4.15: Marquage à l'annexine V et à l'iodure de propidium

Le marquage des cellules à l’annexine V et à l’iodure de propidium (PI) est une technique utilisée pour identifier la mort cellulaire et distinguer ses différentes voies : l’apoptose, ou mort cellulaire programmée, et la nécrose. Les cellules subissent des changements morphologiques distincts en fonction de la voie. En identifiant les conditions spécifiques qui amènent une cellule à subir une apoptose ou une nécrose, les scientifiques acquièrent un aperçu de la physiologie cellulaire et de la physiopathologie de la maladie. Le marquage de l’annexine V et de l’IP, suivi d’une cytométrie en flux, s’est avéré être l’une des méthodes les plus efficaces pour catégoriser le type de mort cellulaire.

Aujourd’hui, nous décrirons comment ce test aide à identifier les voies de mort cellulaire, comment effectuer cette technique, et quelques exemples d’expériences passionnantes qui utilisent cette méthode pour répondre à des questions importantes dans le domaine de la biologie cellulaire.

Tout d’abord, jetons un coup d’œil aux principes qui sous-tendent la coloration à l’annexine V et à l’IP.

Comme mentionné précédemment, les cellules apoptotiques présentent des caractéristiques morphologiques distinctives. Il s’agit notamment du rétrécissement cellulaire, de la coloration membranaire, de la fragmentation nucléaire et de l’apparition de corps apoptotiques. De plus, à la suite de l’induction de l’apoptose, c’est-à-dire au stade précoce de l’apoptose, certains changements caractéristiques apparaissent sur la membrane. Une membrane cellulaire normale a tous les résidus de phosphatidylsérine ou PS sur le feuillet interne. Cependant, dans les cellules apoptotiques précoces, certains de ces résidus de PS sont transloqués vers la surface externe, mais comment ?

Pour comprendre cela, prenons un peu de recul. Au cours de l’apoptose, il est bien connu que les caspases cytosoliques sont activées. Ces enzymes activent à leur tour une enzyme liée à la membrane appelée scramblase. Scramblase ?brouillages ? la membrane cellulaire en transloquant les résidus de PS du côté cytoplasmique vers la surface externe. En revanche, lors de la nécrose, les résidus de PS restent là où ils sont, mais la membrane elle-même se rompt. L’annexine V et le marquage PI capitalisent sur ces différences dans les altérations membranaires des deux types de mort cellulaire.

L’annexine V conjuguée à un colorant fluorescent, tel que l’isothiocyanate de fluorescéine – communément appelé FITC – est un ligand naturel imperméable à la membrane pour le PS, et identifie donc facilement les cellules apoptotiques précoces en se liant au PS externalisé. Cependant, après la rupture de la membrane, qui se produit pendant la nécrose et également au cours des stades ultérieurs de l’apoptose, l’annexine peut également se lier au PS sur la face interne et donner des faux positifs.

Pour éviter cela, les scientifiques utilisent l’IP. Cette molécule de colorant de liaison à l’ADN est à nouveau imperméable à la membrane et ne peut pénétrer dans une cellule que lorsque la membrane est rompue. Par conséquent, si une cellule n’est colorée qu’à l’annexine, elle est apoptotique précoce, tandis qu’une cellule qui est à la fois colorée à l’IP et à l’annexine pourrait être soit nécrotique, soit apoptotique tardive.

Maintenant que vous avez appris les principes de base de ce test, passons en revue la procédure de coloration et d’analyse de la mort cellulaire.

Tout d’abord, les cellules sont récoltées et centrifugées à basse vitesse pour éviter toute perturbation morphologique, puis remises en suspension dans un tampon de lavage physiologique tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate, également connue sous le nom de PBS. Après une autre étape de centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon de liaison à l’annexine V contenant du calcium, qui est nécessaire à la liaison de l’annexine à la PS. L’annexine V conjuguée à la FITC est ensuite ajoutée à la solution, qui est incubée à température ambiante dans l’obscurité pour permettre l’association de l’annexine et de la PS. Dans l’étape suivante, l’IP est directement ajouté à la solution cellulaire de coloration à l’annexine et incubé dans l’obscurité. Après l’incubation, les cellules sont lavées dans du PBS par centrifugation, remises en suspension dans un tampon de lavage et maintenues sur de la glace. Ils sont maintenant prêts à être analysés.

L’activité de fluorescence des cellules est analysée par cytométrie en flux, une technique basée sur le laser qui capture les données de fluorescence de cellules uniques en suspension dans un flux de fluide. Après l’étalonnage de la fluorescence à l’aide de cellules colorées séparément avec chaque colorant, des données provenant de cellules à double coloration sont acquises. Les signaux de fluorescence de la population cellulaire sont utilisés pour créer un graphique où l’intensité FITC liée à l’annexine est tracée sur l’axe des X logarithmique et PI sur l’axe des Y logarithmique. Les cellules qui sont positives pour l’annexine-FITC et PI négatives se regrouperont en bas à droite du graphique, représentant les cellules apoptotiques précoces, et les cellules doublement positives pour l’annexine-FITC et PI se produiront en haut à droite, représentant les cellules apoptotiques ou nécrotiques tardives. Les cellules qui restent non colorées ou insignifiantes pour l’annexine et l’IP sont des cellules vivantes.

Puisque vous savez maintenant pourquoi les biologistes cellulaires s’appuient sur cette technique pour étudier la mort cellulaire, pourquoi ne pas examiner certaines de ses applications.

En utilisant cette procédure, les scientifiques peuvent suivre quelles protéines intracellulaires sont impliquées dans l’apoptose. Dans cette vidéo, les chercheurs ont analysé l’effet du cisplatine, un médicament anticancéreux, sur les cellules rénales normales pour voir s’il induit l’apoptose. Un ensemble de cellules a été transduit pour surexprimer une forme active de l’enzyme protéine kinase C, ou PKC, et l’autre ensemble a été transduit avec une forme non fonctionnelle dominante de PKC négative. Les cellules exprimant la PKC et traitées avec du cisplatine ont subi une apoptose au fil du temps, mais les cellules exprimant la PKC négative dominante inactive étaient résistantes à l’apoptose, ce qui indique que l’enzyme est un acteur clé dans la voie de l’apoptose induite par le cisplatine.

Les chercheurs utilisent également ces colorants pour tester le potentiel cytotoxique de cellules T spécifiques. Les lymphocytes T cytotoxiques peuvent reconnaître des protéines membranaires spécifiques sur leur cellule cible et induire leur mort en se liant à celle-ci. Ici, les chercheurs ont incubé des lymphocytes T spécifiques de l’antigène avec des cellules tumorales cibles et de l’annexine V, puis ont observé l’induction de l’apoptose des cellules tumorales par l’engagement des lymphocytes T. Les données de cytométrie en flux ont révélé le pourcentage de mort cellulaire cible en présence et en l’absence de lymphocytes T cytotoxiques.

Enfin, les scientifiques utilisent cette méthode pour évaluer la viabilité cellulaire après l’administration de gènes. Dans ce cas, les chercheurs voulaient évaluer la survie cellulaire après la nucléofection, une méthode qui utilise une combinaison de produits chimiques et un champ électrique appliqué pour créer des pores transitoires dans les membranes cellulaires et nucléaires, facilitant ainsi l’administration de gènes. En utilisant l’annexine V plus un colorant appelé 7-aminoactinomycine D ou 7-AAD, qui, comme l’IP se lie à l’ADN, ils ont montré que la nucléofection provoquait une faible mort cellulaire par apoptose ou nécrose.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’étiquetage de l’annexine V et de l’IP. Dans cette vidéo, nous avons brièvement discuté des caractéristiques distinctives des cellules apoptotiques et nécrotiques, passé en revue les principes de cette méthode, regardé une procédure généralisée pour cette technique couramment utilisée et présenté en avant-première certaines applications. Étant donné l’importance de comprendre comment différentes cellules meurent dans différentes conditions, le marquage de l’annexine V et de l’IP, constitue un outil important pour les biologistes cellulaires qui s’intéressent à ce phénomène. Comme toujours, merci d’avoir regardé !