4.2: Analyse du cycle cellulaire

Le cycle cellulaire fait référence à l’ensemble des processus cellulaires et biochimiques qui se produisent au sein d’une cellule et qui conduisent à sa division. Une cellule passe par différentes étapes du cycle, et le temps nécessaire pour terminer ce processus est presque constant pour un type de cellule. Tout écart par rapport à cette durée est indicatif d’une division cellulaire anormale. Par conséquent, l’analyse du cycle cellulaire devient un outil très utile pour les biologistes intéressés par l’étude des mécanismes de division cellulaire, ce qui aidera finalement à traiter les patients atteints de maladies comme le cancer, dans lesquelles le cycle cellulaire est perturbé.

Cette vidéo aborde le principe et un protocole généralisé de l’analyse du cycle cellulaire. Enfin, nous montrerons quelques applications de cette méthode couramment utilisée.

Apprenons ce qu’est l’analyse du cycle cellulaire et comment fonctionne ce test.

Essentiellement, l’analyse du cycle cellulaire d’une population mixte nous indique combien de cellules se trouvent dans chacune des différentes phases. Cela se fait le plus souvent en évaluant le contenu de l’ADN de la cellule. Vous vous demandez peut-être : pourquoi le contenu en ADN ? Pour comprendre cela, passons brièvement en revue ce qui arrive à l’ADN chromosomique au fur et à mesure qu’une cellule progresse dans le cycle.

Au cours de la phase G1, le contenu de l’ADN dans une cellule ne change pas. Au cours de la phase S, la réplication de l’ADN a lieu, et à la fin de cette phase, le contenu de l’ADN est doublé. Dans la phase G2, les cellules vérifient qu’il n’y a pas d’erreurs dans la duplication de l’ADN, et enfin, à la fin de l’étape M, cet ADN est divisé de manière égale en deux cellules filles. Par conséquent, le marquage de l’ADN peut aider un scientifique à déterminer l’étape du cycle cellulaire.

Une considération importante pour cet étiquetage est le choix du colorant de liaison à l’ADN. La bromodéoxyuridine, ou BrdU, est un analogue d’acide nucléique et imite structurellement la thymidine. Cela permet à BrdU de s’incorporer dans le brin en croissance lors de la réplication de l’ADN. Par conséquent, ce colorant marque les cellules en phase S uniquement. Après l’incorporation de BrdU, les brins d’ADN sont séparés et BrdU est détecté à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence.

D’autres composés, tels que l’iodure de propidium ou PI, qui est intrinsèquement fluorescent, s’intercalent entre les acides nucléiques double brin, et colorent donc les cellules à tous les stades. Cependant, la quantité de coloration PI est proportionnelle à la quantité d’ADN.

Bien que le choix d’une coloration dépende de l’expérience en cours, les chercheurs utilisent souvent des procédures de coloration double. Les molécules comme PI qui se lient proportionnellement à toutes les cellules peuvent facilement différencier les cellules G1 des cellules en phase G2 ou M. Cependant, les cellules de la phase S sont encore en transition. Par conséquent, l’ajout de molécules comme BrdU qui ne marquent que les cellules en phase S augmente la spécificité de la détection des étapes du cycle cellulaire. Enfin, les cellules sont analysées à l’aide de la cytométrie en flux pour dénombrer les cellules à différents stades du cycle cellulaire.

Maintenant que vous comprenez les principes de la coloration du cycle cellulaire, discutons d’une procédure utilisant BrdU et PI.

Installez des boîtes de culture cellulaire : une pour l’expérience et trois autres comme témoins. À environ 60 % de confluence, le BrdU dissous dans le milieu de culture est ajouté aux cellules vivantes, suivi de l’incubation. À ce stade, BrdU est incorporé dans l’ADN répliquant.

Après l’incubation, les cellules sont centrifugées et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS. Ensuite, les cellules sont fixées en ajoutant une suspension de cellules goutte à goutte à de l’éthanol glacé à 70 % tout en tourbillonnant doucement. Cela arrête la division cellulaire et empêche l’agglutination.

Les cellules fixes sont à nouveau centrifugées et remises en suspension dans du PBS. Ensuite, une solution acide concentrée contenant un détergent, tel que Triton-X, est ajoutée aux cellules goutte à goutte. Le détergent perméabilise les cellules pour permettre l’entrée de composés imperméables aux membranes, et l’acide diminue le pH et dénature l’ADN, exposant le BrdU. Les cellules sont ensuite centrifugées, le surnageant est éliminé et la pastille est remise en suspension dans une solution alcaline pour restaurer le pH.

Enfin, les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec un anticorps BrdU conjugué à un marqueur fluorescent à température ambiante. Après cette étape, les échantillons doivent être protégés de la lumière pour éviter le photoblanchiment.

Lors de la double coloration, les cellules sont incubées avec de la PI et de la RNase. La RNase est nécessaire pour éliminer les doubles brins ARN-ARN ou ARN-ADN, qui se lient également à PI et peuvent donner des résultats faussement positifs. Les cellules sont ensuite passées à travers une crépine cellulaire pour former une suspension unicellulaire, ce qui est nécessaire pour l’analyse cytométrique en flux.

Maintenant que vous avez appris le protocole de coloration, voyons comment analyser les données obtenues.

En bref, en cytométrie en flux, un faisceau laser brille sur un flux étroit de suspension de cellule unique, et l’émission à des longueurs d’onde particulières des colorants dans chaque cellule est détectée comme un événement unique sur un nuage de points.

Ici, le nuage de points des cellules colorées au PI montre deux groupes distincts, l’un contenant presque deux fois plus de PI que l’autre. Suite à l’optimisation du détecteur PI, ces ensembles apparaissent sous la forme de deux pics dans une analyse d’histogramme. Le pic à une intensité PI plus élevée représente les cellules G2/M, et celui à une intensité plus faible représente les cellules G1. Les zones sous ces pics représentent le nombre de cellules dans les phases correspondantes.

De même, les événements BrdU-FITC peuvent être affichés dans une analyse d’histogramme sur une échelle logarithmique. Ce graphique montre que les cellules positives à BrdU sont nettement plus brillantes que les cellules non colorées, et comme seule une fraction de la population est en phase S, un pic plus important de cellules non colorées BrdU peut être observé.

Le nuage de points des cellules colorées avec BrdU et PI peut être affiché avec PI sur l’axe linéaire des X et BrdU sur l’axe logarithmique des Y, ce qui montre un motif en fer à cheval allant de G1, S à G2. La proportion de cellules dans les zones fermées peut être déterminée et affichée sur un graphique à barres.

Maintenant que nous avons passé en revue le protocole de base pour l’analyse du cycle cellulaire, voyons comment il peut être utilisé dans diverses configurations expérimentales.

A. En combinant des manipulations génétiques avec l’analyse du cycle cellulaire, les scientifiques étudient les rôles de protéines spécifiques dans la progression du cycle cellulaire. Dans cette étude, les scientifiques ont surexprimé une protéine appelée p27 dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Les résultats démontrent que la surexpression a conduit à un nombre plus faible de cellules dans la phase S, indiquant que cette protéine joue un rôle essentiel dans la régulation du cycle cellulaire.

À l’aide de l’analyse du cycle cellulaire, les scientifiques peuvent comparer la cinétique de progression. Ici, la cinétique de progression entre deux lignées cellulaires de cancer colorectal et une lignée cellulaire de cancer du sein a été comparée. Les résultats ont démontré que les cellules cancéreuses du sein progressaient dans le cycle cellulaire à un rythme plus lent que les lignées cellulaires colorectales, étant donné le pourcentage plus élevé de cellules cancéreuses du sein dans le G1 au fil du temps.

Enfin, pour l’analyse in vivo du cycle cellulaire, BrdU peut être injecté chez les rongeurs et la population cellulaire cible peut être isolée pour l’analyse du cycle cellulaire. Dans cette étude, des cellules souches hématopoïétiques ou CSH de souris injectées par BrdU ont été isolées pour une analyse par cytométrie en flux. Les données recueillies ont révélé la distribution des CSH entre les différents stades du cycle cellulaire avec une prédominance dans les phases G1 et S.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’analyse du cycle cellulaire. Nous avons examiné les principes qui sous-tendent ce processus, détaillé un protocole étape par étape et examiné comment ce type d’analyse est utilisé dans divers contextes expérimentaux. Comme toujours, merci d’avoir regardé !