Name: Assay Métastases expérimentales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Apprenez un essai de métastases expérimentales pour évaluer le potentiel métastatique des lignées cellulaires cancéreuses humaines par injection dans la veine de la queue chez des souris immunodéficientes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce protocole a été testé et optimisé initialement dans le laboratoire du Dr Richard Hynes (MIT). Le financement est assuré par le prix IDEA NYSTEM (à LX) et Ruth L. Kirschstein Prix national Research Service (à LX).

1. Préparation des échantillons <ol><li> Cultiver des cellules confluentes à ~ 70% dans leurs médias spécifiques avec des facteurs de croissance ou de FBS (par exemple, DMEM avec du FBS à 10% pour le MC-1 cellules). Aspirer des médias de la plaque et laver délicatement à plusieurs reprises avec 1 x PBS (8 g / L de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Aspirer PBS et ajouter 2 mL de trypsine à 0,05% en versène (0,014 g / L de rouge de phénol et 0,2 g / L d'EDTA-Na dans 1 x PBS, pH 7,2). Secouez doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules de la plaque. Observez les cellules sous un microscope. Il prend généralement 2-5 minutes pour les cellules à se détacher. </li><li> Ajouter un volume suffisant de médias contenant FBS (ou inhibiteur de la trypsine de soja) pour étancher l'activité de la trypsine et de recueillir les cellules dans un tube de 50 ml faucon. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire sur un hématimètre propre. Le nombre de cellules par mL est égal à la moyenne # des cellules dans chacune des cinq carrés multipliée par 10 4. </li><li> Centrifuger les cellules à 1000 RPM (ou ~ 200 xg) dans une centrifugeuse de paillasse pendant 3 minutes. </li><li> Retirez délicatement les médias, sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans un volume approprié de solution tampon Hanks Balanced (HBSS) pour atteindre une concentration finale de ~ 5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Filtrer à travers les cellules d'un Falcon 70 tamis cellulaire um d'exclure des agrégats à grandes cellules. Placez l'extrémité de la pipette directement sur le filtre sur un tube étiqueté culture 5mL Falcon. Vite éjecter la suspension à travers le filtre dans le tube de culture. </li><li> Compter les cellules de nouveau en utilisant un hématimètre et les diluer à une concentration finale de 2,5 x 10 6 / mL. Gardez les cellules sur la glace. </li><li> Déterminer la viabilité des cellules. Mélanger quelques cellules au bleu trypan et de mesurer le pourcentage de morts (en bleu) des cellules sur les cellules total en utilisant un hématimètre. La viabilité des cellules doit être ≥ 90% avant l'injection. </li></ol> 2. Injection par voie intraveineuse <ol><li> Changer de gants. Doucement attraper la queue d'une souris immunodéficientes (nude, NOD-SCID, ou GFN, Laboratoire Jackson) et tirez dans le dispositif de retenue de la souris, avec son dos contre la fente et sa queue qui sortait de la petite ouverture dans le dos de la de contention . </li><li> Faites glisser lentement vers l'intérieur de l'anneau le long de la fente et le verrouiller en place une fois l'anneau des prises de l'embouchure de la souris. La souris ne doit pas être en mesure de se déplacer librement, mais doivent avoir le taux normal de la respiration. </li><li> Trouvez les veines de la queue majeur. Quatre vaisseaux sanguins principaux sont présents dans une queue de souris. Les vaisseaux sanguins sur les côtés dorsale et ventrale de la queue sont les artères. Les veines sont sur les côtés latéraux de la queue. </li><li> Attirer plus de 200 ul de cellules préparées dans une seringue 1ml. Fixez l'aiguille 30 G 1 / 2 pouce et pousser les bulles d'air qui peuvent exister. Le volume final de cellules dans la seringue doit être 200 uL (soit 5 x 10 5 cellules au total). </li><li> Injecter des cellules dans la veine de la queue. <ol class="lalpha"><li> Démarrer à partir de l'extrémité distale de la queue, donc si le premier essai échoue, une région plus proximale de la queue pourrait être utilisé pour un deuxième essai. </li><li> Essuyez la queue avec 70% d'éthanol. Tirez sur la queue droite. Maintenez la pointe de la queue avec le pouce et l'appui du point d'injection avec l'index. </li><li> Insérez l'aiguille de la veine et injecter les cellules. Assurez-vous que l'aiguille et la seringue sont parallèles à la veine lors de l'injection, sinon l'aiguille se pointer à travers la paroi du vaisseau et d'injecter les cellules dans les tissus adjacents queue. </li><li> Retirez l'aiguille après l'injection. Le sang doit abondante à partir du site d'injection si l'injection est allé avec succès. Appuyez sur un morceau propre de serviette en papier ou un coton tige sur le site d'injection pour faciliter la coagulation, et palper la queue vers le haut pour pousser tout échantillon résiduel dans la veine en circulation. </li><li> Relâchez la souris à partir du dispositif de retenue et de le retourner à la cage. Enregistrez le processus d'injection (par exemple, combien d'essais il a fallu à injecter les cellules et combien cellules ont été injectées) dans un cahier de laboratoire. </li><li> Déterminer la viabilité des cellules après l'injection, comme décrit dans la Section de préparation des échantillons, étape 9. Cette étape permet de rassurer que les cellules rester en vie tout au long du processus d'injection. A la fin d'une expérience d'injection, la viabilité des cellules vont diminuer, mais devrait être supérieure à 80%. </li><li> (Optionnel) Isoler les cellules et rincer les restes les boulettes avec du PBS fois. Congelez les boulettes à -80 oC pour les analyses futures (par exemple, Western blot pour confirmer l'expression des gènes ou des passes rabattues). </li></ol></li><li> Généralement, après un ou deux mois, les souris seront disséqués et les emplacements des métastases sont grossièrement déterminée. Du poumon est le site principal de métastases, car il contient le premier lit capillaire que les cellules après leur rencontrepénétrer dans la circulation. </li><li> Après rinçage avec du PBS, chaque lobe du poumon (ou d'autres tissus contenant des métastases) est observé sous un microscope à dissection (figure 1). Le nombre de métastases décelables sur les deux côtés du poumon est compté et le nombre de métastases pulmonaires sur l'ensemble des quatre lobes sont ajoutées comme le nombre total de métastases pulmonaires. 1 métastases pulmonaires sont plus facilement détectées si les poumons sont fixés dans le formol durant la nuit , puisque les métastases se apppear que taches blanchâtres, contrairement à l'sombres adjacents tissus pulmonaires brun. </li></ol> 3. La culture de cellules de métastases pulmonaires <ol><li> Métastases pulmonaires sont isolés de souris injectées. Chacun doit être cultivées séparément. </li><li> Chaque métastase est hachée par la fin d'un capuchon de l'aiguille (stérile) sur un tamis 70 pm cellule. </li><li> Rincer la crépine de cellule avec plusieurs mls de milieu et les cellules recueillies qui passent par le filtre dans une boîte de culture. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant au moins quatre jours sans perturbation. </li><li> Laver le sang ou les débris de tissu sur le plat avec du PBS. </li><li> Ajouter un milieu frais. Au début, les cellules cancéreuses et les cellules fibroblastes se développent sur les plaques, mais progressivement, les cellules de fibroblastes va mourir et être remplacées par des cellules cancéreuses. Si les cellules cancéreuses portent pas de gènes résistant aux médicaments, sélectionnez les cellules avec des antibiotiques correspondants. </li><li> La pureté des cellules dérivées est évaluée par immunomarquage utilisant des anticorps contre des protéines spécifiques de l'homme. Nous utilisons un anticorps anti-vimentine humaine (NCL-VIM-V9, Novocastra). Les cellules nous avons dérivé contiennent typiquement plus de 99% de cellules humaines, même en l'absence de sélection des médicaments. Les cellules nouvellement obtenues pourraient être injectés dans des souris immunodéficientes nouveau de tester leurs capacités métastatiques, comme décrit ci-dessus. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <ol><li> A la fin de cet essai, une ligne du cancer métastatique des cellules hautement donne habituellement lieu à de nombreuses métastases pulmonaires (figure 1), 1 alors que les métastases pulmonaires très peu proviennent d'une lignée de cellules cancéreuses métastatiques mal. </li><li> Les cellules obtenues à l'aide de cette méthode donne généralement lieu à plus de métastases que la lignée parentale, quand ils sont testés à nouveau en utilisant ce dosage. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Images représentant la figure 1. Des poumons de souris après des injections dans la veine caudale des cellules cancéreuses. 5 x 10 5 de la ligne de mélanome métastatique de cellules humaines, cellules SM, 4 ont été injectés dans la veine de la queue des souris immunodéficientes. Deux mois plus tard, les poumons ont été isolées et les métastases ont été trouvés dispersés parmi le tissu pulmonaire normal.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Elle comporte quatre grandes étapes: le détachement des cellules cancéreuses de leurs loci primaire, leur mise en circulation (intravasation), leur sortie de la circulation (extravasation), et la survie et la croissance dans un organe à distance. Métastase dans l&#39;homme est considéré comme un processus lent et qui se manifeste souvent après des années de latence. Pour étudier sa progression en temps opportun, le test ci-dessus rela...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de trypan</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine 2,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire Falcon de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture Falcon de 5 ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 30 &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Restriction murin</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de banc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

assay métastases expérimentales

Experimental Metastasis Assay

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Pour comprendre le mécanisme de métastases, un essai de métastases expérimentales a été établi en utilisant des souris immunodéficientes. Cet article définit les procédures impliquées dans cet essai, y compris la préparation des échantillons, l&#39;injection intraveineuse, et la culture de cellules de métastases pulmonaires. Brièvement, un nombre prédéterminé de cellules cancéreuses humaines ont été préparés<em&gt; In vitro</em&gt; Et directement injectées dans la circulation des souris immunodéficientes dans leurs veines de la queue. Un petit nombre de cellules à survivre aux turbulences dans la circulation et de grandir comme des métastases dans les organes internes, comme les poumons. Les souris injectées sont disséqués après une certaine période. La distribution tissulaire des métastases est déterminé sous un microscope à dissection. Le nombre de métastases dans un tissu spécifique est compté et il est directement corrélée avec la capacité métastatique des cellules cancéreuses injectées. Les métastases sont apparues isolées et cultivées<em&gt; In vitro</em&gt; Que les lignées cellulaires, qui présentent souvent des capacités accrues métastatique à la lignée parentale lorsqu&#39;il est injecté à nouveau dans des souris immunodéficientes. Ces dérivés hautement métastatiques deviennent des outils utiles pour identifier les gènes ou les voies moléculaires qui régulent la progression métastatique.

Cet article décrit les procédures d&#39;un essai de métastases expérimentales qui est utilisé pour déterminer le potentiel métastatique de lignées cellulaires humaines de cancer.

Assay Métastases expérimentales

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Afin de comprendre le mécanisme des métastases, un essai expérimental de métastase a été mis en place...

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester les capacités métastatiques de cellules cancéreuses humaines par des injections intraveineuses via la veine caudale. Chez des souris immunodéficientes, les cellules sont préparées pour injection. Ces cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes, ce qui entraîne la formation de métastases pulmonaires après un à deux mois.Les souris sont disséquées et les métastases pulmonaires sont quantifiées et mises en culture. Les résultats de ce type de test indiquent l'importance des métastases d'un type particulier de cellule cancéreuse. Bonjour, je suis Sonali Mohanty du laboratoire du Dr LE, du Département de génétique biomédicale de l'Université de Rochester.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure pour réaliser un test de métastase expérimentale. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la métastase cancéreuse. Commençons donc.Commencez avec des cellules cultivées à environ 70 % de confluence. Aspirez le milieu de la plaque et rincez délicatement une fois avec un X PBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de trypsine 0,05 % en inversant. Secouez doucement la plaque pour faci

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Une métastase pulmonaire expérimentale et CTL modèle de souris d'immunothérapie pour l'analyse de l'interaction des cellules tumorales des...

Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

En utilisant la PCR quantitative, nous montrons comment le bien-établie chiches CAM modèle peut être utilisé pour analyser quantitativement la métastase des cellules tumorales humaines à des organes éloignés.

Analyse quantitative des métastases du cancer en utilisant un modèle d&#39;embryon aviaire

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’établir un modèle murin de métastases spontanées de xénogreffes dérivées de patients atteints de cancer colorectal ou PDX. Ces modèles de xénogreffes imitent partiellement les caractéristiques des carcinomes humains et comprennent les aspects critiques des tumeurs malignes humaines, y compris l’invasion et les métastases.

Modèles murins de métastases spontanées : une plateforme pour étudier le potentiel métastatique des cellules cancéreuses colorectales injectées orthotopiquement

Ce modèle orthotopique de cancer de la prostate humain permet la quantification de la taille de la tumeur, les cellules tumorales circulantes, et la formation de métastases dans le poumon distinct. Comme les cellules doivent échapper à l'organe principal, entrer dans la circulation sanguine, et implanter dans un site secondaire, ce modèle reprend effectivement le scénario chez les humains.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

Ce protocole décrit l'utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l'ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Les métastases jouent un rôle profond dans la virulence du cancer, représentant environ 90 % des décès.  Nous rapportons un protocole pour un modèle de mélanome métastatique chez la souris qui est utile pour déterminer l’efficacité des agents thérapeutiques contre ce phénomène clinique.

L&#39;injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Apprenez un essai de métastases expérimentales pour évaluer le potentiel métastatique des lignées cellulaires cancéreuses humaines par injection dans la veine de la queue chez des souris immunodéficientes.

Assay Métastases expérimentales

Explorer plus de vidéos