Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

L’objectif global de cette méthode est de marquer et de visualiser des chromosomes vivants dans des cellules mitotiques à l’aide du marqueur Histone 2B-GFP BacMam 2.0 et d’un système de microscopie confocale à disque rotatif. Cette méthode peut être utilisée pour visualiser les chromosomes mitotiques dans des cellules cultivées afin d’étudier les effets des modifications génétiques ou des traitements médicamenteux sur la ségrégation des chromosomes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser des chromosomes vivants dans les cellules mitotiques.

Le docteur Kazuyo Takeda, qui gère la plateforme de microscopie et d’imagerie de la division des produits viraux du Centre d’évaluation et de recherche sur les produits biologiques de la FDA, fera la démonstration de la procédure d’imagerie en direct. Les fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF, utilisés dans cette expérience sont cultivés dans un verre de couverture à deux chambres à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant la nuit, comme décrit dans le protocole de texte. Le lendemain, synchroniser les MEF en phase G0/G1 en les incubant dans un milieu de croissance DMEM/F12 contenant 0,1 % FBS.

Le jour de l’étiquetage, préparez une solution mère de nocodazole dans du DMSO de 1,5 milligramme par millilitre. Une étape critique consiste à calculer la bonne quantité de particules CL-HB par cellule afin d’obtenir un marquage suffisant pour la visualisation des chromosomes sans toxicité pour les cellules. Nous avons précédemment déterminé, par des expériences de titrage, que 30 PPC fonctionnent le mieux.

Ajoutez aux MEF, 200 microlitres de milieu de croissance avec 10 % de FCS, 200 nanogrammes par millilitre de nocodazole et le réactif CL-HB à 30 particules par cellule. Incuber les MEF à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant 18 heures. La visualisation des MEF est réalisée à l’aide d’un système de microscope confocal à disque rotatif équipé d’une chambre environnementale et d’une lentille d’objectif 63X à immersion dans l’huile.

Un jour avant l’imagerie, allumez la chambre environnementale et réchauffez toute la chambre à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mettez sous tension le support de microscope, l’appareil photo, l’unité de disque rotatif, l’illuminateur, le laser à argon, l’ordinateur et la platine motorisée. Après avoir laissé le système se réchauffer pendant trois minutes, démarrez le laser à argon en allumant la clé de contact.

Basculez l’interrupteur à bascule du laser à argon de la veille à l’exécution laser. Lancez le logiciel d’acquisition et de traitement des données. Lancez le régulateur de CO2 de l’incubateur supérieur de la platine et réglez la concentration de CO2 à 5 %. Retirez le verre de protection de la chambre de l’incubateur, placez-le sur la platine du microscope et sélectionnez l’objectif d’immersion dans l’huile 63X.

Visualisez à travers les lentilles oculaires, faites la mise au point de l’image et identifiez une cellule au stade de la rupture de l’enveloppe nucléaire, ou NEBD. Lancez le laser à argon de 488 nanomètres pour visualiser l’histone 2B-GFP. Ouvrez la fenêtre de contrôle d’acquisition et réglez le temps d’exposition pour le canal GFP.

Identifiez une cellule qui se trouve dans NEBD. Ensuite, déterminez manuellement les plans focaux supérieur et inférieur de la cellule et entrez les paramètres de sectionnement optique XYZ. Observez la cellule pendant 20 minutes.

Il est important de savoir que, puisque toutes les cellules ne passeront pas par la mitose, la progression mitotique doit être activement surveillée. Si la cellule ne procède pas à la division cellulaire après 20 minutes, arrêtez l’acquisition de l’image et passez à la cellule suivante qui est en NEBD. Pour obtenir les données d’un film, prenez des photos toutes les trois minutes.

Environ une heure par cellule est nécessaire pour imager les chromosomes retardés pendant la mitose dans les cellules gamma PP2A-B56 qui se sont échappées du point de contrôle de l’assemblage du fuseau. Enregistrez les images au format de fichier ZVI pour une analyse plus approfondie. L’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le devenir des cellules individuelles au fur et à mesure de leur progression de la NEBD à la mitose.

Après le traitement au nocodazole, les 21 cellules de type sauvage observées ont été arrêtées en métaphase. En revanche, sur les 21 cellules dépourvues de PP2A-B56-gamma observées, 16 ont pu passer par une mitose après un traitement au nocodazole. De plus, une ségrégation chromosomique anormale a été détectée dans 13 de ces MEF.

Un exemple d’une cellule gamma PP2A-B56 subissant une mauvaise ségrégation chromosomique est montré dans ce clip vidéo. Une fois maîtrisée, cette technique prendra trois à quatre jours selon le traitement cellulaire avant le protocole de marquage. Il est important de se rappeler qu’il s’agit d’une transfection transitoire et que les signaux ne peuvent être détectés que jusqu’à cinq jours.

Ce protocole peut être utilisé pour répondre à des questions supplémentaires liées à la régulation du cycle cellulaire, à l’instabilité génomique et à la qualité des produits de thérapie cellulaire. Après son développement, cette technique pourrait être utilisée pour étudier l’imagerie en direct des chromosomes dans une grande variété de lignées cellulaires, telles que les lignées cellulaires primaires, les cellules souches, les neurones et les lymphocytes T immortalisés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer et de visualiser facilement des chromosomes vivants dans les cellules mitotiques à l’aide du marqueur Histone 2B-GFP BacMam 2 et d’un système de microscopie confocale à disque rotatif.