Une méthode de rendement efficace et haute pour l'isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

L’objectif global de ce protocole est de développer une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour générer des cellules dendritiques ou des DC, qui reflètent fatalement leur divergence phénotypique et fonctionnelle in vivo. Les cellules dendritiques existent en grandes populations dans les organes lymphoïdes. Par conséquent, nous utilisons un ligand filtre pour augmenter la fréquence de ces cellules essentielles dans les tissus du donneur afin de faciliter cet isolement.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine la génération de tous les sous-ensembles de DC en nombre approprié pour l’analyse en utilisant uniquement les agents disponibles dans le commerce. Pour récolter le ligand flt-3 exprimant les cellules de mélanome B16 à partir d’une culture confluente à 90 %, lavez d’abord les cellules avec du PBS et incubez la culture avec 05 % de trypsine à 37 degrés Celsius. Après 5 minutes, éteignez l’activité de la protéase avec 20 millilitres de milieu dima complet à 4 degrés Celsius et détachez la couche du modèle cellulaire adhérent avec un léger tapotement et un pipetage doux.

Collectez les cellules par centrifugation et comptez-les. Ensuite, ré-suspendez la suspension unicellulaire à une concentration de 1 fois à la concentration de 8 cellules par millilitre dans le PBS pour leur injection sous-cutanée dans des souris receveuses C57 black 6. Lorsque la tumeur atteint deux à dix millilitres de diamètre, récoltez les rates des animaux porteurs de tumeurs et placez les rates dans une boîte de Pétri contenant un milieu RPMI frais.

À l’aide d’un scalpel, coupez les tissus en morceaux de 0,2 centimètre carré, puis incubez les fragments dans dix millilitres de collagénase et de Dnase à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, versez la boue de tissu partiellement digérée sur une passoire cellulaire de 70 microns et utilisez un piston de seringue de cinq millilitres pour presser les fragments de tissu restants à travers le grillage de la passoire. Rincez le filtre avec 10 millilitres de milieu frais, en regroupant le lavage avec le reste de la suspension à cellule unique et granulez les cellules.

Nous suspendons la pastille cellulaire dans 2 millilitres de tampon de lyse des globules rouges à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules dans 10 millilitres de milieu RPMI frais, et remettez-les en suspension à 1 fois 10 à 8 cellules par millilitre dans un tampon de tri cellulaire contenant le bloc FC. Pour isoler les DC de cytode plasmatique, mélangez soigneusement 300 microlitres de cocktail d’anticorps marqués à la biotine à partir d’un kit d’isolement de DC de cytode plasmatique avec 200 microlitres de suspension de cellule unique splénique.

Placez les cellules dans un bain d’eau glacée pendant 15 minutes, en tapotant doucement toutes les trois minutes. Ensuite, lavez les cellules avec 12 millilitres de tampon de tri cellulaire et remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon de tri frais. Ensuite, incubez les cellules dans 300 microlitres de billes conjuguées d’anti-biotine et d’anticorps pendant encore 15 minutes dans l’eau glacée en tapotant régulièrement.

Après avoir lavé les cellules dans un tampon de tri frais, remettez la palette en suspension dans 2 millilitres de tampon de tri cellulaire et chargez une colonne magnétique de taille appropriée sur son aimant correspondant. Équilibrez la colonne avec cinq millilitres de tampon de tri de cellules fraîches à 4 degrés Celsius. Lorsque toute la mémoire tampon s’est écoulée du haut de la colonne, ajoutez soigneusement les cellules au centre de la surface de la tête de colonne et récupérez le flux.

Ensuite, lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon de tri frais à 4 degrés Celsius et collectez le flux dans le même tube. Après le passage dans une deuxième colonne magnétique, on peut s’attendre à une population de cellules dendritiques de cytode plasmatique d’une pureté supérieure à 94 %. Pour isoler les CD8aplha+ et CD8alpha-DC, mélangez le reste de la suspension de cellules spléniques avec 100 microlitres de cocktail d’anticorps conjugués à la biotion d’un kit d’isolement de cellules dendritiques CD8alpha++, pendant 15 minutes sur de la glace en tapotant doucement, comme cela vient d’être démontré.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans 12 millilitres de tampon de tri cellulaire à 4 degrés Celsius et remettez le granulé en suspension dans 150 microlitres de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius. Ensuite, mélangez les cellules avec 100 microlitres du kit d’isolement de cellules CD8alpha+dendritiques en billes anti-biotine. Après 15 minutes sur de la glace en tapotant doucement, lavez les cellules dans 10 millilitres de tampon de tri cellulaire à 4 degrés Celsius et remettez le granulé en suspension dans 1 millilitre de tampon de tri frais à 4 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, triez les cellules par séparation par billes magnétiques, comme nous venons de le démontrer, en recueillant le flux et le premier lavage. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius. Étiquetez maintenant les cellules avec 200 microlitres de billes magnétiques conjuguées anti-CD8aplha du kit, et faites passer les cellules à travers une nouvelle colonne, en recueillant le flux de cellules CD8alpha-dendritiques.

Pour collecter les CD8alpha+DC, transférez la colonne dans un tube conique de 15 millilitres et plongez 5 millilitres de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius dans la colonne. Après avoir fait passer les cellules dans une deuxième colonne, on peut s’attendre à une population de cellules CD8alpha+dendritiques supérieure à 96 %. Pour isoler les cellules CD8alpha, faites tourner la suspension cellulaire CD8alpha.

Ensuite, étiquetez les cellules avec 100 microlitres de billes c-magnétiques anti-CD11 et collectez la population de cellules positives à billes magnétiques, comme nous venons de le démontrer, pour obtenir une population de sous-ensembles de cellules CD8alpha-dendritiques supérieure à 97 %. Enfin, déterminez le nombre de cellules vivantes, en excluant le bleu trypan. Une fois que la tumeur devient palpable, les souris porteuses du ligand B16 flt-3 présentent constamment une augmentation spectaculaire de la cellularité splénique en corrélation avec l’expansion des sous-ensembles de cellules dendritiques spléniques.

Il est intéressant de noter que, alors qu’une augmentation de 15 à 20 fois du nombre absolu de cellules est observée pour les DC conventionnels chez ces animaux, seulement une augmentation d’environ 4 fois est observée pour le sous-ensemble des DC de cytode plasmatique. Les différents sous-ensembles de cellules dendritiques sont caractérisés en fonction de leur expression B220, CD11b, CD11c et CD8alpha. Les populations cellulaires présentent également d’autres marqueurs de sous-ensembles uniques, cependant, avec mPDCA1 exprimé exclusivement sur les DC de cytode plasmatique DEC205 fortement exprimé sur les CD8alpa+DC, et CD11b et 33D1 détectés plus principalement sur les CD8alpha-DC.

En utilisant cette méthode, nous avons démontré que CD8alpa+DC est le plus efficace dans la présentation des antigènes par des molécules de liaison CD à une population de cellules T spécialisée connue sous le nom de cellules NKT invariantes. La caractéristique la plus critique de l’isolation DC est de maintenir une stérilité stricte et des conditions sans antidoxant. Au cours des procédures, ces lymphocytes T sont très réactifs à l’antidoxant.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les cellules avec douceur, car une stimulation mécanique répétée peut modifier l’état de maturation des cellules dendtritiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour isoler un grand nombre de tous les principaux sous-ensembles de DC à partir d’une seule rate. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.