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Culture et différenciation de cellules souches embryonnaires

Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation

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Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation

2.7: An Introduction to Stem Cell Biology

2.9: Induced Pluripotency

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09:52 min

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April 30, 2023

Overview

Mise en culture des cellules souches embryonnaires (ES) requiert des conditions qui préservent ces cellules dans un État indifférencié à préserver leur capacité d’autorenouvellement et pluripotence. Biologistes de cellules souches sont continuellement optimiser des méthodes pour améliorer l’efficacité de la culture de cellules ES et tentent en même temps d’orienter la différenciation des cellules d’ES dans les types de cellules spécifiques qui pourraient être utilisées dans la médecine régénérative.

Cette vidéo décrit les principes fondamentaux de la culture de cellules ES et montre un protocole général de grandir et de cellules d’ES de passage. Nous prenons également un coup de œil à la pendaison drop méthode, qui est utilisé pour différencier les cellules ES. Enfin, cette vidéo va décrire quelques-unes des applications de culture de cellules d’ES et les techniques de différenciation, y compris une méthode utilisée pour générer des fonctionnelles cardiaques muscle cellules in vitro.

Procedure

Les cellules souches embryonnaires, ou cellules d’ES, ont un certain nombre de propriétés uniques qui les distinguent des cellules adultes ordinaires. Donc, les scientifiques ont mis au point des techniques spéciales de culture à maintenir ou à tirer parti de ces propriétés. Lorsqu’il est cultivé correctement, CSEh peut diviser indéfiniment pour faire plus d’eux-mêmes. Dans le même temps, en modifiant les conditions de culture, les cellules ES peuvent être adressées à se différencier en n’importe quel type de cellule dans notre corps ; Cette capacité des cellules d’ES est appelée « pluripotence. »

Dans cette vidéo, vous allez apprendre à la culture et le passage des cellules ES afin qu’ils maintiennent leurs propriétés uniques, comment induire la différenciation dans ES cellules de types spécifiques de cellules de forme et la manière dans laquelle ES techniques de culture et de la différenciation cellulaire est utilisés et affinée par les chercheurs aujourd’hui.

Avant d’entrer dans les détails des procédures de maintenance de cellules ES, il faut d’abord comprendre ce qui empêche ou disques de différenciation des cellules ES. Afin que les cellules ES à conserver leurs propriétés uniques de pluripotence et auto-renouvellement, ils doivent être cultivés avec des facteurs spécifiques dans leur milieu de croissance qui suppriment la différenciation spontanée.

C’est le plus souvent effectuée en cultivant les cellules ES sur une couche de « feeders », habituellement la souris fibroblastes embryonnaires, ou MEFs. Des cellules nourricières « nourrissent » les cellules ES certains facteurs, comme l’activine A, qui aident à maintenir les cellules ES dans leur état indifférencié.

Récemment, les scientifiques ont également développé des méthodes culture exempte d’engraissement dans lequel ES cellules sont cultivées dans les médias avec les facteurs nécessaires ajoutés dans une recette définie. Cette approche réduit la variabilité et supprime le composant de non-humain de cultures de cellules d’ES, qui est une condition sine qua non pour des applications cliniques.

Une autre caractéristique des cellules d’ES est qu’ils naturellement poussent en grappes ou colonies et ont tendance à avoir des taux de survie faibles lorsque dissociées en cellules individuelles, en particulier les cellules ES humaines. En conséquence, passage des cellules ES humaines généralement nécessite leur maintien en touffes intactes par le biais de mécanique « aléatoire ».

Lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions non adhérents, ils forment des agrégats 3D appelés corps embryoïdes ou EBs, dans lequel les cellules se différenciera dans tous les différents types de cellules. En faisant varier les conditions de la différenciation, telles que l’ajout de facteurs de croissance spécifiques au milieu, les scientifiques développent des méthodes pour diriger la différenciation des cellules ES en types cellulaires spécifiques.

Maintenant que vous comprenez que les principes derrière ES entretien et différenciation des cellules, nous allons étudier comment la culture et de passage des cellules ES sur mangeoires MEF.

MEFs sont prélevés sur des embryons de souris de stade précoce et sont puis inactivés par des produits chimiques ou des rayonnements pour les empêcher de diviser davantage. MEFs inactivés doivent être plaqués sur culture de tissus gélatinisé vaiselle au moins une journée avant de commencer à la culture de cellules d’ES. Lorsque les mangeoires sont entièrement réglées, CSEh est décongelés et ensemencé sur les plaques.

Au cours des prochains jours, les cellules ES grandira en grandes colonies. Avant que les colonies commencent à toucher et fusible, la culture ES doit être repiquée. On devrait observer la morphologie des cellules ES pour voir si elles montrent des signes de différenciation. Indifférenciée des colonies ES regarde généralement bien définies et homogène, tandis que les cellules différenciées ressemblerait « pavés » ternes, de forme irrégulière.

Si les colonies afficher 70 % ou plus de différenciation, ou si elles sont rares, mécaniquement découper les colonies indifférenciées et transférez-les vers une nouvelle plaque d’alimentation. Sinon, simplement supprimer les zones différenciées ou colonies et poursuivez le passage.

Une fois que les colonies différenciés ont été nettoyés, les enzymes protéolytiques, comme la collagénase, sont ajoutés pour soulever les cellules de la plaque avec une incubation à 37° C pendant le laps de temps approprié. Les supports neufs ES sont ensuite ajouté à arrêter les réactions enzymatiques. Les colonies sont mécaniquement délogées de la plaque et transférées dans un tube à centrifuger, où ils sont divisés en tailles souhaitées avec douceur de pipetage. Les cellules ES sont recueillies par centrifugation, resuspendues dans médias ES et plaqués sur les plaques de mangeoire préparés.

Après avoir appris à passage de cellules ES, jetons un œil à l’une des techniques plus courantes permettant de différencier les cellules ES en accrochant le corps embryoïdes drop méthode.

Pour commencer, CSEh est décrochés à l’aide d’enzymes protéolytiques comme la collagénase et dilué à la concentration voulue dans des milieux contenant des facteurs de différenciation de la lignée spécifique. La suspension de cellules d’ES est alors déposée en gouttes sur le couvercle d’une boîte de Pétri bactérienne. Le couvercle est placé sur le plat, donc les gouttes de médias vont accrocher à l’envers et laisser les corps embryoïdes développer et inversé rapidement.

Après environ deux jours, les gouttes avec EBs soient collectées et plaqués sur des plaques non adhérents pour la culture des autres. Au point de temps opportun pour la lignée de la cellule souhaitée, corps embryoïdes sont plaquées sur plats gélatinisé vitroplants adhérentes pour davantage de différenciation.

Maintenant que nous avons couvert les techniques de base de la culture et la différenciation des cellules ES, regardons comment ils sont adaptés pour des besoins spécifiques expérimentales.

Comme mentionné précédemment, les cellules ES peuvent être adressées à se différencier en types spécifiques de cellules dans des conditions de culture différentes. Dans cette expérience, les scientifiques produites motoneurones de cellules ES humaines. Cela a été fait par des facteurs premiers ajout à différencier des corps embryoïdes qui orientent vers la lignée neuronale, suivie des produits chimiques et des conditions de placage qui transforment ces cellules spécifiquement dans les neurones moteurs. En utilisant des approches similaires, les chercheurs ont réussi à différencier les cellules ES en battant rythmiquement des cellules du muscle cardiaque.

Parce que la différenciation des cellules ES imitent les événements qui se produisent comme des embryons se développent naturellement, nous pouvons aussi les utiliser pour étudier la biologie du développement embryonnaire précoce. Un des phénomènes étudiés est l’inactivation du chromosome x ou XC, le processus essentiel par lequel d’entre les deux chromosomes est réduit au silence dans chaque cellule d’un mammifère femelle. En visualisant la distribution des spécifique des ARN et des protéines dans l’élaboration d’EBs, les scientifiques ont acquis des renseignements précieux sur la biologie de XCI.

Enfin, afin d’accroître la cohérence et l’efficacité de l’expérimentation de cellules ES, scientifiques cherchent continuellement à concevoir de meilleures techniques pour la culture de cellules d’ES. Une approche consiste à cultiver des cellules ES en une seule couche, appelée type colonie non mise en culture monocouche ou Mr.

N’oubliez pas que les cellules ES humaines tendent à être malheureux quand ils ne poussent pas comme des agrégats 3D ? Les scientifiques ont démontré que les produits chimiques appelés inhibiteurs de ROCK augmentent la survie des cellules ES dissociées, qui leur permettent d’être repiquées dans des suspensions de cellules individuelles et d’être plaqué à haute densité. L’avantage de la technique de Mr, c’est que chaque cellule est plus tout aussi exposé à des facteurs de croissance et d’éléments nutritifs dans le milieu, de réduire l’hétérogénéité au sein de la culture tout en la rendant plus faciles à cultiver des cellules ES en grand nombre.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la culture et de différencier les cellules souches embryonnaires. Vous devriez maintenant savoir quels facteurs sont importants pour le maintien de cellules d’ES dans leur état indifférencié, et comment nous pouvons profiter de ES cell pluripotence pour générer des types spécifiques de cellules dans un plat. Aller plus loin, les scientifiques travailleront pour développer plus efficaces et bien définies de culture et de la différenciation conditions pour produire des types de cellules spécialisées qui peuvent être utilisés dans des applications de la médecine régénérative. Merci de regarder !

Transcript

Embryonic stem cells, or ES cells, have a number of unique properties that distinguish them from regular adult cells. Therefore, scientists have devised special culturing techniques to maintain or take advantage of these properties. When cultured properly, ES cells can divide indefinitely to make more of themselves. At the same time, by altering the culturing conditions, ES cells can be directed to differentiate into almost any cell type found in our body; this ability of ES cells is called “pluripotency.”

In this video, you are going to learn how to culture and passage ES cells so that they maintain their unique properties, how to induce differentiation in ES cells to form specific cell types, and the ways in which ES cell culturing and differentiation techniques are being used and refined by researchers today.

Before going into details of the procedures for ES cell maintenance, it is important to first understand what prevents or drives ES cell differentiation. In order for ES cells to retain their unique properties of pluripotency and self-renewal, they must be cultured with specific factors in their growth medium that suppress spontaneous differentiation.

This is most commonly done by culturing ES cells on a layer of “feeders,” usually mouse embryonic fibroblasts, or MEFs. Feeder cells “feed” the ES cells certain factors, such as activin A, that help to maintain ES cells in their undifferentiated state.

Recently, scientists have also developed feeder-free culturing methods in which ES cells are grown in media with the necessary factors added in a defined recipe. This approach reduces variability and removes the non-human component from ES cell cultures, which is a prerequisite for clinical applications.

Another characteristic of ES cells is that they naturally grow in clusters or colonies, and tend to have low survival rate when dissociated into single cells, especially human ES cells. As a result, passaging human ES cells generally requires retaining them in intact clumps through mechanical “picking.”

When ES cells are grown in non-adherent conditions, they form 3D aggregates known as embryoid bodies, or EBs, in which the ES cells will differentiate into all different cell types. By varying the differentiation conditions, such as the addition of specific growth factors to the medium, scientists are developing methods to direct ES cell differentiation into specific cell types.

Now that you understand the principles behind ES cell maintenance and differentiation, let’s look at how to culture and passage ES cells on MEF feeders.

MEFs are obtained from early stage mouse embryos, and are then inactivated by chemicals or radiation to prevent them from further dividing. Inactivated MEFs should be plated onto gelatinized tissue culture dishes at least one day before starting to culture ES cells. When feeders are fully settled, ES cells are thawed and seeded onto the plates.

Over the next few days, ES cells will grow into large colonies. Before the colonies begin to touch and fuse, the ES culture should be passaged. One should observe the ES cells’ morphology to see if they are showing signs of differentiation. Undifferentiated ES colonies generally look well-defined and homogeneous, while differentiated cells would look like dull, irregular-shaped “cobblestones.”

If colonies show 70% or more of differentiation, or if they are sparse, mechanically cut out the undifferentiated colonies and transfer them to a new feeder plate. Otherwise, simply remove the differentiated areas or colonies and proceed with passaging.

Once the differentiated colonies have been cleaned up, proteolytic enzymes, like collagenase, are added to lift the cells from the plate with incubation at 37°C for the appropriate amount of time. Fresh ES media is then added to stop the enzymatic reactions. The colonies are mechanically dislodged from the plate and transferred to a centrifuge tube, where they are broken up into desired sizes with gentle pipetting. The ES cells are collected by centrifugation, resuspended in ES media, and plated onto the prepared feeder plates.

After learning how to passage ES cells, let’s look at one of the more common techniques used to differentiate ES cells into embryoid bodies-the hanging drop method.

To begin, ES cells are detached with the help of proteolytic enzymes like collagenase, and diluted to the desired concentration in media containing lineage-specific differentiation factors. The ES cell suspension is then deposited in drops onto the lid of a bacterial petri dish. The lid is quickly inverted and placed on the dish, so the media drops will hang upside down and allow the embryoid bodies to develop.

After about two days, the drops with EBs can be collected and plated onto non-adherent plates for further culturing. At the appropriate time point for the desired cell lineage, embryoid bodies are plated back onto gelatinized adherent tissue culture dishes for further differentiation.

Now that we’ve covered the basic techniques of culturing and differentiating ES cells, let’s look at how they are tailored for specific experimental needs.

As mentioned earlier, ES cells can be directed to differentiate into specific cell types under different culturing conditions. In this experiment, scientists produced motor neurons from human ES cells. This was done by first adding factors to differentiating embryoid bodies that direct them towards the neural lineage, followed by chemicals and plating conditions that turn these cells specifically into motor neurons. Using similar approaches, researchers have been successful in differentiating ES cells into rhythmically beating heart muscle cells.

Because differentiating ES cells mimic events that occur as embryos develop naturally, we can also use them to investigate the biology of early embryonic development. One of the phenomena being studied is X-chromosome inactivation, or XCI, the crucial process whereby one of the two X-chromosomes is silenced in each cell of a female mammal. By visualizing the distribution of specific RNAs and proteins in developing EBs, scientists have gained valuable insights into the biology of XCI.

Finally, to increase the consistency and efficiency of ES cell experimentation, scientists are continually trying to devise better techniques to culture ES cells. One approach is to grow ES cells in a single layer, called non-colony type monolayer culturing, or NCM.

Remember that human ES cells tend to be unhappy when they are not growing as 3D aggregates? Scientists have shown that chemicals known as ROCK inhibitors increase the survival of dissociated ES cells, which allow them to be passaged as single-cell suspensions, and to be plated at high density. The advantage of the NCM technique is that every cell will be more equally exposed to growth factors and nutrients in the medium, reducing heterogeneity within the culture while making it easier to grow ES cells in large numbers.

You’ve just watched JoVE’s video on how to culture and differentiate embryonic stem cells. You should now know what factors are important for maintaining ES cells in their undifferentiated state, and how we can take advantage of ES cell pluripotency to generate specific cell types in a dish. Going forward, scientists will be working to develop more efficient and well-defined culturing and differentiation conditions to produce specialized cell types that can be used in regenerative medicine applications. Thanks for watching!

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