Name: Une méthode de rendement efficace et haute pour lisolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez une méthode efficace et à haut rendement pour isoler les sous-ensembles de cellules dendritiques de la rate de souris en utilisant le ligand Flt-3. Cette technique permet d'obtenir des populations de cellules dendritiques plasmacytoïdes, CD8α+ et CD8α- avec une pureté supérieure à 94 %.

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Ce travail a été soutenu par le NIH / NIAID subvention AI45889 à SAP cytométrie de flux des études ont été effectuées en utilisant FACS installations de base pris en charge par le Centre Einstein Cancer (NIH / NCI CA013330) et Centre de recherche sur le sida (NIH / NIAID AI51519).

Les expérimentations animales sont réalisées conformément aux lignes directrices approuvées de la protection des animaux et de l&#39;utilisation comité institutionnel (IACUC). Toutes les procédures nécessitant la stérilité sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. 1. Implantation de B16.Flt3L mélanome chez la souris <ol><li> La culture de la lignée exprimant Flt-3 B16 de mélanome de cellules dans des fioles T25 pour culture de tissus , à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet DMEM avec 10% de CO2 à 37 ° C. Cultivez jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent ~ 90% de confluence (~ 20 h). </li><li> Récolter les cellules par digestion à la trypsine. Aspirer le milieu de culture cellulaire et laver les cellules adhérentes avec du PBS. Ajouter 5 ml de trypsine à 0,05% et on incube pendant 5 minutes à 37 ° C. Ajouter à froid 20 ml de milieu DMEM complet (4 ° C) contenant du sérum de veau fœtal (FCS) pour étancher la digestion par la protéase. Soulevez les cellules off par tapotant légèrement suivie par pipetage de haut en bas. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 300xg pendant 10 min à 4 ° C. Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou un compteur de viabilité cellulaire automatisée. Remettre en suspension à une densité de 10 8 cellules / ml dans du PBS. </li><li> Implant (souris C57BL / 6 ou d&#39;une autre souche histocompatible) avec des cellules tumorales par injection sous - cutanée comme décrit par Machholz et al. , 19 à la base du cou , avec 100 ul de suspension cellulaire (10 7 cellules). </li><li> Laisser la tumeur de croître jusqu&#39;à ce que palpable ou visible (2 - 10 mm de diamètre, habituellement 7 - 12 jours) avant de sacrifier des animaux pour le prélèvement d&#39;organes. </li></ol> 2. Préparation de splénique simple suspension cellulaire de souris porteuses de tumeurs <ol><li> Anesthetize souris avec une surdose d&#39;isoflurane (ajuster le débit de l&#39;isoflurane à&gt; 5% et continuer l&#39;exposition au moins 2 minutes après l&#39;arrêt respiratoire). Sacrifiez le mélanome tumeur souris Flt-3 de palier par dislocation cervicale selon les directives institutionnelles pour l&#39;euthanasie. </li><li> Disinfect la peau avec 70% d&#39; éthanol et la récolte de la rate en utilisant une technique aseptique à l&#39;aide de ciseaux stériles 20. </li><li> Placez la rate dans une boîte de Pétri stérile pour le transport vers l&#39;enceinte de sécurité biologique. Effectuez toutes les étapes à partir de maintenant dans des conditions stériles. </li><li> Transférer la rate dans une boîte de Petri frais et laver avec du milieu RPMI. Couper la rate en petits morceaux (~ 0,2 cm 2) à l&#39; aide d&#39; un scalpel. Incuber pendant 30 min à 37 ° C avec 10 ml de solution de collagénase / DNase. </li><li> Verser la suspension partiellement digérés du tissu splénique sur un tamis cellulaire de 70 pm. Comprimer les fragments de tissus restants à travers les mailles du tamis au moyen d&#39;un piston de la seringue de 5 ml. </li><li> Laver le filtre à tamis avec 10 ml de milieu frais et jeter le filtre. Centrifuger la suspension à 300 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de tampon de lyse RBC. Incuber à température ambiante fou 10 min. Étancher le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 10 ml de milieu RPMI complet. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans un volume approprié pour obtenir une densité cellulaire de 10 8 cellules / ml dans un tampon de tri cellulaire (par exemple MACS) contenant 20 pg / ml d&#39;anticorps Fc-bloc (2.4G2). </li></ol> 3. Purification de plasmacytoïdes DC, CD8a Pos DC et CD8a Neg DC de splénique simple suspension cellulaire Remarque: L&#39; isolement des sous - ensembles DC spléniques de suspension cellulaire unique est une procédure en plusieurs étapes comme illustré sur la Figure 1 Effectuez toutes les étapes en utilisant un tampon de pré-refroidi et un bain d&#39;eau glacée pour maintenir la température à 4-8 ° C.. Tous les volumes de réactifs dans la section suivante du protocole sont calculés pour une entrée initiale de 200 pi de suspension de cellules spléniques à 10 8 cellules / ml). Ceci peut être agrandie ouvers le bas en fonction de votre besoin en modifiant le volume de la suspension cellulaire (toujours à une densité de 1 X 10 8 cellules / ml) et d&#39; autres réactifs proportionnellement à l&#39;étape initiale (3.1.1 et 3.2.1). Ajustez les volumes de réactifs dans toutes les étapes ultérieures en conséquence. Par exemple, si à partir de 100 pi de suspension de cellules spléniques à 1 x 10 8 / ml, utiliser la moitié des volumes de réactifs indiqués dans toutes les étapes. <ol><li> Isolement des plasmacytoïdes DC (pDC) <ol><li> Ajouter 300 pl de cocktail d&#39;anticorps marqué à la biotine fourni dans le kit d&#39;isolation DC plasmacytoïdes à 200 ul de suspension de cellules spléniques. </li><li> Bien mélanger et incuber dans un bain d&#39;eau glacée pendant 15 min. Appuyez sur le tube toutes les 3 min pour maintenir les cellules en suspension, et de maximiser la liaison de l&#39;anticorps. </li><li> Ajouter 12 ml de tampon de tri et de cellules sédimenter les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant pour éliminer les anticorps biotinylés non liés. </li><li> Remettre en suspension la cellulele culot dans 500 pl de tampon de tri cellulaire. Ajouter 300 ul de billes d&#39;anticorps anti-biotine conjugué. Répétez l&#39;étape 3.1.2 et 3.1.3. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de tampon de tri cellulaire. Effectuez toutes les étapes de ce point à la température ambiante à l&#39;aide de tampons pré-refroidi. </li><li> Placez un champ magnétique cellules fraîches activé tri colonne LS dans le support magnétique. Laver et équilibrer la colonne avec 5 ml de tampon de tri cellulaire. </li><li> Introduire à la pipette la suspension de cellules dans la colonne, en l&#39;appliquant doucement vers le centre de la surface du lit de la colonne. Recueillir l&#39;écoulement à travers. </li><li> Laver la colonne avec 10 ml de tampon de tri cellulaire. Recueillir ce flux à travers et se combiner avec l&#39;écoulement à travers l&#39;étape 3.1.7. Les pDC sont enrichis dans ce flux de colonne à travers (FT1). </li><li> Pellet les cellules de FT1 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, remettre en suspension dans 2 ml cellule tampon de tri et de passer les cellules à travers une colonne de LS fraisen répétant les étapes 3.1.6 - 3.1.8. Cette utilisation de deux colonnes séquentielles donne une pureté accrue des cellules isolées. </li><li> cellules à granules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, et remettre en suspension avec 2 ml RPMI complet. Placez sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol></li><li> Isolement de CD8a Pos et CD8a Neg DC Remarque: La première étape de cette procédure est la déplétion des cellules B, pDC, T et NK. <ol><li> A partir de l&#39;ensemble de la suspension de cellules de rate (1 ml de 10 8 cellules / ml obtenues à l&#39; étape 2.8), ajouter 100 pi de cocktail d&#39;anticorps conjugué à la biotine fournie dans le kit d&#39;isolation CD8a Pos DC. </li><li> Bien mélanger et incuber dans un bain d&#39;eau glacée pendant 15 min. Appuyez sur le tube doucement toutes les 3 min pour maximiser la liaison des anticorps marqués à la biotine à leurs cellules cibles. </li><li> Ajouter 12 ml cellule tampon tri et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer supernatant pour éliminer les anticorps biotinylés non liés. </li><li> Ajouter 150 ul de tampon de tri de cellules et de 100 ul de billes anti-biotine fournies dans le kit d&#39;isolation CD8a Pos CC. Bien mélanger et incuber dans un bain d&#39;eau glacée pendant 15 min. </li><li> Ajouter 10 ml cellule tampon tri et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans un tampon de tri 1 ml de cellules et passer sur une colonne de LS frais selon la procédure des étapes 3.1.6 à travers 3.1.8. </li><li> Recueillir l&#39;écoulement non marqué à 2 (FT2) et jeter le rétentat de colonne. Cette fraction non marquée est enrichie en CD8a Pos et CD8a Neg DC. </li><li> Pellet les cellules FT2 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un tampon de tri 1 ml de cellules et ajouter 200 ul d&#39;anti - CD8a-billes magnétiques conjuguées fournies dans le kit d&#39;isolation CD8a Pos CC. </li><li> Représentantmanger étapes 3.2.2 à travers 3.2.6. Le débit à travers de la colonne est enrichi pour CD8a Neg PED et appauvri pour CD8a Pos PED. Ceci est étiqueté écoulement à travers 3 (FT3). </li><li> Pour éluer la CD8a Pos DCs retenue dans la colonne, retirer la colonne de l&#39;aimant, ajouter 5 ml de tampon de tri de cellules et purger la matrice de la colonne à l&#39; aide du piston fourni avec la colonne LS. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un tampon de tri 1 ml de cellules. Pour augmenter la pureté, exécutez les cellules éluées à nouveau à travers une colonne de LS frais en répétant les étapes 3.1.6 à 3.1.8, sauf jeter l&#39;écoulement à travers et de recueillir des cellules retenues comme dans 3.2.11. </li><li> Pour purifier le CD8a Nég DCs à partir de la suspension FT3, le culot FT3 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 300 pi de tampon de tri cellulaire. </li><li> Ajouter 100 pi d&#39;anti-CD11c magperles nétiques. Bien mélanger et incuber dans un bain d&#39;eau glacée pendant 15 min. </li><li> Ajouter les cellules de tri 10 ml de cellules de tampon et de granulés par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Répétez les étapes 3.1.5 à travers 3.1.8. Le CD8a Neg DC sont positivement sélectionné avec des perles de CD11c et sont liés à la colonne. Le débit à travers peut être jeté. </li><li> Eluer les cellules retenues dans la colonne comme décrit à l&#39; étape 3.2.11 pour recueillir purifié CD8a Neg DC. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing TTB avec Antigènes et transfert de cellules <ol><li> Compter les cellules vivantes après purification en utilisant l&#39; exclusion du bleu trypan 21 de distinguer les cellules vivantes et mortes. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;antigène de choix. Utilisez des analogues de l&#39; antigène glycolipidique appelée alpha-galactosyl céramide (aGalCer) à 100 nM concentration 13. Typiquement, la plaque 10 6 cellules viables / puits dans un milieu RPMI complet utilisant ultra low-attachment à fond en U plaques à 96 puits pour réduire au minimum la fixation des cellules. Incuber les cellules dans une atmosphère de CO2 à 5% à 37 ° C pendant 1 à 4 heures. </li><li> Récolte des cellules par pipetage plusieurs fois. Utilisez de larges conseils alésage de pipette pour réduire au minimum les dommages aux cellules des forces de cisaillement. Laver les puits avec du PBS et mettre en commun ces lavages pour maximiser la récolte des cellules. </li><li> Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et la remise en suspension à une densité désirée dans du PBS. Typiquement, injecter 1 million de cellules dans 200 pi par animal receveur. Gardez les cellules sur la glace afin de maximiser la viabilité avant l&#39;administration à des animaux hôtes. </li><li> Injecter des cellules par voie intraveineuse à des souris , soit par la queue vain latérale ou le plexus veineux rétro-orbital 19. Utiliser une aiguille 27G sur une seringue de 1 ml et injecter un volume maximal de 0,1 ml par souris. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les cellules dendritiques sont acceptées comme le principal des cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles impliquées dans l&#39;amorçage de réponses des lymphocytes T. Leur fonction principale est de sonder le microenvironnement des tissus en prenant et le traitement des antigènes pour la présentation aux cellules T. Afin d&#39;étudier la fonction de sous-ensembles DC spécifiques, ceux-ci doivent être isolés en nombre suffisant en utilisant une approche qui maintient leur phénotype et les fonctions normale...

Les cellules dendritiques (DC) ont été découverts il y a près de quarante ans que la &quot;grande étoilées (grec dendron) cellule&quot; trouvé dans les organes lymphoïdes 1. De nombreuses études ont montré que les DC sont les seules cellules présentatrices de l&#39; antigène qui peut stimuler efficacement les lymphocytes T naïfs 2. Une fonction majeure de ces cellules est l&#39;absorption et la présentation des antigènes et de leur traitement efficace et le chargement de ces molécules sur présentatrices d&#39;antigène. Dans la rate de la souris, les CD peuvent être séparés en plasmacytoïdes et des sous-ensembles classiques. Les CD plasmacytoïdes sont caractérisés par une faible expression de CD11c et des niveaux élevés de B220 et Gr-1. Ils sont également positifs pour le marqueur mPDCA1 de surface et sécrètent interféron de type I en réponse à péage comme récepteur 9 (TLR9) ligands. Les CD classiques sont élevés pour CD11c et classe l&#39;expression du CMH II. Ils peuvent être divisés en trois sous-ensembles distincts basés sur l&#39;expression de surface des marqueurs phénotypiques tels que CD4, CD8a, DEC205, CD11b et cellules dendritiques récepteur inhibiteur 2 (DCIR2, reconnu par l&#39;anticorps 33D1) protéines 3,4. Les CD8a Pos DC sont également connus comme CDC1, sont positifs pour DEC205, mais négatif pour les marqueurs myéloïdes tels que CD11b et 33D1. Le CD8a Neg DC, aussi appelé cdc2, sont positifs pour 33D1, CD11b et CD4 mais manquent DEC205. Le sous - ensemble double négation (ie, négatif à la fois CD4 et CD8a) est relativement rare, et est négative pour DEC205 et 33D1. Il est le sous - ensemble moins caractérisée et peut - être une forme moins différenciée de CD8a Neg DC. Les différences phénotypiques dans les différents sous - ensembles DC étendent aussi leurs fonctions in vivo. Le CD8a Neg DC sont très phagocytaire et sont pensés pour présenter l&#39; antigène exogène principalement par le CMH de classe II à des cellules T CD4 3. En revanche, les CD8a Pos DCs sont spécialisés pour la présentation d&#39; un antigène protéique soluble dans le CMH de classe Idans un mécanisme appelé présentation croisée. Le résultat de la présentation croisée dépend de l&#39;état d&#39;activation de ces PED 5, et peut conduire soit à l&#39; expansion des cellules T cytotoxiques (CTL) ou le développement de cellules T régulatrices 6 2,7. Le ciblage de l&#39; antigène à CD8a Pos DC en utilisant les résultats de la livraison anti-DEC205-anticorps médiée en grande partie dans la suppression des cellules T 8, alors que la présentation des antigènes dérivés de cellules apoptotiques infectées induit une réponse CTL forte 9. En plus de la reconnaissance des antigènes peptidiques, le système immunitaire des mammifères a évolué pour reconnaître les antigènes de lipides et glycolipides. Ces antigènes sont présentés par des molécules CD1, qui sont du CMH de classe de protéines de surface cellulaire I-like qui existent dans de multiples formes liées à divers mammifères. Chez la souris, un seul type de molécule CD1 hautement conservée appelée CD1 est responsable de la présentation des antigènes glycolipidiques 10. Le principal<html> une population de cellules T qui reconnaissent des complexes CD1d / glycolipides est appelé cellules NKT invariantes (cellules iNKT). Ces cellules expriment un récepteur de cellules T invariantes demi-(TCR) composé d&#39;une chaîne TCRa invariante qui est associée à des chaînes qui ont TCRβ diversité 11 limitées. Contrairement aux cellules T conventionnelles qui doivent proliférer et se différencier en cellules T effectrices activées, les cellules iNKT existent sous la forme d&#39; une population effectrice et commencer à intervenir rapidement après l&#39; administration de 12 glycolipides. L&#39;identification des cellules présentatrices d&#39;antigène lipidique physiologiquement pertinente est un domaine actif de recherche, ainsi que plusieurs types de cellules distinctes telles que des cellules B, les macrophages et les DC ont été proposées pour effectuer cette fonction. Cependant, il a été démontré que le sous - ensemble Pos CD8a de DC est la cellule primaire médiation absorption et la présentation des antigènes aux cellules lipidiques iNKT de souris 13 et des glycolipides à médiation par contre-amorçage des cellules T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Pour comparer l&#39;efficacité de la présentation de l&#39;antigène par différentes cellules présentant l&#39;antigène, une approche directe consiste à transférer différents types de TTB purifiées puisées avec des quantités équivalentes de l&#39;antigène dans des hôtes naïfs. expériences de transfert de cellules de ce type sont souvent effectuées pour des études immunologiques. Cependant, la réalisation d&#39; études de transfert avec des DC antigène ex vivo traité est difficile, étant donné que ces cellules existent populations comme rares dans les organes lymphoïdes où ils représentent moins de 2% des cellules totales 15. Il est donc nécessaire de renforcer le développement de ces cellules chez les animaux donneurs d&#39;augmenter l&#39;efficacité des protocoles d&#39;isolement. Il est connu que le lymphoïde commun et progéniteurs myéloïdes communs, qui sont nécessaires pour la production de pDC, CD8 Pos et des sous - ensembles CD8 Neg DC, express liés fms-récepteur tyrosine kinase 3 (Flt-3). Une fois in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) l&#39; administration, emigration de Flt-3 exprimant des cellules progénitrices de la moelle osseuse est augmentée, ce qui entraîne une augmentation de l&#39;ensemencement des organes lymphoïdes périphériques et l&#39;expansion de leur descendance 16 dendritiques matures. L&#39;expression de Flt-3 est perdue lors de l&#39;engagement du B, T ou NK voies de différenciation cellulaire. Par conséquent, seules des modifications minimes sont observées dans ces cellules lors de l&#39;administration Flt-3L. Expansion similaire dans les populations DC est observée chez les souris portant des tumeurs générées par l&#39; implantation d&#39;une lignée de cellules B16-mélanome sécrétant murin Flt-3L, qui fournit une méthode simple et économique pour fournir des niveaux systémiques soutenus de Flt-3L 17,18. En utilisant cette approche, nous avons mis au point un protocole basé sur l&#39;implantation de cellules B16-mélanome sécrétant Flt-3L pour stimuler l&#39;expansion de tous les sous-ensembles DC normaux dans la rate de la souris, ce qui augmente considérablement les rendements de ces cellules qui peuvent être isolées pour des expériences ultérieures . Nous constatons régulièrement que dans les 10 - 14 jours après im sous-cutanéela plantation de la tumeur sécrétant Flt-3, les souris développent une splénomégalie avec un enrichissement notable de DCs pour constituer 40-60% des cellules de rate totales. A partir de ces rates, différents sous-ensembles DC peuvent être isolés avec une grande pureté en utilisant le standard disponibles dans le commerce des kits de purification de cellules qui emploient des marqueurs phénotypiques spécifiques sous-ensemble.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D&nbsp ;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (poudre sèche)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 proof éthanol&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Utilisé pour préparer un</td></tr><tr><td>tampon de lyse des globules rouges</td> à 70 % d’éthanol <td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 milieu avec L-glutamine&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Milieu DMEM avec L-glutamine&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>les acides aminés non essentiels MEM</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés essentiels MEM&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11130-051&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS Ca2+ et Mg2+ pH libre 7,2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS avec Ca2+ et Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M solution d’éthylènediaminetétraacétate (EDTA)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan (poudre sèche)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp ;</td><td>Préparer 0,08 % avec PBS</td></tr><tr><td>Kit d’Isolement de Cellules Dendritiques Plasmacytoïdes II, souris</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques conjuguées avec anti-souris CD11c&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alpha ; Pos souris Kit d’isolation DC&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps bloquant le récepteur Fc-gamma (Clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD11c-FITC&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD8&alpha ;-PerCP&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris B220-PE&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 1 ml&nbsp ;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 aiguille&nbsp ;</td><td>Boîtes</td><td>de</td> Pétri BD 305145 <td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Instruments chirurgicaux&nbsp ;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules (70 &micro ; m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Grandes plaques de Pétri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtration sous vide (500 ml (0,22 & micro ; m))</td><td>Colonnes Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp ;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Pied magnétique Séparateur MACS&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Alésage large 200 &mu ; l pointes de pipette&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning plaques à 96 puits à fixation ultra-basse&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Femelle C57BL/6 souris de 6 à 8 semaines.</td><td>Jackson Research Laboratories, lignée</td> cellulaire de mélanome Jax <td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L</td><td>décrite par Mach et al., 2000</td>Serum free DMEM et RPMI media 500 ml de DMEM avec L-glutamine, ou 500 ml de RPMI-1640 avec L-glutamine 5 ml d’acides aminés non essentiels MEM (100x,<td></td><td></td></tr><tr><td> 10&nbsp ; mM) 5 ml de tampon HEPES (1 M) 5 ml de L-glutamine (200&nbsp ; mM) 0,5 ml de 2-mercaptoéthanol (5,5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>Mélangez tous les ingrédients dans une enceinte de biosécurité avec un milieu DMEM ou RPMI selon vos besoins. Filtre stériliser le média en passant à travers un 0,22 & micro ; Système de filtration sous vide M.</td></tr><tr><td><Milieux RPMI et DMEM complets></forts></td><td></td><td></td> <td>Ajouter 50 ml de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur à un milieu RPMI ou DMEM sans sérum pour obtenir un milieu complet.</td></tr><tr><td><Tampon Strong>MACS</td><td></td><td></td><td>Ajouter 2 ml d’EDTA 0,5 M et 10 ml de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Ca2+ et Mg2+ libre, pH 7,2) et 2&nbsp ; et micro ; g/ml 2.4G2 (anticorps Fc-Block).</td></tr><tr><td><Tampon de coloration FACS fort></fort></td><td></td><td></td><td>Dissoudre l’azoture de sodium à 0,05 % (0,25 g par 500 ml) dans le tampon MACS pour obtenir</td> une solution mère de tampon de coloration</tr> <tr><td>FACS10x Collagenase D et DNase 1 
Dissoudre 1 g de collagénase D et 0,2 ml de DNase 1 mère (1 mg/ml, 100x) dans 20 ml de PBS contenant Ca2+ et Mg2+ pour obtenir une solution d’environ 1 000 à 2 000 unités d’activité de la collagénase par ml.</td><td></td><td></td><td>Cette solution mère 10x peut être préparée à l’avance et stockée à -20 &deg ; C pendant plusieurs semaines. Diluez 1 ml de celui-ci avec 9 ml de RPMI sans sérum immédiatement avant utilisation.</td></tr></tbody></table>

une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d&#39;antigènes professionnelles principalement responsable de l&#39;acquisition, le traitement et la présentation des antigènes sur des molécules présentatrices d&#39;antigènes pour déclencher une immunité des lymphocytes T à médiation. Les cellules dendritiques peuvent être séparés en plusieurs sous-ensembles phénotypiquement et fonctionnellement hétérogènes. Trois sous - ensembles importants de cellules dendritiques spléniques sont plasmacytoïdes, les cellules CD8a Pos et CD8a Neg. Les CD plasmacytoïdes sont des producteurs naturels de l&#39;interféron de type I, et sont importants pour l&#39;immunité anti-viral de cellule T. Le sous - ensemble CD8a Neg DC est spécialisé pour le CMH de classe II présentation de l&#39; antigène et est impliqué dans le centre de l&#39; amorçage des cellules T CD4. Le CD8a Pos PED sont principalement responsables de la présentation croisée des antigènes exogènes et CD8 T amorçage cellulaire. Les CD8a Pos PED ont été démontrés pour être plus efficace lors de la présentation des antigènes glycolipidiques par des molécules CD1d à un T cel spécialisél population connue sous le nom tueuses naturelles invariant cellules T (iNKT). L&#39;administration du ligand de Flt-3 augmente la fréquence de migration des précurseurs de cellules dendritiques provenant de la moelle osseuse, entraînant finalement l&#39;expansion des cellules dendritiques dans les organes lymphoïdes périphériques dans des modèles murins. Nous avons adapté le modèle pour purifier un grand nombre de cellules dendritiques fonctionnelles pour une utilisation dans des expériences de transfert de cellules pour comparer aptitude in vivo des différents sous - ensembles à courant continu.

Le résultat de cette procédure repose sur l&#39;expansion des sous-ensembles DC par murin Flt-3L exprimé par les cellules de mélanome implantées. B16.Flt3L la tumeur est dérivé d&#39;une souris C57BL / 6, et doivent être implantés dans les animaux avec cette souche de fond afin d&#39;éviter l&#39;échec de la tumeur à s&#39;établir en raison du rejet. Dans certains cas, il peut être souhaitable d&#39;utiliser des souris génétiquement modifiées pour dériver les PED avec des défauts connus ...

Des sous-ensembles distincts de cellules dendritiques existent en tant que populations rares dans les organes lymphoïdes, et sont donc difficiles à isoler en nombre suffisant et en pureté suffisante pour des expériences immunologiques. Nous décrivons ici une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour l’isolement de tous les principaux sous-ensembles actuellement connus de cellules dendritiques spléniques de souris.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

L’objectif global de ce protocole est de développer une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour générer des cellules dendritiques ou des DC, qui reflètent fatalement leur divergence phénotypique et fonctionnelle in vivo. Les cellules dendritiques existent en grandes populations dans les organes lymphoïdes. Par conséquent, nous utilisons un ligand filtre pour augmenter la fréquence de ces cellules essentielles dans les tissus du donneur afin de faciliter cet isolement.Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine la génération de tous les sous-ensembles de DC en nombre approprié pour l’analyse en utilisant uniquement les agents disponibles dans le commerce. Pour récolter le ligand flt-3 exprimant les cellules de mélanome B16 à partir d’une culture confluente à 90 %, lavez d’abord les cellules avec du PBS et incubez la culture avec 05 % de trypsine à 37 degrés Celsius. Après 5 minutes, éteignez l’activité de la protéase avec 20 millilitres de milieu dima complet à 4 degrés Celsius et détachez la couche du modèle cellulaire adhérent avec un léger tapotement et un pipetage doux.Collectez les cellules par centrifugation et comptez-les. Ensuite, ré-suspendez la suspension unicellulaire à une concentration de 1 fois à la concentration de 8 cellules par millilitre dans le PBS pour leur injection sous-cutanée dans des souris receveuses C57 black 6. Lorsque la tumeur atteint deux à dix millilitres de diamètre, récoltez les rates des animaux porteurs de tumeurs et placez les rates dans une boîte de Pétri contenant un milieu RPMI frais.À l’aide d’un scalpel, coupez les tissus en morceaux de 0,2 centimètre carré, puis incubez les fragments dans dix millilitres de collagénase et de Dnase à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, versez la boue de tissu partiellement digérée sur une passoire cellulaire de 70 microns et utilisez un piston de seringue de cinq millilitres pour presser les fragments de tissu restants à travers le grillage de la passoire. Rincez le filtre avec 10 millilitres de milieu frais, en regroupant le lavage avec le reste de la suspension à cellule unique et granulez les cellules.Nous suspendons la pastille cellulaire dans 2 millilitres de tampon de lyse des globules rouges à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules dans 10 millilitres de milieu RPMI frais, et remettez-les en suspension à 1 fois 10 à 8 cellules par millilitre dans un tampon de tri cellulaire contenant le bloc FC. Pour isoler les DC de cytode plasmatique, mélangez soigneusement 300 microlitres de cocktail d’anticorps marqués à la biotine à partir d’un kit d’isolement de DC de cytode plasmatique avec 200 microlitres de suspension de cellule unique splénique.Placez les cellules dans un bain d’eau glacée pendant 15 minutes, en tapotant doucement toutes les trois minutes. Ensuite, lavez les cellules avec 12 millilitres de tampon de tri cellulaire et remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon de tri frais. Ensuite, incubez les cellules dans 300 microlitres de billes conjuguées d’anti-biotine et d’anticorps pendant encore 15 minutes dans l’eau glacée en tapotant régulièrement.Après avoir lavé les cellules dans un tampon de tri frais, remettez la palette en suspension dans 2 millilitres de tampon de tri cellulaire et chargez une colonne magnétique de taille appropriée sur son aimant correspondant. Équilibrez la colonne avec cinq millilitres de tampon de tri de cellules fraîches à 4 degrés Celsius. Lorsque toute la mémoire tampon s’est écoulée du haut de la colonne, ajoutez soigneusement les cellules au centre de la surface de la tête de colonne et récupérez le flux.Ensuite, lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon de tri frais à 4 degrés Celsius et collectez le flux dans le même tube. Après le passage dans une deuxième colonne magnétique, on peut s’attendre à une population de cellules dendritiques de cytode plasmatique d’une pureté supérieure à 94 %. Pour isoler les CD8aplha+ et CD8alpha-DC, mélangez le reste de la suspension de cellules spléniques avec 100 microlitres de cocktail d’anticorps conjugués à la biotion d’un kit d’isolement de cellules dendritiques CD8alpha++, pendant 15 minutes sur de la glace en tapotant doucement, comme cela vient d’être démontré.À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans 12 millilitres de tampon de tri cellulaire à 4 degrés Celsius et remettez le granulé en suspension dans 150 microlitres de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius. Ensuite, mélangez les cellules avec 100 microlitres du kit d’isolement de cellules CD8alpha+dendritiques en billes anti-biotine. Après 15 minutes sur de la glace en tapotant doucement, lavez les cellules dans 10 millilitres de tampon de tri cellulaire à 4 degrés Celsius et remettez le granulé en suspension dans 1 millilitre de tampon de tri frais à 4 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, triez les cellules par séparation par billes magnétiques, comme nous venons de le démontrer, en recueillant le flux et le premier lavage. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius. Étiquetez maintenant les cellules avec 200 microlitres de billes magnétiques conjuguées anti-CD8aplha du kit, et faites passer les cellules à travers une nouvelle colonne, en recueillant le flux de cellules CD8alpha-dendritiques.Pour collecter les CD8alpha+DC, transférez la colonne dans un tube conique de 15 millilitres et plongez 5 millilitres de tampon de tri cellulaire frais à 4 degrés Celsius dans la colonne. Après avoir fait passer les cellules dans une deuxième colonne, on peut s’attendre à une population de cellules CD8alpha+dendritiques supérieure à 96 %. Pour isoler les cellules CD8alpha, faites tourner la suspension cellulaire CD8alpha.Ensuite, étiquetez les cellules avec 100 microlitres de billes c-magnétiques anti-CD11 et collectez la population de cellules positives à billes magnétiques, comme nous venons de le démontrer, pour obtenir une population de sous-ensembles de cellules CD8alpha-dendritiques supérieure à 97 %. Enfin, déterminez le nombre de cellules vivantes, en excluant le bleu trypan. Une fois que la tumeur devient palpable, les souris porteuses du ligand B16 flt-3 présentent constamment une augmentation spectaculaire de la cellularité splénique en corrélation avec l’expansion des sous-ensembles de cellules dendritiques spléniques.Il est intéressant de noter que, alors qu’une augmentation de 15 à 20 fois du nombre absolu de cellules est observée pour les DC conventionnels chez ces animaux, seulement une augmentation d’environ 4 fois est observée pour le sous-ensemble des DC de cytode plasmatique. Les différents sous-ensembles de cellules dendritiques sont caractérisés en fonction de leur expression B220, CD11b, CD11c et CD8alpha. Les populations cellulaires présentent également d’autres marqueurs de sous-ensembles uniques, cependant, avec mPDCA1 exprimé exclusivement sur les DC de cytode plasmatique DEC205 fortement exprimé sur les CD8alpa+DC, et CD11b et 33D1 détectés plus principalement sur les CD8alpha-DC.En utilisant cette méthode, nous avons démontré que CD8alpa+DC est le plus efficace dans la présentation des antigènes par des molécules de liaison CD à une population de cellules T spécialisée connue sous le nom de cellules NKT invariantes. La caractéristique la plus critique de l’isolation DC est de maintenir une stérilité stricte et des conditions sans antidoxant. Au cours des procédures, ces lymphocytes T sont très réactifs à l’antidoxant.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les cellules avec douceur, car une stimulation mécanique répétée peut modifier l’état de maturation des cellules dendtritiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour isoler un grand nombre de tous les principaux sous-ensembles de DC à partir d’une seule rate. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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