Marquage à l'annexine V et à l'iodure de propidium

Annexin V et propidium labels de cellules l’iodure (PI) est une technique utilisée pour identifier la mort cellulaire et de faire la distinction entre ses différentes voies : l’apoptose, ou programmé la mort cellulaire et la nécrose. Les cellules subissent des changements morphologiques distincts selon la voie. En identifiant les conditions spécifiques qui entraînent une cellule pour subir une apoptose ou nécrose, scientifiques avoir aperçu de physiologie cellulaire et la physiopathologie de la maladie. Annexin V et PI, étiquetage, suivi par cytométrie en flux, a été établie comme l’une des méthodes plus efficaces pour classer le type de mort cellulaire.

Aujourd'hui, nous allons décrire comment ce test aide à l’identification des voies de mort cellulaire, comment réaliser cette technique et certaines expériences exemple passionnant qui utilisent cette méthode pour répondre à des questions importantes dans le domaine de la biologie cellulaire.

Tout d’abord, nous allons jeter un regard sur les principes qui sous-tendent l’annexine V et PI la coloration.

Comme mentionné précédemment, les cellules apoptotiques pièce particularités morphologiques. Il s’agit de rétrécissement de la cellule, blebbing membrane, fragmentation nucléaire et l’apparition de corps apoptotiques. En outre, après induction de l’apoptose — autrement dit, dès les premiers stades de l’apoptose — certains changements caractéristiques apparaissent sur la membrane. Une membrane cellulaire normale a tous la phosphatidylsérine ou résidus de PS sur le feuillet interne. Toutefois, dans les cellules apoptotiques précoces, certains de ces résidus de PS sont transportés à l’extérieur, mais comment ?

Pour comprendre cela, nous allons faire un pas en arrière. Durant l’apoptose, c’est bien connu que les caspases cytosoliques sont activés. Ces enzymes à son tour activent une enzyme membranaire appelée scramblase. Scramblase « brouille » la membrane cellulaire par translocation résidus PS du côté cytoplasmique à l’extérieur. En revanche, au cours de la nécrose PS résidus restent où ils sont, mais la membrane elle-même se rompt. Annexin V et PI étiquetage capitaliser sur ces différences entre les modifications de la membrane des deux types de mort cellulaire.

Annexine V conjugué avec un colorant fluorescent, tels que l’isothiocyanate de fluorescéine — communément appelé FITC — est un ligand de membrane imperméable, naturelle pour le PS et donc facilement identifie les cellules apoptotiques précoces en se liant au PS externalisé. Cependant, suite à la rupture des membranes, qui se produit au cours de la nécrose et également au cours des étapes ultérieures de l’apoptose, annexine peut également lier au PS sur la face interne et produire des faux positifs.

Pour éviter cela, les scientifiques utilisent PI. Cette molécule de colorant de liaison ADN est encore membrane imperméable et ne peut entrer qu’une cellule lorsque la membrane est rompue. Par conséquent, si une cellule est seul annexine tachée elle est apoptose précoce, tandis qu’une cellule fois PI et annexine teinté peut être fin ou nécrotique apoptotic.

Maintenant que vous avez appris les principes de base derrière ce dosage, Let ' s go par le biais de la procédure de coloration et d’analyser la mort cellulaire.

Tout d’abord, cellules sont récoltées et centrifugés à vitesse réduite pour éviter toute perturbation morphologique et resuspendues dans un tampon de lavage physiologiques comme la solution saline tamponnée au phosphate, également connu sous le nom de PBS. Suite à une autre étape de centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans l’annexine V, tampon de liaison contenant du calcium, ce qui est nécessaire pour l’annexine liaison à PS. annexine V conjugué FITC est ensuite ajouté à la solution, qui est incubée à température ambiante dans l’obscurité pour permettre l’annexine et association de PS. Dans l’étape suivante, PI est directement ajouté à la coloration de la solution de cellules annexine et incubée dans l’obscurité. Après incubation, les cellules sont lavées dans du PBS par centrifugation, resuspendues dans un tampon de lavage et gardés sur glace. Ils sont maintenant prêts pour l’analyse.

Activité de la fluorescence des cellules est analysée par cytométrie en flux, une technique utilisant le laser qui capture les données de fluorescence des cellules en suspension dans un courant de fluide. Après calibration de fluorescence à l’aide de cellules colorées séparément avec chaque colorant, données de cellules colorées doubles sont acquises. Signaux de fluorescence de la population cellulaire sont utilisés pour créer un terrain où l’intensité FITC annexine-bound est tracée sur l’axe des abscisses logarithmique et PI sur l’axe y logarithmique. Cellules qui sont annexine-FITC positif et négatif de PI seront en cluster sur le côté droit inférieur de l’intrigue, qui représente les cellules apoptotiques précoces, et positif double de cellules pour l’annexine-FITC et PI se produira dans le coin supérieur droit, représentant l’apoptose tardive ou cellules nécrosées. Les cellules qui restent incolores ou légèrement teinté annexine et PI sont des cellules vivantes.

Puisque vous savez maintenant pourquoi les biologistes cellulaires s’appuient sur cette technique pour étudier la mort cellulaire, pourquoi ne nous passons en revue certaines de ses applications.

En utilisant cette procédure, les scientifiques peuvent suivre quelles protéines intracellulaires sont impliqués dans l’apoptose. Dans cette vidéo, les chercheurs ont analysé l’effet de cisplatine, un médicament contre le cancer, des cellules de rein normal pour voir si il induit l’apoptose. Un ensemble de cellules a été transduite pour surexprimer une forme active de l’enzyme protéine kinase C, ou PKC, et l’autre groupe était transduite avec une forme non fonctionnelle — PKC négative dominante. Les cellules exprimant PKC et traités par cisplatine a subi l’apoptose au fil du temps, mais les cellules exprimant la PKC négative dominante inactif étaient résistants à l’apoptose, ce qui indique que l’enzyme est un acteur clé dans la voie de l’apoptose induite par le cisplatine.

Chercheurs utilisent également ces taches pour tester le potentiel cytotoxique des cellules T spécifiques. Les cellules T cytotoxiques peuvent reconnaître les protéines membranaires spécifiques sur la cellule cible et induire sa mort lors de la liaison à elle. Ici, les chercheurs incubés lymphocytes T spécifiques de l’antigène avec les cellules cibles tumorales et annexin V et ensuite observé l’induction de l’apoptose des cellules tumorales par engagement de lymphocytes T. Cytométrie en flux de données a révélé le pourcentage de la mort des cellules cibles en présence et en absence de cellules T cytotoxiques.

Enfin, les scientifiques utilisent cette méthode pour évaluer la viabilité des cellules après la livraison de gène. Dans ce cas, les chercheurs ont voulu évaluer la survie des cellules après nucleofection — une méthode qui utilise une combinaison de produits chimiques et un champ électrique appliqué pour créer transitoire des pores dans les membranes cellulaires et nucléaires, facilitant ainsi la livraison de gène. En utilisant l’annexin V plus un colorant appelé D 7-aminoactinomycine ou 7-AAD, qui, semblables aux PI se lie à l’ADN, ils ont montré que la mort cellulaire faible nucleofection causée par nécrose ou apoptose.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur annexine V et PI étiquetage. Dans cette vidéo, nous brièvement discuté les caractéristiques distinctives d’apoptotiques et nécrotiques cellules, examiné les principes derrière cette méthode, regardé une procédure généralisée pour cela couramment employé technique et en avant-première certaines applications. Compte tenu de l’importance de comprendre comment les différentes cellules meurent dans des conditions différentes, annexine V et PI étiquetage sert comme un outil important pour les biologistes cellulaires intéressé par ce phénomène. Comme toujours, Merci pour regarder !