4.12: Détection des dérivés réactifs de l'oxygène

Les espèces réactives de l’oxygène produites dans les cellules ont été impliquées dans l’homéostasie tissulaire, le vieillissement cellulaire et des états pathologiques comme le cancer. Comme leur nom l’indique, ces molécules proviennent de l’oxygène, qui existe naturellement sous la forme d’une molécule de dioxygène stable puisque tous ses électrons sont appariés. L’ajout d’un électron non apparié le rend instable et conduit à la formation de l’anion superoxyde, une forme d’espèce réactive de l’oxygène ou ROS. Outre l’anion superoxyde, il existe plusieurs types d’espèces réactives avec des électrons non appariés, dont la cellule vise à contrôler étroitement les niveaux.

Dans cette vidéo, nous allons apprendre comment les espèces réactives de l’oxygène sont liées au métabolisme cellulaire et aux maladies, explorer les principes qui sous-tendent un test pour sa détection à l’aide d’une sonde fluorescente, et nous passerons en revue un protocole généralisé pour ce test. Enfin, nous examinerons comment les scientifiques mettent en œuvre cette méthode dans les expériences aujourd’hui.

Tout d’abord, discutons de la façon dont les espèces réactives de l’oxygène sont produites et considérons leur influence sur le métabolisme cellulaire et la maladie.

Les mitochondries sont une source importante d’espèces réactives cellulaires de l’oxygène. Normalement, au cours du métabolisme cellulaire, les électrons sont transportés à travers une chaîne de complexes protéiques, ce qui aboutit à la réduction de l’oxygène moléculaire en eau et à la génération simultanée d’ATP. Malgré la régulation extraordinaire de ce processus, des électrons s’échappent, ce qui entraîne la formation d’anion superoxyde.

La présence d’un anion superoxyde donne rapidement naissance à d’autres formes d’espèces réactives de l’oxygène, telles que le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle. Ces radicaux, qui possèdent tous un électron non apparié très réactif, peuvent endommager par oxydation les membranes, l’ADN et les protéines. Pour contrer, la cellule maintient son propre stock antioxydant d’enzymes comme la superoxyde dismutase, ou de molécules comme la vitamine C, qui réduisent les radicaux libres. Tout déséquilibre dans ce système de défense peut entraîner une boucle de rétroaction positive potentiellement fatale, entraînant une condition d’espèces réactives de l’oxygène excessives connue sous le nom de stress oxydatif.

Les espèces réactives de l’oxygène ont été impliquées dans l’initiation et la progression du cancer. Un autre effet néfaste de ces molécules est l’induction du vieillissement cellulaire, également connu sous le nom de sénescence. Le? Théorie du vieillissement fondée sur les radicaux libres ? propose que les espèces réactives de l’oxygène produites dans les cellules au cours du métabolisme normal provoquent la sénescence et la mort cellulaires.

Jusqu’à présent, nous avons discuté des aspects négatifs de ces molécules hautement réactives, mais elles ont également des rôles positifs dans la physiologie cellulaire. Au cours des réponses immunitaires, lorsque les phagocytes engloutissent des agents pathogènes, les cellules montent une « explosion respiratoire » au cours de laquelle des quantités excessives d’espèces réactives de l’oxygène sont générées pour dégrader oxydativement les agents pathogènes. De plus, ils sont des intermédiaires et des régulateurs nécessaires d’une variété de voies de signalisation cellulaire, et peuvent même signaler la mort de cellules devenues cancéreuses.

Pour quantifier ces oxydants cellulaires influents, les scientifiques exploitent des molécules qui, lors de l’oxydation, deviennent fluorescentes. Une sonde couramment utilisée pour détecter les espèces réactives de l’oxygène est le diacétate de H2DCFDA ou dichloro-dihydro-fluorescéine, un analogue non fluorescent de la fluorescéine. Lorsqu’il est ajouté aux cellules, sa nature perméable cellulaire lui permet de diffuser passivement.

Ensuite, les estérases intracellulaires catalysent une réaction d’hydrolyse, qui entraîne le clivage des groupes d’acétate. Cela rend le composé plus polaire, de sorte qu’il est conservé dans la cellule. Lors de l’oxydation, qui implique l’élimination des atomes d’hydrogène par un large éventail d’espèces réactives de l’oxygène, le H2DCFDA non fluorescent est converti en dichloro-fluorescéine hautement fluorescente, ou DCF. Celle-ci peut être lue et quantifiée à l’aide d’un lecteur de plaques, d’un cytomètre en flux ou d’une microscopie à fluorescence.

Maintenant que vous savez comment fonctionne ce test, voyons comment il est réalisé en laboratoire.

Commencez par transférer les cellules cultivées dans un milieu de culture dans une solution saline tamponnée au phosphate, puis par centrifugation pour les laver. Retirez le surnageant et ajoutez la sonde fluorescente H2DCFDA solution. Incuber les cellules chargées de colorant dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment. Après l’incubation, lavez les cellules pour enlever le colorant déchargé et transférez les cellules dans une plaque. À ce stade, des inducteurs de stress oxydatif expérimentaux peuvent être ajoutés.

Lorsqu’elles sont prêtes à être analysées, les cellules peuvent être insérées dans le lecteur de plaques. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont réglées pour la fluorescéine. Après la lecture des plaques, les valeurs peuvent être analysées. Les résultats révèlent la quantité relative d’espèces réactives de l’oxygène entre les échantillons à des moments particuliers.

Maintenant que nous avons examiné le protocole réel, regardons comment il est appliqué dans les expériences aujourd’hui.

Les chercheurs utilisent souvent cette méthode pour étudier la mécanique de la phagocytose. Ce groupe de scientifiques voulait étudier la capacité du poisson-zèbre à développer une réponse immunitaire à différents stades de développement. Comme mentionné précédemment, la phagocytose entraîne la génération d’espèces à haute réactivité de l’oxygène, ou « un sursaut respiratoire », qui est utilisé pour tuer les agents pathogènes. Étant donné que l’enzyme NADPH oxydase est un producteur important de ROS dans les cellules phagocytaires, ces scientifiques ont induit la réponse en rafale en traitant le poisson zèbre avec un inducteur de NADPH. Les résultats ont démontré que parmi les embryons de poisson-zèbre, dont le « burst » La réponse avait été provoquée, ceux à 72 heures après la fécondation présentaient un développement plus élevé des espèces réactives de l’oxygène que ceux à 48 heures après la fécondation.

Le dysfonctionnement mitochondrial dû à l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène est une caractéristique pathologique de nombreuses maladies. Par conséquent, les chercheurs peuvent identifier le dysfonctionnement mitochondrial en mesurant le niveau de stress oxydatif. Ici, les scientifiques ont chargé H2DCFDA sur des neurones, puis ont monté les échantillons sur un microscope à fluorescence. En plus d’un facteur de stress oxydatif, comme le peroxyde d’hydrogène, les corps cellulaires ont montré une augmentation soudaine de la fluorescence, ce qui pourrait être une indication de dysfonctionnement mitochondrial.

Il a été suggéré que les astrocytes protègent les neurones du système nerveux central du stress oxydatif. En raison de cette importance, ces chercheurs ont cherché à développer un test pour détecter le stress oxydatif dans les astrocytes en présence d’un inducteur externe. Pour ce faire, ils ont incubé des astrocytes avec du peroxyde d’hydrogène et la sonde fluorescente pour la détection des espèces réactives de l’oxygène. La fluorescence générée par la suite a été analysée à l’aide d’un cytomètre en flux. On a observé que les astrocytes activés pour le stress oxydatif se trouvaient dans une région d’intensité de fluorescence accrue, déplacée vers la droite.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la détection des espèces réactives de l’oxygène ou ROS. Pour résumer, dans cette vidéo, nous avons discuté du lien entre les espèces réactives de l’oxygène, le métabolisme cellulaire et la maladie. Nous avons ensuite examiné le principe et la procédure d’un test de détection des espèces réactives de l’oxygène. Enfin, nous avons exploré comment les chercheurs appliquent cette méthode à leurs enquêtes. L’analyse des rôles encore énigmatiques des espèces réactives de l’oxygène est d’un grand intérêt pour les biologistes cellulaires, et des mesures fiables avec des sondes fluorescentes s’avèrent inestimables. Comme toujours, merci d’avoir regardé !