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Advanced Biology

Détection des dérivés réactifs de l'oxygène

Detecting Reactive Oxygen Species

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

Detecting Reactive Oxygen Species

4.11: The ATP Bioluminescence Assay

4.13: An Introduction to Cell Death

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09:08 min

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April 30, 2023

Overview

Les espèces réactives de l’oxygène sont chimiquement actifs, dérivés de l’oxygène des molécules capables d’oxyder d’autres molécules. En raison de leur nature réactive, il y a plusieurs effets pervers liés à la production de ROS décochée, y compris des dommages structurels à l’ADN et autres molécules biologiques. Cependant, ROS peuvent également être des médiateurs de signalisation physiologique. Il y a des preuves s’accumulent que ROS jouent un rôle important dans tout ce que de l’activation de facteurs de transcription à la médiation de toxicité inflammatoire qui tue les pathogènes étrangers et de défendre l’organisme.

Dans cette vidéo, nous allons plonger dans les associations entre ROS, de métabolisme et de la maladie. Après avoir établi leur importance, nous allons discuter des principes et un protocole d’une méthode couramment utilisée pour mesurer les niveaux ROS dans les cellules : l’utilisation de non fluorescent sondes qui deviennent fluorescents à oxydation. Enfin, nous passerons en revue certaines applications actuelles de cette technique dans la recherche en biologie cellulaire.

Procedure

Espèces réactives de l’oxygène produits dans les cellules ont été impliqués dans l’homéostasie tissulaire, vieillissement cellulaire et États de maladie comme le cancer. Comme leur nom l’indique, ces molécules proviennent de l’oxygène, qui existe naturellement comme une molécule de dioxygène stable, puisque tous ses électrons sont appariés. L’ajout d’un électron non apparié, ce qui la rend instable et conduit à la formation de l’anion superoxyde — une forme d’espèces réactives de l’oxygène ou ROS. Autre que l’anion superoxyde, il y a plusieurs types d’espèces réactives avec des électrons non appariés, dont la cellule a pour objectif de contrôler étroitement les niveaux.

Dans cette vidéo, nous apprendrons comment oxygénées espèces sont reliées au métabolisme et maladie des cellules, explorer les principes qui sous-tendent un test permettant sa détection en utilisant une sonde fluorescente et nous irons via un protocole généralisé avec ce test. Enfin, nous allons étudier comment les scientifiques mettent en œuvre cette méthode au cours d’expériences aujourd’hui.

Tout d’abord, nous allons discuter comment oxygénées espèces sont produites et tenir compte de leur influence dans le métabolisme cellulaire et la maladie.

Une source importante d’espèces oxygénées radicalaires cellulaire est la mitochondrie. Normalement, au cours de la cellule électrons de métabolisme sont transportés par une chaîne de complexes protéiques, aboutissant à la réduction de l’oxygène moléculaire dans l’eau et la production simultanée d’ATP. Malgré le règlement extraordinaire de ce processus, les électrons fuient, entraînant la formation d’un anion superoxyde.

La présence de l’anion superoxyde donne rapidement naissance à d’autres formes d’espèces réactives de l’oxygène, tels que le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle. Ces radicaux, qui tous possède un électron non apparié très réactif, peut endommager par oxydation de membranes, l’ADN et les protéines. Pour contrer, la cellule maintient son propre stock d’antioxydant d’enzymes comme la superoxyde dismutase ou molécules comme la vitamine C, qui réduisent les radicaux libres. Tout déséquilibre dans ce système de défense peut entraîner une boucle de rétroaction positive potentiellement mortelle, résultant en un état de trop reactive oxygen species, connu comme le stress oxydatif.

Les espèces réactives de l’oxygène ont été impliqués dans l’initiation et la progression du cancer. Un autre effet nocif de ces molécules est l’induction du vieillissement cellulaire, aussi connu sous le nom de sénescence. Les « radicaux libres théorie du vieillissement » propose que des espèces oxygénées réactives produites dans les cellules au cours du métabolisme normal évoquent la mort et la sénescence cellulaire.

Jusqu’à présent, nous avons discuté les aspects négatifs de ces molécules très réactives, mais ils jouent un rôle positif dans la physiologie cellulaire aussi bien. Au cours de la réponse immunitaire lors de phagocytes engloutissent pathogènes, cellules Mont un « éclat respiratoire » au cours de laquelle des quantités excessives d’espèces oxygénées réactives sont générées afin de dégrader par oxydation des agents pathogènes. En outre, ils sont des intermédiaires nécessaires et régulateurs d’une variété de voies de signalisation cellulaire et peuvent même signal la mort des cellules cancéreuses se sont tournés.

Afin de quantifier ces oxydants cellulaires influents, scientifiques exploitent les molécules qui, après oxydation transforment fluorescents. Une sonde utilisée pour détecter les espèces réactives de l’oxygène est H₂DCFDA ou dichloro-dihydro-fluorescéine diacétate, un analogue non fluorescent de fluorescéine. Lors de l’ajout de cellules, sa cellule perméants nature lui permet de diffuser passivement dans.

Puis, estérases intracellulaires catalysent une réaction d’hydrolyse, qui se traduit par clivage des groupes acétates. Cela rend le composé plus polaire, alors qu’il est conservé au sein de la cellule. Lors de l’oxydation, qui implique la suppression des atomes d’hydrogène par un large éventail d’espèces réactives de l’oxygène, le H2DCFDA non fluorescent est converti en la très fluorescent dichloro-fluorescéine ou DCF. Ceci peut être lu et quantifiée par un lecteur de plaque, cytomètre en flux ou la microscopie de fluorescence.

Maintenant que vous savez comment fonctionne ce test, nous allons voir comment il est effectué dans un laboratoire.

Commencer par le transfert de cellules cultivées en milieu de culture à solution saline tamponnée au phosphate, suivi par centrifugation pour les laver. Éliminer le surnageant et ajouter la solution DCFDA la sonde fluorescente H₂. Incuber les cellules chargées de colorant dans l’obscurité pour empêcher le photoblanchiment. Après incubation, laver les cellules pour déloger les cellules de colorant et transfert déchargés sur une plaque. À ce stade, les inducteurs de stress oxydatif expérimental peuvent être ajoutés.

Lorsque vous êtes prêt pour l’analyse, les cellules peuvent être insérés dans le lecteur. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont définies pour la fluorescéine. Après la lecture des plaques, les valeurs peuvent être analysés. Résultats révèlent la quantité relative des espèces réactives de l’oxygène entre les échantillons à des moments particuliers.

Maintenant que nous avons examiné le protocole actuel, nous allons regarder comment il est appliqué dans les expériences aujourd’hui.

Les chercheurs utilisent souvent cette méthode pour étudier les mécanismes de la phagocytose. Ce groupe de scientifiques voulu étudier la capacité du poisson-zèbre à monter une immuno-réaction à différents stades de développement. Comme mentionné précédemment, les résultats de la phagocytose dans la génération d’espèces réactives de l’oxygène élevée, ou « un éclat respiratoire », qui est utilisé pour détruire les agents pathogènes. Puisque l’enzyme oxydase de NADPH est un important producteur ROS dans les cellules phagocytaires, ces scientifiques induite par la réaction de sursaut en traitant le poisson-zèbre avec un inducteur de NADPH. Les résultats ont démontré que chez les embryons de poisson-zèbre dont la réponse « burst » avait été provoquée, ceux à la fertilisation après 72 heures montrent développement d’espèces réactives de l’oxygène supérieur à celles de 48 heures après la fécondation.

Dysfonctionnement mitochondrial dues aux espèces réactives de l’oxygène accru est une caractéristique pathologique de nombreuses maladies. Par conséquent, les chercheurs peuvent déterminer le dysfonctionnement mitochondrial en mesurant le niveau de stress oxydatif. Ici, les scientifiques chargement des H2DCFDA sur les neurones et ensuite monté les échantillons sur un microscope à fluorescence. Sur l’ajout d’un facteur de stress oxydatif, comme le peroxyde d’hydrogène, corps cellulaires affiche une augmentation soudaine de la fluorescence, qui pourrait être une indication de dysfonctionnement mitochondrial.

Les astrocytes ont été suggérées pour protéger les neurones du système nerveux central contre le stress oxydatif. En raison de cette importance, ces chercheurs visant à développer un test pour détecter le stress oxydatif dans les astrocytes en présence d’un inducteur externe. Ils ont fait cela en incubant des astrocytes avec peroxyde d’hydrogène et la sonde fluorescente pour la détection d’espèces réactives de l’oxygène. Subséquente fluorescence générée a été analysée à l’aide d’un cytomètre en flux. Astrocytes activés pour le stress oxydatif ont été observés à l’automne dans une région de l’intensité de fluorescence accrue, vue décalée vers la droite.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la détection des espèces réactives de l’oxygène ou ROS. Pour résumer, dans cette vidéo, nous avons analysé le lien entre les espèces réactives de l’oxygène, le métabolisme cellulaire et la maladie. Nous avons ensuite examiné le principe et la procédure d’un test de détection des espèces réactives de l’oxygène. Enfin, nous avons examiné comment les chercheurs appliquent cette méthode à leurs enquêtes. L’analyse des rôles toujours énigmatiques des espèces réactives de l’oxygène est d’un grand intérêt pour les biologistes cellulaires et mesure fiable avec des sondes fluorescentes s’avère très utile. Comme toujours, Merci pour regarder !

Transcript

Reactive oxygen species produced in cells have been implicated in tissue homeostasis, cellular aging, and disease states like cancer. As their name implies, these molecules arise from oxygen, which naturally exists as a stable, dioxygen molecule since all its electrons are paired. The addition of one unpaired electron renders it unstable, and leads to formation of the superoxide anion—a form of reactive oxygen species or ROS. Other than the superoxide anion, there are several types of reactive species with unpaired electrons, whose levels the cell aims to tightly control.

In this video, we’ll learn how reactive oxygen species are related to cell metabolism and disease, explore the principles behind an assay for its detection using a fluorescent probe, and we’ll go over a generalized protocol for this assay. Lastly, we’ll investigate how scientists are implementing this method in experiments today.

First, let’s discuss how reactive oxygen species are produced, and consider their influence in cell metabolism and disease.

A significant source of cellular reactive oxygen species is the mitochondria. Normally, during cell metabolism electrons are transported through a chain of protein complexes, culminating in the reduction of molecular oxygen to water and simultaneous generation of ATP. Despite the extraordinary regulation of this process, electrons do leak out, resulting in the formation of superoxide anion.

The presence of superoxide anion quickly gives rise to other forms of reactive oxygen species, such as hydrogen peroxide and hydroxyl radical. These radicals, which all possess a highly reactive unpaired electron, can oxidatively damage membranes, DNA, and proteins. To counteract, the cell maintains its own antioxidant stockpile of enzymes like superoxide dismutase, or molecules like vitamin C, that reduce free radicals. Any imbalance in this defense system can result in a potentially fatal positive feedback loop, resulting in a condition of excessive reactive oxygen species known as oxidative stress.

Reactive oxygen species have been implicated in initiation and progression of cancer. Another harmful effect of these molecules is the induction of cellular aging, also known as senescence. The “Free Radical Theory of Aging” proposes that reactive oxygen species produced in cells during normal metabolism evoke cellular senescence and death.

Until now, we discussed the negative aspects of these highly reactive molecules, but they have positive roles in cellular physiology as well. During immune responses when phagocytes engulf pathogens, cells mount a “respiratory burst” during which excessive amounts of reactive oxygen species are generated to oxidatively degrade pathogens. In addition, they are necessary intermediates and regulators of a variety of cell signaling pathways, and can even signal the death of cells that have turned cancerous.

To quantify these influential cellular oxidants, scientists exploit molecules that upon oxidation turn fluorescent. A commonly used probe to detect the reactive oxygen species is H2DCFDA or dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, a non-fluorescent analogue of fluorescein. When added to cells, its cell permeant nature allows it to passively diffuse in.

Then, intracellular esterases catalyze a hydrolysis reaction, which results in cleaving of acetate groups. This makes the compound more polar, so that it is retained within the cell. Upon oxidation, which involves removal of hydrogen atoms by a wide range of reactive oxygen species, the non-fluorescent H2DCFDA is converted to the highly fluorescent dichloro-fluorescein, or DCF. This can be read and quantified by a plate reader, flow cytometer, or fluorescence microscopy.

Now that you know how this assay works, let’s see how it’s performed in a laboratory setting.

Start by transferring cells grown in culture medium to phosphate buffered saline, followed by centrifugation to wash them. Remove supernatant, and add the fluorescent probe H2DCFDA solution. Incubate the dye-loaded cells in the dark to prevent photobleaching. After incubation, wash the cells to remove unloaded dye and transfer cells to a plate. At this point, experimental oxidative stress inducers can be added.

When ready for analysis, cells can be inserted into the plate reader. The excitation and emission wavelengths are set for fluorescein. After plates are read, values can be analyzed. Results reveal the relative amount of reactive oxygen species between samples at particular time points.

Now that we’ve examined the actual protocol, let’s look how it’s being applied in experiments today.

Researchers often use this method to investigate the mechanics of phagocytosis. This group of scientists wanted to study the ability of zebrafish to mount an immune response at different stages of development. As mentioned earlier, phagocytosis results in the generation of high reactive oxygen species, or “a respiratory burst,” that is used to kill pathogens. Since the enzyme NADPH oxidase is a significant ROS producer in phagocytic cells, these scientists induced the burst response by treating zebrafish with a NADPH inducer. The results demonstrated that amongst zebrafish embryos whose “burst” response had been provoked, those at 72 hours post-fertilization showed higher reactive oxygen species development than those at 48 hours post-fertilization.

Mitochondrial dysfunction due to increased reactive oxygen species is a pathological feature of many diseases. Therefore, researchers can identify mitochondrial dysfunction by measuring the level of oxidative stress. Here, scientists loaded H2DCFDA onto neurons, and then mounted the samples onto a fluorescence microscope. On addition of an oxidative stressor, like hydrogen peroxide, cell bodies displayed a sudden increase in fluorescence, which could be an indication of mitochondrial dysfunction.

Astrocytes have been suggested to protect central nervous system neurons from oxidative stress. Because of this significance, these researchers aimed to develop an assay to detect oxidative stress in astrocytes in the presence of an external inducer. They did this by incubating astrocytes with hydrogen peroxide and the fluorescent probe for reactive oxygen species detection. Subsequent fluorescence generated was analyzed using a flow cytometer. Astrocytes activated for oxidative stress were observed to fall within a region of increased fluorescence intensity, seen shifted to the right.

You’ve just watched JoVE’s video on detecting reactive oxygen species or ROS. To sum up, in this video we discussed the link between reactive oxygen species, cell metabolism, and disease. We then examined the principle and procedure of an assay for reactive oxygen species detection. Finally, we explored how researchers are applying this method to their investigations. The analysis of the still enigmatic roles of reactive oxygen species is of great interest to cell biologists, and reliable measurement with fluorescent probes is proving to be invaluable. As always, thanks for watching!

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