Assay Métastases expérimentales

L’objectif général de l’expérience suivante est de tester les capacités métastatiques des cellules cancéreuses humaines par des injections dans les veines de la queue. Chez les souris immunodéficientes, les cellules sont préparées pour l’injection. Les cellules sont ensuite injectées à des souris immunodéficientes, qui généreront des métastases pulmonaires au bout d’un à deux mois.

Les souris sont disséquées et les métastases pulmonaires sont quantifiées et mises en culture. Les résultats de ce type de test indiquent l’étendue des métastases d’un type particulier de cellule cancéreuse. Bonjour, je suis Sonali Mohanty du laboratoire du Dr LE au département de génétique biomédicale de l’Université de Rochester.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour effectuer un test expérimental des métastases. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les métastases cancéreuses. Alors commençons.

Commencez avec des cellules cultivées à environ 70 % de fluidité Co, aspirez le milieu de la plaque et lavez-les doucement une fois avec un XPBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de 0,05 % de trypsine inversée. Basculez doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules.

Observez les cellules au microscope pendant qu’elles se détachent. Ajoutez un volume suffisant de supports contenant FBS pour éteindre les déclenchements en activité. Transférez ensuite dans un tube de 50 millilitres.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois la concentration déterminée, centrifugez à environ 200 fois la gravité pendant trois minutes sans perturber la pastille cellulaire. Retirez avec précaution le support en suspendant un volume approprié de solution tampon d’équilibre de Hank ou HBSS pour atteindre une concentration finale d’environ cinq fois 10 à six cellules par millilitre.

Ensuite, filtrez à travers la crépine à cellules de 70 micromètres d’un Falcon. Pour exclure les agrégats à grandes cellules, placez l’extrémité de la pipette directement sur le filtre, placé sur un tube de culture de cinq millilitres. Éjectez rapidement la suspension à travers le filtre dans le tube.

Comptez à nouveau les cellules à l’aide du bleu trian pour déterminer la viabilité. La viabilité doit être supérieure à 90 % avant l’injection. Ensuite, diluez à une concentration finale de 2,5 fois 10 à six cellules par millilitre.

Restez sur la glace. Saisissez doucement la queue d’une souris immunodéficiente et tirez-la dans la contention de la souris avec le dos contre la fente et sa queue dépassant de la petite ouverture dans le dos. Faites glisser lentement l’anneau vers l’intérieur le long de la fente.

Une fois que l’anneau attrape la bouche de la souris, verrouillez-le en place. La souris ne doit pas pouvoir se déplacer librement, mais doit avoir un rythme respiratoire normal. Trouvez les principales veines de la queue.

Quatre vaisseaux sanguins principaux sont présents dans la queue d’une souris. Les artères sont situées sur les côtés dorsal et ventral de la queue. Les veines sont situées sur les côtés latéraux.

Prélevez au moins 200 microlitres de cellules préparées dans une seringue d’un millilitre. Fixez une demi-aiguille de calibre 30 et expulsez les bulles d’air. Le volume final dans la seringue doit être de 200 microlitres.

Préparez-vous à injecter dans l’extrémité distale de la queue. Donc, si le premier essai échoue, une région plus proximale de la queue pourrait être utilisée pour un deuxième essai. Après avoir essuyé le site d’injection avec de l’éthanol à 70 %, tirez la queue vers le haut.

Tenez l’embout avec le pouce et soutenez le point d’injection avec l’index. Insérez l’aiguille dans la veine et injectez les cellules. Assurez-vous que l’aiguille et la seringue sont parallèles à la veine pendant l’injection.

Sinon, l’aiguille traversera la paroi du vaisseau et des cellules seront injectées dans les tissus adjacents de la queue. Retirez l’aiguille si la procédure s’est déroulée avec succès. Le sang doit s’écouler du site d’injection.

Appuyez sur une boule de coton propre pour faciliter l’utilisation de la soie dentaire et palpez la queue vers le haut pour pousser tout échantillon résiduel en circulation. Relâchez la souris de la contention et remettez-la dans la cage. Notez le nombre d’essais d’injection et le nombre de cellules injectées dans un cahier de laboratoire.

Déterminer la viabilité des cellules après l’injection. Comme précédemment, cette étape permet de s’assurer que les cellules restent en vie tout au long du processus d’injection. À la fin d’une expérience d’injection, la viabilité des cellules diminuera, mais devrait rester supérieure à 80 %En option, faites tourner les cellules restantes et rincez les granulés avec du PBS une fois.

Congelez ensuite les granulés à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures telles que le western blot. Après un à deux mois, disséquez les souris pour déterminer l’emplacement des métastases. Commencez par placer la souris euthanasiée sur une station de dissection.

Vaporisez généreusement la souris avec de l’éthanol. Ouvrez la cage thoracique pour exposer les poumons et le cœur. Ensuite, excisez-les soigneusement et placez-les dans PBS.

Le poumon est le principal site de métastases puisqu’il contient le premier lit capillaire que les cellules rencontrent. Une fois qu’ils sont entrés dans la circulation, retirez le cœur et rincez les poumons dans du PBS, puis observez chaque lobe du poumon sous un microscope à dissection. Comptez le nombre de métastases détectables des deux côtés du poumon, puis le nombre de métastases pulmonaires sur les quatre lobes ensemble pour déterminer le nombre total de métastases pulmonaires.

Ensuite, isolez les métastases pulmonaires individuelles par excision à l’aide de ciseaux. Transférez chaque métastase dans une passoire cellulaire de 70 micromètres et hachez-la à l’aide de l’extrémité d’un capuchon d’aiguille stérile. Rincez la crépine à cellules avec plusieurs millilitres de fluide et récupérez les cellules qui passent à travers le filtre.

Dans une boîte de culture, chaque boîte contient les cellules d’une métastase. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre jours sans être dérangé. Initialement, les cellules cancéreuses et les cellules fibroblastiques se développeront sur les plaques, mais progressivement les cellules fibroblastes mourront et seront remplacées par des cellules cancéreuses.

Si les cellules cancéreuses portent des gènes résistants aux médicaments, sélectionnez les cellules avec les antibiotiques correspondants Après trois jours, lavez tous les débris de sang ou de tissus, les débris sur la boîte avec PBS et ajoutez un milieu frais. Évaluez la pureté des cellules dérivées par immuno-coloration avec des anticorps contre des protéines spécifiques humaines ici, et l’anticorps anti-menting humain est utilisé même en l’absence de sélection de médicament. Plus de 99 % des cellules devraient être humaines.

Les cellules nouvellement dérivées peuvent maintenant être injectées à nouveau dans des souris immunodéficientes pour tester leurs capacités métastatiques à la fin de ce test. Une lignée cellulaire cancéreuse hautement métastatique donne généralement lieu à de nombreuses métastases pulmonaires, tandis que très peu de métastases pulmonaires proviendront d’une lignée cellulaire cancéreuse faiblement métastatique. Ces images montrent des métastases pulmonaires deux mois après l’injection de la lignée cellulaire de mélanome humain.

A 3 7 5 sm. Les cellules dérivées à l’aide de cette méthode donnent généralement lieu à plus de métastases que la lignée parentale lorsqu’elles sont testées. Encore une fois en utilisant ce test, nous venons de vous montrer la procédure pour effectuer un test expérimental de métastases.

Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler de s’assurer que les cellules sont injectées dans la veine de la queue, mais pas dans le tissu de la queue. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.