La cartographie simultanée et au dosage des ribonucléotides dans l’ADN Mitochondrial humain

L’objectif global de cette expérience est de cartographier l’emplacement des ribonucléotides incorporés au niveau de résolution d’un seul nucléotide et de quantifier le nombre de ribonucléotides présents dans l’ADN mitochondrial humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l’intégrité de l’ADN, les mécanismes de réplication de l’ADN, les mécanismes de réparation de l’ADN et comment les défauts de l’un de ces mécanismes causent la maladie. Le principal avantage de cette méthode est que l’emplacement et le nombre de ribonucléotides incorporés dans l’ADN mitochondrial peuvent être déterminés en une seule expérience.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la teneur en ribonucléotides de l’ADN mitochondrial humain, elle peut également être appliquée pour étudier la teneur en ADN nucléaire et en ribonucléotides dans les génomes de séquences d’autres organismes modèles. L’ADN génomique précédemment isolé à partir de cellules HeLa et décrit dans les sections deux et trois du protocole textuel est utilisé dans cette expérience. Pour digérer l’ADN, mélangez soigneusement ce qui suit dans un tube de microfuge.

Un microgramme d’ADN, cinq microlitres de tampon 10X 3.1, un microlitre de HincII et de l’eau sans nucléases jusqu’à un volume final de 50 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la digestion terminée, ajoutez 1,8 volume de billes paramagnétiques à chaque échantillon, soigneusement mélangées par pipetage, et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Placez les tubes sur une grille magnétique pendant cinq minutes pour granuler les billes, puis retirez et jetez le surnageant. Lavez le granulé avec 150 microlitres d’éthanol à 70 % pendant environ 30 secondes, puis retirez et jetez le surnageant. Répétez le lavage avec 200 microlitres d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes supplémentaires.

Faites sécher les échantillons à température ambiante pendant environ 15 à 20 minutes. Ensuite, retirez les tubes du rack magnétique. Éluez chaque pastille dans 45 microlitres de tampon d’élution, mélangé par pipetage soigneusement, et incubez pendant cinq minutes.

Pelletez les billes sur le support magnétique et transférez 45 microlitres de chaque échantillon d’ADN dans un nouveau tube. À chaque 45 microlitres d’ADN isolé ou purifié, ajoutez cinq microlitres d’hydroxyde de potassium à trois molaires ou cinq microlitres de chlorure de potassium à trois molaires, créant un volume total de 50 microlitres. Les huit réactions sont résumées dans ce tableau.

Incuber dans un four d’hybridation à 55 degrés Celsius pendant deux heures, puis incuber les échantillons sur de la glace pendant cinq minutes. Précipitez l’ADN en ajoutant 10 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires à pH 5,2 et 125 microlitres d’éthanol froid à 100 % et incubez sur de la glace pendant cinq minutes. Granulez l’ADN en le centrifugeant à 21 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et lavez chaque pastille d’ADN avec 250 microlitres d’éthanol froid, à 70 %, centrifugez-le à nouveau et jetez le surnageant. Laissez sécher la pastille dans le tube ouvert pendant environ cinq à 10 minutes, jusqu’à ce que tout liquide visible se soit évaporé. Enfin, ajoutez 20 microlitres de tampon d’élution et laissez la pastille d’ADN se dissoudre à température ambiante pendant 30 minutes.

Commencez cette procédure en préparant le mélange réactionnel pour chaque échantillon en tant que mélange maître. Pour chaque échantillon, ajoutez 2,5 microlitres de tampon de réaction polynucléotide kinase 10x T4, 2,5 microlitres d’ATP et un microlitre de trois polynucléotides kinases phosphatase moins T4. Transférez 19 microlitres de chaque échantillon d’ADN dans un nouveau tube de 200 microlitres et dénaturez à 85 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant trois minutes.

Ensuite, refroidissez les échantillons d’ADN sur de la glace et ajoutez six microlitres du mélange réactionnel préparé à chaque échantillon. Incuber les mélanges réactionnels à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour arrêter la réaction. Purifier l’ADN à l’aide de billes paramagnétiques, comme démontré précédemment, mais éluer avec 14 microlitres de tampon d’élution.

Préparez à l’avance le mélange réactionnel en tant que mélange principal, en contenant les éléments suivants pour chaque échantillon. Cinq microlitres de tampon de réaction 10x T4 RNA ligase, cinq microlitres de chlorure d’hexamminecobalt(III), 0,5 microlitre d’oligonucléotide ARC140, 0,5 microlitre d’ATP et 25 microlitres de 50 % PEG 8000. Bien mélanger par pipetage.

Transférez 13 microlitres de chaque ADN purifié dans un nouveau tube de 200 microlitres et dénaturez à 85 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant trois minutes. Refroidissez l’ADN sur de la glace, puis ajoutez 36 microlitres de mélange réactionnel à chaque échantillon, mélangez par pipetage et tournez brièvement. Ajoutez un microlitre d’ARN ligase T4 à chaque réaction, mélangez par pipetage et tournez brièvement.

Incuber les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit. Lorsque la ligature de l’ADN simple brin est terminée, purifiez l’ADN comme démontré précédemment, mais utilisez 0,8 volume de billes paramagnétiques et granulez les billes pendant 10 minutes. Éluez dans 20 microlitres de tampon d’élution et transférez 20 microlitres de chaque échantillon d’ADN dans un nouveau tube de 200 microlitres.

Répétez la purification avec 0,8 volume de billes paramagnétiques, et éluez avec 14 microlitres de tampon d’élution. Pour chaque échantillon, préparez le mélange réactionnel sous la forme d’un mélange maître composé de deux microlitres de tampon réactionnel d’ADN polymérase 10x T7, de deux microlitres d’ARC76/77, de deux microlitres de dNTP et de 0,8 microlitre de BSA. Transférez 12,8 microlitres d’ADN purifié dans un nouveau tube de 200 microlitres et dénaturez à 85 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant trois minutes.

Refroidissez l’ADN sur de la glace, puis ajoutez 6,8 microlitres de mélange réactionnel à chaque échantillon, mélangez par pipetage, tournez brièvement et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez 0,4 microlitre d’ADN polymérase T7 à chaque réaction et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir purifié l’ADN à l’aide de billes paramagnétiques, éluez dans 11 microlitres de tampon d’élution.

Pour commencer l’amplification par PCR, préparez le mélange réactionnel séparément pour chaque échantillon dans un nouveau tube de 200 microlitres composé de 7,5 microlitres d’ARC49, de 7,5 microlitres d’amorce d’index unique et de 25 microlitres de mélange prêt à l’emploi 2X à chaud. Ajoutez 10 microlitres d’échantillon d’ADN à chaque réaction. Amplifiez la bibliothèque à l’aide des conditions suivantes.

Dénature à 95 degrés Celsius pendant 45 secondes, suivie de 18 cycles de 98 degrés Celsius pendant 15 secondes, 65 degrés Celsius pendant 30 secondes, 72 degrés Celsius pendant 30 secondes et se terminant par un allongement final à 72 degrés Celsius pendant deux minutes. Maintenez les échantillons à quatre degrés Celsius après l’amplification. Purifier les bibliothèques comme décrit dans le protocole de texte et éluer dans 20 microlitres de tampon TE.

Déterminez la qualité et la taille moyenne des fragments de chaque bibliothèque à l’aide d’un système d’électrophorèse numérique. Les résultats représentatifs de profils de banques appropriés après traitement à l’hydroxyde de potassium ou au chlorure de potassium sont présentés. Après avoir calculé la concentration de chaque bibliothèque, prélevez des quantités molaires égales d’un maximum de 24 bibliothèques amplifiées avec différentes amorces d’indice pour le séquençage, comme décrit dans les sections neuf et 10 du protocole de texte.

Ajouter le tampon TE à un volume final de 25 microlitres et une concentration de 10 nanomolaires. Après le séquençage, effectuer l’analyse des données bioinformatiques comme spécifié à la section 11 du protocole texte. Ces graphiques montrent les lectures résumées à tous les sites HincII dans l’ADN mitochondrial humain à brins légers et à brins lourds après traitement au chlorure de potassium.

Environ 70 % de tous les cinq premiers atomes détectés sont localisés sur les sites de coupe, démontrant ainsi la grande efficacité de la digestion HincII. Le traitement des banques avec de l’hydroxyde de potassium pour hydrolyser l’ADN au niveau des ribonucléotides intégrés réduit le nombre de lectures à HincII à environ 40 %Le nombre relatif de lectures dans l’ADN mitochondrial et nucléaire révèle des différences de couverture et illustre l’importance d’une normalisation appropriée pour éliminer le biais de brin. La normalisation du nombre de lectures à HincII donne une mesure quantitative du nombre de ribonucléotides par génome mitochondrial sur le brin lourd ou léger.

Les lectures après traitement à l’hydroxyde de potassium pour chaque ribonucléotide, normalisées à la composition de séquence de chaque brin, montrent un rapport différent de un, indiquant une distribution non aléatoire des lectures et suggérant un motif ribonucléotidique distinct et une qualité de banque élevée. La normalisation des lectures aux sites des ribonucléotides intégrés à celles des sites HincII, ainsi qu’à la teneur en nucléotides du génome, génère une mesure quantitative du nombre de chaque ribonucléotide incorporé pour 1 000 bases complémentaires. Une fois maîtrisé, ce protocole peut se faire en deux jours s’il est exécuté correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder l’ADN très intact et d’éviter d’introduire des cassures double brin lors de la préparation de la banque. Suite à cette procédure, d’autres méthodes peuvent être effectuées afin de confirmer les données de quantification des ribonucléotides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des banques pour la cartographie et la quantification des ribonucléotides et de l’ADN à l’aide du séquençage de nouvelle génération.

N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques comme l’hydroxyde de potassium peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’une protection oculaire et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.