dans de l’EDTA dans un rapport de un pour un dans le PBS. Après avoir bien mélangé, divisez la solution sanguine en aliquotes de 30 millilitres dans des tubes coniques de 50 millilitres.

Sous-couche soigneusement 15 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes dans le fond de chaque tube. Séparez les cellules par centrifugation par gradient de densité. Et tirez la cellule mononucléaire blanche contenant des couches leucocytaires dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Lavez les cellules récoltées deux fois dans 20 millilitres de PBS par lavage, suivi d’une lyse des globules rouges avec cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant trois à cinq minutes, sur de la glace. Arrêtez la réaction avec 20 millilitres de PBS et collectez les globules blancs par centrifugation. Remettez la pastille en suspension et complétez alpha M-E-M pour le comptage.

Ensuite, plaquez les cellules à sept virgule cinq fois 10 à la concentration de cinq PBMC par centimètre carré dans chaque puits d’une plaque à 24 puits pour leur incubation à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2. Après environ trois heures, retirez le surnageant, les débris, les cellules non attachées et les érythrocytes non lysés des cultures. Et ajoutez du milieu frais, complété par MCSF.

Quatorze jours après l’ensemencement, lavez les cellules deux fois avec du PBS et fixez-les dans du paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 20 minutes à température ambiante. Effectuez la coloration du siphon selon les instructions du fabricant. Les cellules de type ostéoclaste seront positives à TRAP avec au moins quatre noyaux.

Comptez les cellules de type ostéoclaste manuellement au microscope à un grossissement de 10X. Pour la différenciation des ostéoclastes induite par les cellules cancéreuses, lorsque les cellules cancéreuses atteignent quatre-vingt-dix pour cent de confluence, elles sont détachées par trypsinisation et ensemencées sur des inserts de pores de quatre micromètres à quatre fois 10 à la concentration de trois cellules par centimètre carré dans l’alpha MEM frais. Le lendemain, placez les inserts ensemencés sur des cultures de cellules mononucléées indifférenciées en plaques d’un jour dans l’alpha M-E-M complet, et changez le milieu tous les deux à trois jours.

Ensuite, 11 jours après le début de la co-culture, transférez les inserts dans une nouvelle plaque contenant le réactif approprié pour l’analyse en aval souhaitée. Les cellules cancéreuses du sein peuvent soutenir l’ostéoclastogenèse, car le nombre d’ostéoclastes dans les puits induits par les cellules cancéreuses est similaire à celui obtenu dans les puits de contrôle du facteur de croissance positif. Le nombre d’ostéoclastes observés dans toutes les cultures est cependant réduit lorsque les cellules sont traitées avec un médicament antitumoral.

Il est intéressant de noter que les surfaces des ostéoclastes matures dérivées de facteurs de croissance sont plus grandes que celles induites par les cellules cancéreuses. Cet effet n’est pas observé dans les cultures traitées avec des médicaments antitumoraux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en sept huit heures si elle est exécutée correctement.

À la suite de cette procédure, une analyse supplémentaire en aval peut être effectuée sous forme d’analyse d’expression génique, de Western Blot, d’analyse d’immunofluorescence ou d’ELISA pour répondre à des questions supplémentaires sur les interactions cancéreux-cellules/os-cellules ou sur les mécanismes médicamenteux antitumoraux. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des métastases osseuses pour étudier le microenvironnement osseux, dans un modèle préclinique entièrement humain. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de co-cultiver des monocytes, de subir une différenciation avec des cellules cancéreuses.

N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques et des médicaments peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.