Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

L’objectif général de ce protocole est d’isoler et de cultiver des ostéoclastes in vitro à partir de moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère du complexe de rapamycine un dans la formation des ostéoclastes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la formation des ostéoclastes, telles que le rôle de mTORC1 dans la différenciation des ostéoclastes. Le principal avantage de cette technique est d’aboutir à un grand nombre d’ostéoclastes géants en une semaine.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’ostéoporose, car il est utile d’étudier le mécanisme par lequel les ostéoclastes se différencient de leurs précurseurs. Pour commencer cette procédure, faites une incision verticale à l’extrémité distale du tibia d’une souris euthanasiée et disséquez la peau le long des membres postérieurs. Ensuite, coupez le ligament articulaire des articulations de la hanche avec des ciseaux et disloquez les membres postérieurs du tronc.

Coupez le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissociez soigneusement le tibia et le fémur de celui-ci. Retirez délicatement les tissus mous à l’aide de ciseaux. Placez tous les os d’une souris dans chaque puits d’une plaque à six puits avec deux millilitres d’alpha-MEM sur de la glace.

Pour l’isolation, remplissez un puits d’une plaque de six puits avec de l’éthanol à 75 % et les cinq autres puits avec de l’alpha-MEM. Mettez tous les os d’une souris dans le lavage à l’éthanol pendant 15 secondes, puis lavez les os cinq fois avec de l’alpha-MEM pendant 10 secondes à chaque fois. Coupez les épiphyses avec les ciseaux et insérez une aiguille de seringue de 0,45 millimètre dans la cavité osseuse.

Rincez la moelle avec de l’alpha-MEM dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ensuite, rincez la cavité osseuse en utilisant la même méthode à partir de l’autre extrémité de l’os. Répétez au moins deux fois pour bien laver la cavité osseuse jusqu’à ce que l’os soit pâle.

Par la suite, centrifugez la moelle osseuse pour obtenir une pastille cellulaire à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant. Ajoutez trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges dans le tube de centrifugation et pipetez doucement pour remettre la moelle osseuse en suspension.

Ensuite, gardez le tube de centrifugation sur de la glace pendant huit minutes pour lyser les globules rouges. Après huit minutes, ajoutez six millilitres d’alpha-MEM dans le tube de centrifugation pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifugez à 800 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et aspirez le surnageant.

Ensuite, mettez-les en suspension dans trois millilitres de milieu de culture alpha-MEM et placez les cellules dans une plaque à six puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Dans cette étape, transférez le surnageant dans un tube à centrifuger de 15 millilitres pour collecter les cellules non attachées le lendemain matin.

Ensuite, centrifugez à 800 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et aspirez le surnageant. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans quatre millilitres de milieu de culture alpha-MEM. Prenez 20 microlitres de solution cellulaire et mélangez avec 20 microlitres de Trypan Blue.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange dans la chambre de comptage et obtenez le nombre de cellules par millilitre de solution. Ensuite, ajoutez un volume approprié de milieu de culture alpha-MEM pour obtenir une solution cellulaire de 500 000 cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 500 microlitres et 50 microlitres de milieu d’induction de macrophages de moelle osseuse dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et d’une plaque de 96 puits, respectivement.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres et 50 microlitres de solution cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Trois jours après le placage, prélevez 50 microlitres de fluide dans chaque puits de la plaque de 96 puits et congelez-le à moins 20 degrés Celsius.

Ensuite, aspirez le milieu résiduel. Ajoutez un millilitre et 100 microlitres de milieu d’induction ostéoclaste dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux jours.

Après deux jours, prélevez 50 microlitres de milieu dans chaque puits et aspirez le milieu résiduel. Ensuite, ajoutez un milieu d’induction d’ostéoclaste dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une journée. Une fois les ostéoclastes formés, prélevez 50 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque de 96 puits.

Dans cette étape, aspirez le milieu et lavez doucement l’échantillon trois fois avec 1X PBS. Ensuite, fixez les cellules dans chaque puits de la plaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution fixe pendant 30 secondes à température ambiante. Après la fixation, aspirez la solution fixe et lavez doucement les cellules trois fois avec de l’eau désionisée préchauffée à 37 degrés Celsius.

Ensuite, aspirez l’eau déminéralisée et ajoutez 100 microlitres de colorant TRAP dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et mettez-la à l’abri de la lumière. Après la coloration, aspirez la tache TRAP et lavez-la doucement trois fois avec de l’eau déminéralisée.

Par la suite, imagez les ostéoclastes au microscope inversé à un grossissement de 40X. Ensuite, transférez 30 microlitres du milieu collecté auparavant dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, ajoutez 90 microlitres de mélange de substrat dans chaque puits de la plaque à 96 puits.

Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure et protégez-la de la lumière. Au bout d’une heure, arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres d’hydroxyde de sodium à trois molaires dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Ensuite, mesurez l’absorbance à la longueur d’onde de 405 nanomètres à l’aide du lecteur de plaques multi-étiquettes EnVision.

Voici la vue représentative des ostéoclastes observés en fond clair le sixième jour. La ligne rouge délimitait le bord des ostéoclastes. Et on voit ici un ostéoclaste typiquement géant, multinucléé et positif à TRAP.

La flèche noire indiquait deux noyaux de l’ostéoclaste multinucléé. Cette figure montre la coloration TRAP des BMM au sixième jour. Des images à fort grossissement des carrés dans les groupes de knockout de type sauvage et de Ctsk-Cre Raptor sont présentées, respectivement.

Il s’agissait d’ostéoclastes moins géants, positifs à TRAP, formés dans les BMM knock-out Ctsk-Cre Raptor par rapport au groupe de type sauvage. Cette figure montre l’activité TRAP des BMM de culture de type sauvage et de Ctsk-Cre Raptor knock-out. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la viabilité des macrophages de la moelle osseuse, car la densité optimale d’ensemencement de macrophages viables de la moelle osseuse est essentielle. Il est recommandé de ne pas garder l’os sur de la glace plus d’une heure et de remettre les cellules en suspension doucement. Cette procédure peut être combinée avec d’autres méthodes, telles que le test de résorption de l’ostéoclaste avec des coupes d’os, pour étudier la physiologie normale et pathologique de l’ostéoclaste.

Grâce à cette méthode, nous avons découvert que mTORC1 joue un rôle important dans la formation des ostéoclastes, qui pourrait servir de cible pharmacologique potentielle pour le traitement des troubles métaboliques osseux, tels que l’ostéoporose, à l’avenir.