Name: Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de limagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez une méthode de suivi en temps réel des métastases du cancer du sein par imagerie in vivo et essais de veine de queue. Cette approche permet de quantifier le nombre et la taille des métastases pulmonaires sans procédure invasive.

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Nous remercions Emily Norton d'avoir aidé à l'aide aux infections virales et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également Ryan Kanai pour son aide dans l'acquisition d'images des poumons et Kate E. Tubbesing pour l'aide à l'analyse de l'image des métastases vertes dans les poumons. Nous remercions le personnel des installations de recherche animale pour leur soutien et leur aide dans la préparation de cette vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention Susan G. Komen Catalyseur de carrière qui a été accordée à J.M.L. (#CCR17477184).

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Étapes critiques de la méthode Il est essentiel d'optimiser le nombre de cellules injectées (étape 3) pour une lignée cellulaire donnée et une souche de souris, car cela peut grandement influencer le nombre de métastases qui se forment et la durée de l'expérience. Si trop de cellules sont injectées ou si les métastases se développent trop longtemps, les métastases peuvent être difficiles à compter, ce qui rend les effets de la manipulation génétique difficiles à évaluer. Cependant, si trop peu de cell...

Le cancer reste la deuxième cause de décès dans le monde1 et la métastes est responsable de la majorité de ces décès2,3. Cependant, une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui régissent la colonisation métastatique et la croissance subséquente a entravé le développement de traitements efficaces pour la maladie métastatique. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques nécessite un essai pour tester comment l'expression ou la fonction perturbée d'un gène candidat influence la formation et la croissance de métastes. Bien que les modèles de souris autochthonous aient leurs avantages, ils sont longs et coûteux à générer, ce qui les rend plus adaptés à la validation des cibles plutôt qu'à la découverte de cibles. Les systèmes de modèle de transplantation dans lesquels le gène candidat est perturbé dans les cellules cancéreuses in vitro et puis les effets sur le potentiel métastatique sont évalués in vivo, sont moins chers et plus élevés que les modèles autochthonous. En outre, les vecteurs viraux pour l'administration stable de l'ARNi, du CRISPR/CAS9 et des transgènes sont largement disponibles, ce qui rend relativement facile de perturber pratiquement n'importe quel gène ou gène d'intérêt dans une lignée de cellules cancéreuses. Cette approche peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats dans la colonisation métastatique et la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines en transplantant les cellules chez des souris immunodéprimées ou humanisées.
Les deux types d'essais utilisés pour tester la formation de métastes par les cellules cancéreuses transplantées in vivo sont les tests spontanés de métastes et les essais expérimentaux de métastes. Dans les essais spontanés de métastes4,5, les cellules cancéreuses sont injectées chez les souris, permis de former une tumeur primaire, puis la formation spontanée de métastes et la croissance ultérieure sont astorées. La force de ce modèle est que les cellules doivent compléter toutes les étapes du processus métastatique afin de former des tumeurs métastatiques. Cependant, beaucoup de lignes de cellules cancéreuses ne métastasent pas efficacement dans les modèles spontanés de métastase, et n'importe quelle manipulation des cellules qui influence la croissance primaire de tumeur peut confondre les résultats de l'analyse de métastase. Des tests expérimentaux de métastes, dans lesquels les cellules cancéreuses sont injectées directement dans la circulation, sont utilisés pour éviter ces pièges. Les essais expérimentaux communs de métastes incluent l'injection de veine de queue6,7,8 (et démontrée ici), l'injection intracardiaque9,et l'injection de veine de portail10.
Le but du protocole présenté ici est de fournir un test de métastes expérimentales in vivo qui permet à un chercheur de surveiller la formation et la croissance des métastes en temps réel, ainsi que de quantifier le nombre et la taille des métastes des points d'extrémité dans les poumons d'une même souris. Pour ce faire, les essais expérimentaux traditionnels de métastes de veine de queue6,7,8 sont combinés avec l'imagerie animale vivante, utilisant un dispositif d'imagerie in vivo9,11,12,13,14. Les cellules tumorales exprimant de façon stable à la fois la luciferase et une protéine fluorescente sont injectées chez les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue, puis le dispositif d'imagerie in vivo est utilisé pour mesurer les changements de la charge métastatique dans les poumons au fil du temps (Figure 1). Cependant, le dispositif d'imagerie animale vivante in vivo ne peut pas distinguer ou mesurer la taille des métastases individuelles. Ainsi, à la fin de l'expérience, un stéréomicroscope fluorescent est utilisé pour compter le nombre et mesurer la taille des métastases fluorescentes dans les poumons sans avoir besoin de sectionnement et d'histologie ou d'immunohistochimie (Figure 1). Ce protocole peut être utilisé pour tester comment la modification de l'expression ou de la fonction d'un gène candidat influence la formation et la croissance des métastes. Des composés thérapeutiques potentiels tels que de petites molécules ou des anticorps bloquant la fonction peuvent également être testés.
Pour démontrer cette approche, nous avons d'abord effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle le facteur essentiel de réplication, la protéine de réplication A3 (RPA3) est renversé dans les cellules métastatiques de cancer du sein de souris. Nous montrons que les souris injectées avec rpA3 knockdown cellules ont beaucoup moins de charge métastatique à chaque moment par rapport aux souris injectées avec des cellules témoins. L'analyse des poumons métastases-contenants montre que ce fardeau métastatique réduit est le résultat de la colonisation métastatique sensiblement réduite et de la croissance altérée des métastases qui se forment. Pour démontrer davantage cette technique, nous avons examiné si l'élimination simultanée de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif de liaison PDZ (TAZ) altère la colonisation métastatique ou la croissance ultérieure. YAP et TAZ sont deux co-activateurs transcriptionnels connexes qui sont les effecteurs critiques en aval de la voie hippopotame. Nous15,16 et d'autres ont impliqué YAP et TAZ dans la métastasie (revue en17,18,19), suggérant que ces protéines sont de bonnes cibles thérapeutiques. Constamment, nous avons constaté que les souris injectées avec des cellules knockdown YAP/TAZ avaient considérablement réduit la charge métastatique. L'analyse des poumons a montré que les cellules de renversement de YAP/TAZ ont formé beaucoup moins de métastases et que les métastases qui se sont formées étaient plus petites. Ces expériences démontrent comment les essais expérimentaux de métastes permettent à un chercheur de tester rapidement et à peu de frais le rôle d'un gène candidat dans la formation et la croissance de métastes. Ils montrent en outre comment l'utilisation combinée de l'imagerie animale vivante et de la quantification fluorescente des métastases dans des poumons entiers permet au chercheur de mieux comprendre les étapes de la colonisation métastatique.

<table><tbody><tr><td>10 % SDS-PAGE Gel</td><td></td><td></td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Trypsine pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plaque d’essai blanche à fond plat à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Pour mesurer le signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées</td></tr><tr><td>Lingettes imbibées</td><td></td><td></td> d’alcool <td>Pour steroliser le site d’injection avant l’induction de la veine caudale</td></tr><tr><td>souris BALB/C ( femelle, 6 semaines)</td><td>Taconic</td><td>BALB-F</td><td>Pour la colonisation métastatique de la veine caudale et les dosages de charge</td></tr><tr><td>BSA régulier</td><td>VWR Ameresco</td><td>97061-416</td><td>Pour le transfert western</td></tr><tr><td>Tampon de lyse cellulaire</td> Signalisation cellulaire <td>Pour la collecte d’échantillons</td><td></td><td></td> de protien</tr><tr><td>Filtres de seringue Celltreat, PES 30mm, 0.45 &mu ; m</td><td>Celltreat</td><td>40-229749-CS</td><td>Pour filtrer le surnageant viral</td></tr><tr><td>CO2 et la chambre</td><td></td><td></td><td>d’euthanasie Pour l’euthanasie des souris</td></tr><tr><td>Kit de dosage de la double luciférase rapporteur</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Pour mesurer le signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées</td></tr><tr><td>Dulbecco& 39; s solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>Pour PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Utilisé pour diluer la trypsine pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>FBS 100 % Origine américaine</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Composant du milieu de croissance complet</td></tr><tr><td>Fujifilm LAS-3000 Imageur gel</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>2118</td><td>Pour Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps IgG (H+L) secondaire de chèvre, conjugué HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>Cellules rénales embryonnaires humaines, HEK-293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Lignée cellulaire utilisée pour l’emballage du virus</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/High clucose</td><td>GE Healthcare life sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Composant du milieu de croissance complet</td></tr><tr><td>Hygromycine B, qualité Ultra Pure</td><td>VWR Ameresco</td><td>97064-810</td><td>Pour la sélection antibiotique des cellules infectées</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multimode Microplaque/EA</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>Pour la mesure du signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées</td></tr><tr><td>Imagej</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour l’analyse d’images de métastases pulmonaires : seuil réglé sur 25 & 100</td></tr><tr><td>Immuno-Blot Membrane PVDF Biorad</td><td></td><td>1620177</td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td>Pour l’anesthésie de la souris</td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Système d’imagerie in vivo (dispositif d’imagerie in vivo d’animaux vivants)</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td>Pour l’imagerie in vivo de la charge métastatique</td></tr><tr><td>Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP et filtres en fond clair)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscope et caméra pour la visualisation, le comptage et la prise de positions de métastases dans les poumons ; magnifacation 10X, exposition 3,5 sec, gain 1,4</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Composant du milieu de croissance complet</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Pour la transfection</td></tr> <tr><td>reporter YAP/TAZ-TEADLiving Image 3.2 (logiciel d’image)</td><td>Logiciel PerkinElmer</td><td></td><td>pour</td></tr><tr><td>cellules cancéreuses du sein de souris IVIS, 4T1</td><td>Karmanos Cancer Institute</td><td>Aslakson, CJ et al.,1992</td><td>Lignée cellulaire de cancer métastatique de souris</td></tr><tr><td>Multi-Gauge version 3.0</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Logiciel pour quantifier l’intensité de la bande de transfert western</td></tr><tr><td>Opti-MEM (tampon de transfection)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Pour l’emballage du virus et la transfection</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Composant d’un milieu de croissance complet Kit de dosage des</td></tr><tr><td>protéines Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Pour quantifier la concentration en protéines</td></tr><tr><td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32957</td><td>Ajouté au tampon de lyse</td></tr><tr><td>cellulaire Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32953</td><td>Ajouté au tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Pour l’infection</td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Pour la sélection antibiotique des cellules infectées</td></tr><tr><td>Restricteur</td><td></td><td></td> de rongeurs <td>Pour retenir les souris lors de l’induction de la veine caudale</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> de fonctionnement SDS-PAGE<td>Pour le western blot</td></tr><tr><td>TAZ (V3886)</td><td>Signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>4883</td> Pour <td></td></tr><tr><td>tampon</td><td></td><td></td><td></td>TBST</tr> par transfert western Pour <tr><td>compteur de cellules automatisé par transfert western TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Pour le comptage des cellules</td></tr><tr><td>Vecteurs</td><td></td><td></td><td>Voir le tableau 1 pour la liste complète des vecteurs</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée VWR</td><td>VWR</td><td>89404-464</td><td>Pour la visualisation de la fluorescence dans Cellules marquées ZSGreen</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de transfert Western</td><td>Pour transfert western</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin K+ Sel</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Substrat injecté à des souris pour des images IVIS bioluminescentes in vivo</td></tr><tr><td>Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9 (solution lipidique pour la transfection)</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Pour l’emballage du virus</td></tr><tr><td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signalisation cellulaire</td><td>14074</td><td>Pour western blot</td></tr></tbody></table>

utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

La métastase est la principale cause de décès liés au cancer et il existe peu d'options thérapeutiques pour les patients atteints de maladie métastatique. L'identification et l'essai de nouvelles cibles thérapeutiques qui faciliteront le développement de meilleurs traitements pour la maladie métastatique exigent des modèles précliniques in vivo. Démontré ici est un modèle de souris syngénéique pour assainer la colonisation métastatique de cancer du sein et la croissance suivante. Les cellules cancéreuses métastatiques sont traitées de façon stable avec des vecteurs viraux codant la luciferase firefly et les protéines ZsGreen. Les gènes candidats sont ensuite manipulés de façon stable dans les cellules cancéreuses exprimant la luciferase/ZsGreen, puis les cellules sont injectées chez la souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue pour mettre en évidence la colonisation et la croissance métastatiques. Un dispositif d'imagerie in vivo est ensuite utilisé pour mesurer la bioluminescence ou la fluorescence des cellules tumorales chez les animaux vivants afin de quantifier les changements dans la charge métastatique au fil du temps. L'expression de la protéine fluorescente permet de quantifier le nombre et la taille des métastases dans les poumons à la fin de l'expérience sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration histologique. Cette approche offre un moyen relativement rapide et facile de tester le rôle des gènes candidats dans la colonisation et la croissance métastatiques, et fournit beaucoup plus d'informations que les tests traditionnels de métastase de veine de queue. En utilisant cette approche, nous montrons que le renversement simultané de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif liant PDZ (TAZ) dans les cellules cancéreuses du sein conduit à une réduction de la charge métastatique dans les poumons et que cette charge réduite est le résultat d'une colonisation métastatique considérablement altérée et d'une croissance réduite des métastases.

Pour démontrer l'approche ci-dessus, nous avons effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle un facteur critique de réplication, RPA3 a été renversé dans une lignée métastatique de cellules de carcinome mammaire de souris (4T122). Alors que le protocole décrit l'étiquetage des cellules avec des protéines à la fois luciferase et fluorescente avant la manipulation génétique, nous avons utilisé une approche modifiée parce que les vecteurs RNAi fournissent également ZsGreen (<strong clas...

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Notre protocole peut être utilisé pour tester rapidement et facilement le rôle de n’importe quel gène candidat dans la colonisation et la croissance métastatiques. Le protocole permet également une surveillance en temps réel de la métastase, de la formation et de la croissance, ainsi que la quantification du nombre et de la taille des métastases chez les mêmes animaux sans avoir besoin de résection ou de coloration histologique. Plaque quatre cellules T1 à 150 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits dans un média de croissance complet.Incuber à 37 degrés Celsius 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le média de croissance des cellules. Ajoutez 500 microlitres de supernatant viral de luciferase et 500 microlitres de supernatant viral de protéine fluorescente pour infecter simultanément les cellules avec les supernatants viraux de luciferase et de protéine fluorescente.Ajoutez ensuite un microlitre de huit milligrammes par bromure d’hexadiméthrine millilitre et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Essayez les quatre cellules T1 avec 500 microlitres de trypsine. Après deux à cinq minutes, transférer toute

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