Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14⁺ humains

Nous cherchons à comprendre quels traitements immunomodulateurs peuvent générer des cellules dendritiques tolérées à partir de cellules dendritiques dérivées de monocytes déjà différenciées, ce qui est très précieux pour la recherche auto-immune et la transplantation. Les autothérapies deviennent de plus en plus pratiques en raison des progrès de la fabrication, et les cellules dendritiques tolérogènes se sont révélées prometteuses dans les études précliniques. Ils peuvent générer une tolérance spécifique à l’antigène. La plus courante est la cytométrie. Il s’agit d’un moyen rapide et également accessible d’analyser les cellules tolérées. Il est difficile de générer des cellules dendritiques tolérogènes qui persistent dans les deux fonctions in vivo. C’est pourquoi il n’existe pas de thérapies à base de cellules dendritiques cliniquement approuvées pour tolerized. Nous avons identifié de nouvelles combinaisons de composés immunomodulateurs à partir d’études de dépistage à grande échelle qui montrent une amélioration de la fonctionnalité des cellules dendritiques tolérées. Nous concevons également des formulations de nanoparticules tolérantes.

[Instructeur] Pour commencer, placez les tubes de 15 millilitres contenant des monocytes humains enrichis et des lymphocytes T dans une centrifugeuse. Une fois la centrifugation terminée, utilisez une pipette pour aspirer le surnageant des tubes. Ajoutez un millilitre de milieu de culture MODC à la pastille de monocyte, un millilitre de milieu de culture à cellules T dans le tube contenant les cellules T et mélangez bien avant le comptage des cellules. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de milieu de culture MODC chaud à la suspension de monocytes pour obtenir le volume final de 10 millilitres. Ensuite, pipetez 100 microlitres de chacune des solutions mères GM-CSF et IL-4. Transférez la suspension dans une boîte de Pétri étiquetée, marquée MODC, et incuber. Ensuite, ajoutez un millilitre de produit de congélation à cellules T à la suspension de cellules T. Divisez le mélange en deux flacons cryogéniques de deux millilitres. Placez les flacons cryogéniques scellés dans une chambre de congélation avec des tubes d’équilibrage dans des puits inutilisés. Le quatrième jour, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture MODC frais dans le tube monocytaire. Ensuite, pipetez 100 microlitres de GM-CSF et d’IL-4 et incubez jusqu’au septième jour. Le septième jour, transférez les cellules dendritiques dérivées de monocytes différenciés, ou MDOC, dans un tube de 50 millilitres et centrifugez-les comme précédemment. Ajoutez un millilitre de milieu de culture MODC chaud à la pastille cellulaire et pipetez de haut en bas pour bien mélanger. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension avec un milieu de culture MODC chaud contenant du GM-CSF et de l’IL4 jusqu’à ce que la concentration cellulaire souhaitée soit obtenue. Distribuez 100 microlitres de la suspension contenant 30 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits. Ajoutez un microlitre de médicaments immunomodulateurs dans les puits désignés et incubez. Le lendemain, centrifugez la plaque MODC à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir délicatement retiré le surnageant, ajoutez doucement 200 microlitres de HBSS chaud sur le côté de la plaque et centrifugez. Encore une fois, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture MODC chaud contenant du GM-CSF et de l’IL4 après l’aspiration du surnageant. Si l’immunostimulation est utilisée, ajoutez un microlitre de stock 100X de lipopolysaccharide dans les puits désignés et incuber. Le huitième jour, décongelez deux flacons cryogéniques dans un bain de billes chaudes à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le contenu commence à fondre. Une fois partiellement décongelés, transférez les flacons dans une hotte de culture cellulaire. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de culture de cellules T chaud pour décongeler rapidement les cellules. Transférez le contenu dans un tube de 50 millilitres et rincez les flacons cryogéniques avec un millilitre supplémentaire de milieu de culture de cellules T pour recueillir toutes les cellules. Complétez la suspension avec une solution de coloration à 15 millilitres et centrifugez. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de solution de coloration en flux et centrifugez-la à nouveau, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture chaud à cellules T après avoir pipeté le surnageant. Ajoutez neuf millilitres de milieu de culture de cellules T chaud pour obtenir un volume final de 10 millilitres. Transférez la suspension dans une boîte de Pétri étiquetée comme cellules T décongelées et incuber. Le huitième jour, centrifugez la plaque MODC à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir pipeté le surnageant, ajoutez 200 microlitres de solution de coloration par écoulement dans chaque puits et incuber. Ensuite, pipetez de haut en bas pour retirer les cellules attachées et la suspension de cellules vers une nouvelle plaque à fond en V de 96 puits avant de centrifuger à nouveau. Pipetez 50 microlitres d’anticorps inhibiteur de liaison au récepteur FC dans chaque puits après avoir aspiré le surnageant pour bloquer la liaison non spécifique. Après avoir incubé la plaque à température ambiante pendant 30 minutes, ajoutez 50 microlitres du cocktail d’anticorps du panel de validation préparé dans chaque puits. Mélangez 50 microlitres de billes de compensation avec 50 microlitres de chaque anticorps dilué dans des tubes de 1,5 millilitre et incuberez. Centrifugez la plaque à 300 G pendant cinq minutes. Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de solution de coloration par écoulement pour laver les cellules. Après le lavage final et la centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 110 microlitres de solution de coloration en flux pour l’analyse cytométrique en flux. Pour les MODC tolérogènes, remplacez le cocktail d’anticorps par le cocktail de panel de tolérance. Le neuvième jour, transférez la boîte de Pétri à cellules T redécongelée dans un tube de 50 millilitres et remplissez le tube avec une solution de coloration à écoulement. Utilisez le deuxième tube contenant des cellules T non colorées pour l’analyse trigonométrique. Faites tourner les tubes à 250 G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire chaud. Comptez les cellules T et assurez-vous qu’un minimum de 4 millions de cellules sont obtenues. Centrifugez la plaque MODC à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir aspiré les surnageants, ajoutez 200 microlitres de lymphocytes T dans chaque puits. Ajouter des lymphocytes T non colorés pour les plaques d’analyse trigonométriques. Ajoutez 25 microlitres par millilitre de cocktail d’anticorps anti-CD3/CD28 à tous les groupes, à l’exception des puits de contrôle négatifs, pour stimuler les lymphocytes T et incubez jusqu’au 12e jour. Ensuite, transférez toutes les suspensions cellulaires de la plaque de culture à 96 puits dans une plaque à fond en V avec une solution de coloration par écoulement. Lavez les cellules deux fois dans 200 microlitres de solution de coloration par écoulement. Réservez certaines cellules pour les contrôles de compensation. Après le deuxième lavage, centrifugez la plaque. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’anticorps inhibiteur de liaison au récepteur FC dilué dans chaque puits et incuber. Une fois l’incubation terminée, ajoutez 50 microlitres du cocktail d’anticorps trig préparé dans chaque puits. Pour les contrôles de compensation, mélangez 50 microlitres de cellules de compensation non colorées avec 50 microlitres de chaque anticorps coloré. Incuber la plaque et les commandes de compensation à quatre degrés Celsius pendant une heure, puis laver avec une solution de coloration avant de centrifuger. Colorez maintenant les cellules avec un colorant Live/Dead Near-IR dilué dans HBSS à 200 microlitres par bien avant l’incubation à froid. Laver et centrifuger la plaque avant la coloration avec Fox P3 et l’analyse par cytométrie en flux. Le premier jour, les monocytes indifférenciés étaient principalement HLA-DR-moins avec un petit CD14 moins, tandis que les monocytes différenciés le septième jour présentaient la plupart des cellules comme HLA-DR-plus CD14 moins, CD1c-plus, CD141 plus. Le traitement par la rapamycine avec et sans lipopolysaccharide a significativement réduit les populations de CD1c-plus de DC-SIGN-plus et inhibé la régulation positive des marqueurs CD86 et CD40 observée avec le traitement LPS seul. Les populations de cellules T régulatrices FOX P3-plus ont été augmentées lorsque les MDC étaient co-cultivées avec des cellules T. Mais aucune différence significative n’a été observée entre les quatre groupes de traitement par MODC. La prolifération des lymphocytes T a été réduite dans les populations de lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus après co-culture avec des MDOC traités par Rapa. Les échantillons traités à l’interleukine-10 ont considérablement augmenté la production d’interleukine-10 après 24 heures. Les MDOCs traités par Dex ont considérablement augmenté la production d’interleukine-10, mais seulement après s’être reposés pendant 72 heures. Le prétraitement de la dexaméthasone a réduit la génération moyenne de TNF alpha lors du traitement par LPS à 24 heures. Des augmentations significatives des MDOCs PDL1-plus ont été observées dans les groupes traités par Dex plus LPS et Rapa à 72 heures. Une suppression de l’expression de CD86 a été observée dans tous les groupes traités par immunomodulateur à 24 et 72 heures. Les MDOC traités par immunomodulateur n’ont pas augmenté la prolifération des lymphocytes T CD4 et plus.