Name: Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de culture d'ostéoclastes géants à partir de moelle osseuse de souris pour étudier le rôle de mTORC1 dans la différenciation cellulaire. Ce protocole efficace génère un grand nombre d'ostéoclastes en une semaine seulement.

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Les auteurs remercient Dr Minghan Tong et S. Kato pour souris et réactifs fournissant gracieusement. Nous remercions les membres du laboratoire Zou pour des discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de 973 de programme du ministère chinois de la Science et la technologie (MOST) [2014CB964704 et 2015CB964503], programme de recherche clinique du Hospital 9e populaire, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Merci pour l’aide du laboratoire central de biologie cellulaire et Core Facility for Chemical Biology, no CAS Centre d’Excellence en cellule moléculaire Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Académie chinoise des Sciences.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été réalisés conformément au protocole approuvé par la Commission Administrative de Stanford sur Laboratory Animal Care (APLAC) et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation de la Shanghai Institut de biochimie et de la cellule et animalier Biologie.
1. préparation
<ol><li>Générer des souris de suppression des Raptor spécifiques ostéoclastes (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, au-delà RapCtsk) en s’accouplant souris Raptorfl/fl Ctsk-cre des souris. Utilisez les souris Raptorfl/fl sous le contrôle du poids dans cette étude.</li>
	<li>Avoir un récipient rempli de glace pour garder des os isolés.</li>
	<li>
Préparer le milieu de culture.
	<ol>
<li>Préparez milieu de culture de α-MEM en complétant le minimum indispensable moyen alpha (α-MEM) avec 1 x glutamine, pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal.</li>
		<li>Préparer la moelle osseuse macrophage induction milieu composé de 50 mL de milieu de α-MEM et de M-CSF à 20 ng/mL.</li>
		<li>Préparer le milieu d’induction ostéoclastes composée de M-CSF et RANKL à 20 ng/mL, respectivement, dans 50 mL de milieu de α-MEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparez les tampons suivants avant la coloration du piège.
	<ol>
<li>Préparer la solution de correction composée de 6,5 mL d’acétone, 2,5 mL de solution de citrate et 0,8 mL de solution de formaldéhyde (vol/vol) de 37 %.</li>
		<li>Préparer le piège solution de coloration.<ol>
<li>Préchauffer l’eau déionisée à 37 ° C.</li>
			<li>Ajouter 100 µL de solution de base rapide grenat GBC et 100 µL de solution de nitrite de sodium dans un microtube de 1,5 mL et mélanger doucement par retournements d’autorisation s. 30 le mélange reposer pendant 2 min.</li>
			<li>Réchauffer au préalable les 9 mL d’eau désionisée à 37 ° C. Ajouter 200 µL de solution de base de GBC diazoté rapide grenat de l’étape 1.4.2.2, 100 µL de solution de phosphate naphthol AS-BI, 400 µL de solution d’acétate et 200 µL de solution de tartrate.</li>
			<li>Garder le piège de la coloration de la solution de mélange dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer le tampon suivant avant la quantification de l’activité du piège du milieu de culture.
	<ol>
<li>Préparer le tampon de tartrate (50 mL) : 2 mL d’acide L-tartrique 0,33 M, 48 mL de 0,33 M de tartrate de sodium dibasique déshydrater. Ajuster le pH à 4,9.</li>
		<li>Préparer un tampon 4-nitrophényl phosphate disodique (pNPP) (200 mL) : 1,502 g de glycine, 41 mg de MgCl2, 27,2 mg ZnCl2et 180 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH à 10.4 avec 3 M NaOH et le volume à 200 mL d’eau désionisée.</li>
		<li>Préparer les pNPP du tampon de substrat de phosphatase (pour une plaque de 96 puits) : 49,37 mg de substrat de phosphatase et 175 µL de tampon de pNPP d’étape 1.5.2.</li>
		<li>Préparer le tampon de substrat (9 plaque à 96 puits/mL) : 6,24 mL d’eau désionisée, 360 μL de solution d’acétate et 2,4 mL de tampon de tartrate. La composition de vortex et préchauffer à 37 ° C avant utilisation.</li>
		<li>Ajouter 90 μL de tampon de pNPP avec phosphatase substrate(1.5.3) dans 9ml de substrat préchauffé buffer(1.5.4) pour faire un mélange de substrat et vortexer pendant 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissection (jour -1)
<ol><li>Euthanasier 3 souris WT et RapCtsk femelles d’un mois par le CO2 séparément. Effectuer de CO2 par inhalation avec un équipement approprié par personnel qualifié.</li>
	<li>Immerger 6 souris dans un bécher de 100 ml d’éthanol à 75 % (vol/vol) pendant 5 min prévenir la contamination bactérienne et puis placer sur une planche de dissection dans une position couchée. Faire une incision à la distale du tibia verticalement et disséquer la peau le long de la patte avec des ciseaux ophtalmique.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation de la hanche avec des ciseaux et disloquer les membres postérieurs du tronc.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissocier soigneusement le tibia et le fémur de l’articulation du genou. Retirez doucement les tissus mous avec des ciseaux.</li>
	<li>Placer tous les os d’un génotype dans des souris dans chaque puits d’une plaque de six puits avec 2 mL de α-MEM sur la glace. Remarque : Afin de préserver la viabilité des cellules, l’OS doivent être conservé dans ces conditions pendant moins de 1 h.</li>
</ol>3. isolation (jour -1)
<ol><li>Remplissez-le d’un puits d’une plaque de six puits avec 75 % d’éthanol (3 mL) et les 5 autres puits moyen α-MEM (3 mL).</li>
	<li>Mettez tous les os d’un génotype dans le lavage de l’éthanol pour 15 s et laver les OS 5 fois avec milieu de α-MEM 10 s chaque fois.</li>
	<li>Couper les épiphyses avec le ciseaux et insérer une aiguille de seringue de 0,45 mm dans la cavité et flush moelle osseuse dehors avec moyen de α-MEM dans un tube à centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Rincer la cavité osseuse à l’aide de la méthode même de l’autre extrémité de l’OS. Répétez l’opération au moins deux fois pour laver la cavité de l’OS jusqu'à ce que l’os sont pâle.</li>
	<li>Centrifuger la moelle osseuse pour obtenir un culot cellulaire à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de tampon de lyse des globules rouges dans le tube à centrifuger et pipette doucement pour remettre en suspension de la moelle osseuse. Maintenir le tube à centrifuger sur glace pendant 8 min à lyser les globules rouges.</li>
	<li>Ajouter 6 mL de milieu de α-MEM dans le tube à centrifuger pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifuger à 500 x g et 4 ° C pendant 10 min et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 3 mL de milieu de culture de α-MEM et placer les cellules dans une plaque de six puits (généralement une souris / puits).</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % du jour au lendemain.</li>
</ol>4. électrodéposition (jour 0)
<ol><li>Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger 15 mL pour recueillir les cellules seules le lendemain matin.</li>
	<li>Centrifuger à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 4 mL de milieu de culture de α-MEM.</li>
	<li>Prenez 20 µL de la solution de la cellule et mélanger avec 20 µL du bleu Trypan. Ajouter 10 µL du mélange dans la chambre de comptage et d’obtenir le nombre de cellules par mL de solution.</li>
	<li>Ajouter un volume approprié de milieu de culture de α-MEM pour obtenir une solution portable de 500 000 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 500 µL et 50 µL de milieu d’induction de la moelle osseuse macrophage dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Ajouter 500 µL et 50 µL de solution de cellule dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 3 jours.</li>
</ol>5. différenciation (3-7 jours)
<ol><li>Trois jours après l’ensemencement, recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits et congeler à-20 ° C et puis aspirer le milieu résiduel.</li>
	<li>Ajouter 1 mL et 100 µL de milieu d’ostéoclastes induction dans chaque puits d’une plaque 24 puits et une plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 2 jours.</li>
	<li>Collecter 50 µL de milieu de chaque puits et aspirer le milieu résiduel.</li>
	<li>Ajouter milieu inducteur ostéoclastes dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 1 nuit. Remarque : À ce moment, gros, multinucléées ostéoclastes devraient être considérés sous un microscope inversé (Figure 2 a).</li>
	<li>Si les ostéoclastes ne sont pas visibles, changer le milieu inducteur ostéoclastes et observer tous les jours jusqu'à ce que les ostéoclastes sont visibles.</li>
	<li>Recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits après que les ostéoclastes ont formé.</li>
</ol>6. tartrate Resistant Acid Phosphatase (TRAP) coloration
Remarque : Les ostéoclastes matures peuvent être présents après 6-7 jours de la culture in vitro (étape 4).
<ol><li>Aspirer les moyen et laver doucement 3 fois avec 1 x PBS.</li>
	<li>Fixer les cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 µL de solution de 30 s à température ambiante.</li>
	<li>Après fixation, aspirer la solution fix et laver doucement 3 fois avec de l’eau désionisée préchauffé à 37 ° C. Aspirer l’eau déionisée.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tache de piège dans chaque puits de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min et bouclier de lumière.</li>
	<li>Après coloration, aspirer la tache de piège et laver délicatement 3 fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Ostéoclastes d’image à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40 X.</li>
</ol>7. piège Quantification de l’activité du milieu de Culture
<ol><li>Récupérer le surnageant de culture 30 µL de chaque puits de la plaque à 96 puits de l’étape 5.1, 5.4 et 5.8 ; Utilisez 30 µL de milieu d’induction ostéoclastes non fermentés comme contrôle négatif. Placer les échantillons dans une nouvelle plaque de 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 90 μl de substrat mixture(1.5.5) dans chaque puits de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h et bouclier de lumière.</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 3 M NaOH dans chaque puits de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Mesurer theabsorbance à la longueur d’onde de 405 nm.</li>
</ol>8. Western Blot
Remarque : Après 6-7 jours de culture in vitro la plaque 24 puits, les ostéoclastes matures doivent être visibles.
<ol><li>Aspirez le milieu.</li>
	<li>Laver doucement avec un refroidissement préalable 1 x PBS 3 fois.</li>
	<li>Aspirer le PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de 1 x SDS lyse tampon contenant inhibiteur de protéase cocktail.</li>
	<li>Lysats de chaleur à 105 ° C pendant 10 min et centrifuger à 12 000 × g et 4 ° C pendant 10 min. recueillent le surnageant contenant des protéines.</li>
	<li>Séparez les lysats contenant 30 µg de protéines en 10 % SDS-PAGE11 et puis transférer sur une membrane de Polyfluorure de vinylidène (PVDF).</li>
	<li>Bloquer les membranes avec 5 % de lait pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber les membranes avec anti-Raptor, anti-P-S6, S6-anti, anti-β-actine à la dilution de 1 : 1 000 à 5 % de lait à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Lavage des membranes avec Tris Buffered Saline avec Tween-20 (TBST) pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Répétez l’étape 8,9 deux fois.</li>
	<li>Incuber les membranes avec la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués d’anticorps IgG anti-souris ou lapin 1:5,000 dilution à 5 % de lait pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les membranes 3 fois avec un mélange TBST pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Pour la détection par chimiluminescence, ajouter Ouest substrat HRP chimiluminescent sur les membranes et incuber pendant 5 min à température ambiante. Égoutter l’excès substrat et exposer les taches à la radiographie.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li>
<li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li>
<li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li>
<li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+TORCs+and+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+%28Raptor%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+%28mTORC1%29+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056(2014).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast?</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li>
<li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li>
</ol>

Tous les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

L’essai d’osteoclastogenic est la méthode la plus largement utilisée d’isoler et de culture d’ostéoclastes in vitro12,,13. Alors que plusieurs cérémonies d’installation des ostéoclastes axée sur le RANKL ont été décrits13,14,15, la présente étude décrit un protocole avec quelques modifications basées sur les méthodes précédentes.
Dans...

OS est un organe en constante évolution et est remodelée par les ostéoblastes et les ostéoclastes tout au long de la vie. Les ostéoclastes sont responsables de la résorption de la matrice minéralisée et ostéoblastes synthétisent et sécrètent des nouveaux OS matrices1. L’équilibre entre la résorption et formation osseuse est cruciale pour la santé osseuse, y compris l’entretien des os masse et réponse à la stimulation et de blessures. Si cet équilibre est rompu, une série de maladies métaboliques des os peut se produire, y compris l’ostéoporose et les maladies parodontales. Dans ces maladies, la perte de masse osseuse résultant de la résorption osseuse ostéoclastique dépasse les os formant la capacité des ostéoblastes2,3. Ainsi, afin d’élaborer des cibles pharmaceutiques pour traiter des troubles squelettiques telles que l’ostéoporose, il est essentiel de comprendre la génération et la biologie des ostéoclastes4.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées géants uniques situés à ou près de la surface osseuse et appartiennent à la famille de monocytes/macrophages1. Ibbotson K. J. et al. a signalé une méthode pour générer des cellules semblables à des ostéoclastes in vitro avec un milieu contenant 1, 25-dihydroxy-vitamine D35. L’identification du facteur stimulant de macrophage-colony (M-CSF) et activateur du récepteur pour le ligand de facteur nucléaire-κ B (RANKL) comme facteurs essentiels de la formation des ostéoclastes a considérablement accru l’efficacité des osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. la capacité de la culture les ostéoclastes in vitro a amélioré notre compréhension de la génération et la réglementation des ostéoclastes.
La cible mammifère/mécaniste de la rapamycine (mTOR) fonctions dans deux complexes structurellement et fonctionnellement distinctes, à savoir mTORC1 et mTORC28,9. Les deux complexes de protéines multiples sont distincts les uns des autres en raison de leurs différents composants et des substrats en aval. mTORC1 contient la protéine associée à la réglementation unique de mTOR (rapace), tandis que mTORC2 contient la rapamycine insensible compagnon de mTOR (Rictor)9. mTORC1 peut intégrer et transmettre des signaux importants pour réguler la croissance cellulaire, la prolifération et la différenciation. Récemment, nous avons démontré que mTORC1 joue un rôle clé dans le réseau de la résorption osseuse catabolique par suppression du Raptor pour inactiver les mTORC1 dans les ostéoclastes10. Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, une méthode axée sur le RANKL osteoclastogenic a été utilisée pour générer des ostéoclastes de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs) de type sauvage (WT) et de la souris Ctsk de Rap et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur les ostéoclastes formation.

<table><tbody><tr><td>souris Raptorfl/fl</td><td>The Jackson Laboratory 013188</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre</td><td></td><td></td><td>un cadeau de S. Kato, Université de Tokyo, Tokyo, Japon</td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Protéine M-CSF de souris recombinante</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Protéine RANKL de souris recombinante</td><td>R& D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de phosphatase acide leucocytaire (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Grenat rapide GBC Solution de base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Solution de nitrite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Solution de phosphate de naphtol AS-BI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td>Solution d’acétate</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Solution de tartrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-tartrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate de sodium dibasique déshydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat de phosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>protéine anti-P ribosomique S6 (S235/236)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>protéine anti-ribosomique S6</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&bêta ;-actine</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37 % formaldéhyde</td><td>Xilong membrane scientifique en</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyfluorure de vinylidène (PVDF)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescent HRP (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td></td><td></td><td></td>de 0,45 mm</tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td> à moustiques</tr></tbody></table>

une base rankl osteoclast culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mtorc1 dans la formation des ostéoclastes

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Les ostéoclastes sont unique-résorption osseuse des cellules qui se différencient de la lignée des monocytes/macrophages de la moelle osseuse. Une série de maladies métaboliques des os, dont l’ostéoporose peut entraîner un dysfonctionnement des ostéoclastes. Pour développer des cibles pharmaceutiques pour la prévention de la perte de masse osseuse pathologique, faut comprendre les mécanismes par lesquels les ostéoclastes différencient des précurseurs. La capacité d’isoler et de la culture d’un grand nombre d’ostéoclastes in vitro est cruciale afin de déterminer le rôle des gènes spécifiques dans la différenciation des ostéoclastes. Inactivation de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 (TORC1) dans les ostéoclastes peut diminuer le nombre d’ostéoclastes et augmenter la masse osseuse ; Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, on décrit un protocole RANKL d’isoler et de culture d’ostéoclastes de moelle osseuse de souris et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur la formation des ostéoclastes. Ce protocole a permis avec succès dans un grand nombre des ostéoclastes géants, en général sous huitaine. Suppression du Raptor avec facultés affaiblies de la formation des ostéoclastes et diminue l’activité de sécrétion phosphatases acides tartrate-résistantes, qui indique que mTORC1 est essentielle pour la formation des ostéoclastes.

En utilisant le présent protocole, un grand nombre des ostéoclastes géants ont été vus le jour 6 ; Si des ostéoclastes géants ne sont pas vus, un jour de plus de différenciation ostéoclastique peut être nécessaire (Figure 1). Formation des ostéoclastes réussie a été confirmée par piège coloration (Figure 2 a). Les ostéoclastes étaient des cellules géantes de rouge/pourpre vins avec plus de 3 noyaux. Plus de 250 ostéoclastes ont é...

Ce manuscrit décrit un protocole d’isolat et la culture les ostéoclastes in vitro de la moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 dans la formation des ostéoclastes.

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

L’objectif général de ce protocole est d’isoler et de cultiver des ostéoclastes in vitro à partir de moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère du complexe de rapamycine un dans la formation des ostéoclastes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la formation des ostéoclastes, telles que le rôle de mTORC1 dans la différenciation des ostéoclastes. Le principal avantage de cette technique est d’aboutir à un grand nombre d’ostéoclastes géants en une semaine.Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’ostéoporose, car il est utile d’étudier le mécanisme par lequel les ostéoclastes se différencient de leurs précurseurs. Pour commencer cette procédure, faites une incision verticale à l’extrémité distale du tibia d’une souris euthanasiée et disséquez la peau le long des membres postérieurs. Ensuite, coupez le ligament articulaire des articulations de la hanche avec des ciseaux et disloquez les membres postérieurs du tronc.Coupez le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissociez soigneusement le tibia et le fémur de celui-ci. Retirez délicatement les tissus mous à l’aide de ciseaux. Placez tous les os d’une souris dans chaque puits d’une plaque à six puits avec deux millilitres d’alpha-MEM sur de la glace.Pour l’isolation, remplissez un puits d’une plaque de six puits avec de l’éthanol à 75 % et les cinq autres puits avec de l’alpha-MEM. Mettez tous les os d’une souris dans le lavage à l’éthanol pendant 15 secondes, puis lavez les os cinq fois avec de l’alpha-MEM pendant 10 secondes à chaque fois. Coupez les épiphyses avec les ciseaux et insérez une aiguille de seringue de 0,45 millimètre dans la cavité osseuse.Rincez la moelle avec de l’alpha-MEM dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ensuite, rincez la cavité osseuse en utilisant la même méthode à partir de l’autre extrémité de l’os. Répétez au moins deux fois pour bien laver la cavité osseuse jusqu’à ce que l’os soit pâle.Par la suite, centrifugez la moelle osseuse pour obtenir une pastille cellulaire à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant. Ajoutez trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges dans le tube de centrifugation et pipetez doucement pour remettre la moelle osseuse en suspension.Ensuite, gardez le tube de centrifugation sur de la glace pendant huit minutes pour lyser les globules rouges. Après huit minutes, ajoutez six millilitres d’alpha-MEM dans le tube de centrifugation pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifugez à 800 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et aspirez le surnageant.Ensuite, mettez-les en suspension dans trois millilitres de milieu de culture alpha-MEM et placez les cellules dans une plaque à six puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Dans cette étape, transférez le surnageant dans un tube à centrifuger de 15 millilitres pour collecter les cellules non attachées le lendemain matin.Ensuite, centrifugez à 800 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et aspirez le surnageant. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans quatre millilitres de milieu de culture alpha-MEM. Prenez 20 microlitres de solution cellulaire et mélangez avec 20 microlitres de Trypan Blue.Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange dans la chambre de comptage et obtenez le nombre de cellules par millilitre de solution. Ensuite, ajoutez un volume approprié de milieu de culture alpha-MEM pour obtenir une solution cellulaire de 500 000 cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 500 microlitres et 50 microlitres de milieu d’induction de macrophages de moelle osseuse dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et d’une plaque de 96 puits, respectivement.Ensuite, ajoutez 500 microlitres et 50 microlitres de solution cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Trois jours après le placage, prélevez 50 microlitres de fluide dans chaque puits de la plaque de 96 puits et congelez-le à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, aspirez le milieu résiduel. Ajoutez un millilitre et 100 microlitres de milieu d’induction ostéoclaste dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux jours.Après deux jours, prélevez 50 microlitres de milieu dans chaque puits et aspirez le milieu résiduel. Ensuite, ajoutez un milieu d’induction d’ostéoclaste dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une journée. Une fois les ostéoclastes formés, prélevez 50 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque de 96 puits.Dans cette étape, aspirez le milieu et lavez doucement l’échantillon trois fois avec 1X PBS. Ensuite, fixez les cellules dans chaque puits de la plaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution fixe pendant 30 secondes à température ambiante. Après la fixation, aspirez la solution fixe et lavez doucement les cellules trois fois avec de l’eau désionisée préchauffée à 37 degrés Celsius.Ensuite, aspirez l’eau déminéralisée et ajoutez 100 microlitres de colorant TRAP dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et mettez-la à l’abri de la lumière. Après la coloration, aspirez la tache TRAP et lavez-la doucement trois fois avec de l’eau déminéralisée.Par la suite, imagez les ostéoclastes au microscope inversé à un grossissement de 40X. Ensuite, transférez 30 microlitres du milieu collecté auparavant dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, ajoutez 90 microlitres de mélange de substrat dans chaque puits de la plaque à 96 puits.Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure et protégez-la de la lumière. Au bout d’une heure, arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres d’hydroxyde de sodium à trois molaires dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Ensuite, mesurez l’absorbance à la longueur d’onde de 405 nanomètres à l’aide du lecteur de plaques multi-étiquettes EnVision.Voici la vue représentative des ostéoclastes observés en fond clair le sixième jour. La ligne rouge délimitait le bord des ostéoclastes. Et on voit ici un ostéoclaste typiquement géant, multinucléé et positif à TRAP.La flèche noire indiquait deux noyaux de l’ostéoclaste multinucléé. Cette figure montre la coloration TRAP des BMM au sixième jour. Des images à fort grossissement des carrés dans les groupes de knockout de type sauvage et de Ctsk-Cre Raptor sont présentées, respectivement.Il s’agissait d’ostéoclastes moins géants, positifs à TRAP, formés dans les BMM knock-out Ctsk-Cre Raptor par rapport au groupe de type sauvage. Cette figure montre l’activité TRAP des BMM de culture de type sauvage et de Ctsk-Cre Raptor knock-out. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la viabilité des macrophages de la moelle osseuse, car la densité optimale d’ensemencement de macrophages viables de la moelle osseuse est essentielle. Il est recommandé de ne pas garder l’os sur de la glace plus d’une heure et de remettre les cellules en suspension doucement. Cette procédure peut être combinée avec d’autres méthodes, telles que le test de résorption de l’ostéoclaste avec des coupes d’os, pour étudier la physiologie normale et pathologique de l’ostéoclaste.Grâce à cette méthode, nous avons découvert que mTORC1 joue un rôle important dans la formation des ostéoclastes, qui pourrait servir de cible pharmacologique potentielle pour le traitement des troubles métaboliques osseux, tels que l’ostéoporose, à l’avenir.

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