Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple pour générer et isoler des cellules arrêtées par le cycle cellulaire avec des caryotypes complexes. Cette méthode peut apporter des réponses à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’aneuploïdie, telles que l’interaction du système immunitaire avec les cellules aneuploïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère une population cellulaire qui n’abrite que des caryotypes complexes.

Pour commencer la synchronisation des cellules RPE-1 hTERT, utilisez des cellules fraîchement décongelées et distribuez-les dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres en utilisant huit millilitres de milieu de croissance standard. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit.

Le lendemain, remplacez le milieu de croissance standard par un milieu contenant cinq millimolaires de thymidine. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour synchroniser les cellules à la frontière G1S. Après 24 heures, lavez les cellules trois fois avec du PBS.

Ensuite, ajoutez du milieu de croissance standard aux cellules lavées et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Tout d’abord, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un milieu contenant 500 nanomolaires d’inhibiteur de Mps1 réversine.

Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un milieu de culture standard et remettez les plaques dans l’incubateur.

Environ 72 heures après la première mitose aberrante, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un milieu contenant 330 nanomolaires de nocodazole. Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, aspirez le milieu nocodazole. Ajoutez ensuite trois millilitres de PBS dans le plat et tapotez le côté de la plaque pour secouer les cellules mitotiques. Faites pivoter la plaque entre chaque tapotement pour permettre une élimination uniforme des cellules mitotiques.

Après le secouage initial, aspirez tout liquide collé au couvercle et au bord de la plaque. Ensuite, vérifiez la plaque au microscope à un grossissement de 10X. Lavez ensuite les cellules avec cinq millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez un milieu contenant 330 nanomolaires de nocodazole. Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius. Après le secouage final, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance standard.

Incuber les cellules pendant 12 à 24 heures à 37 degrés Celsius avant d’effectuer les tests. Les cellules restantes sur la plaque sont dites arrêtées avec des cellules complexes de caryotype ou ArCK. Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler les cellules ArCK et plusieurs caractéristiques spécifiques aux cellules ArCK sont analysées pour confirmer leur isolement.

cellules ArCK présentent des niveaux accrus d’inhibiteurs du cycle cellulaire p53, p21 et p16 dans l’analyse immunoblot, contrairement aux cellules euploïdes et aneuploïdes. De plus, les cellules ArCK sont positives pour la bêta-galactosidase associée à la sénescence, qui se colore en bleu-vert alors que les cellules de contrôle euploïdes ne le sont pas. Les graphiques de segmentation révèlent que les cellules ArCK sont aneuploïdes, caractérisées par des gains et des pertes chromosomiques multiples et aléatoires.

Les graphiques de segmentation montrent le nombre de copies de cellules uniques du chromosome un à l’échelle X, par rapport à une échelle logarithmique de référence euploïde. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer d’éliminer toutes les cellules mitotiques lors de chaque secousse. Après avoir effectué cette procédure, d’autres méthodes telles que les dosages de cytokines peuvent être effectuées.

Ces tests aideront à répondre à des questions supplémentaires telles que la capacité des cellules ArCK à interagir avec les cellules du système immunitaire. N’oubliez pas que le nocodazole est dangereux. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’utilisation de ce réactif.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour isoler efficacement les cellules ArCK in vitro. Cette procédure peut être effectuée en sept jours si elle est effectuée correctement.