Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes
13 avril 2018
Aneuploïdie entraîne l’instabilité du génome, qui finalement produit arrêté au cycle cellulaire des cellules avec des caryotypes complexes. Cet article fournit une méthode simple et pratique pour isoler les cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes qui cessent de se diviser.
L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple pour générer et isoler des cellules arrêtées par le cycle cellulaire avec des caryotypes complexes. Cette méthode peut apporter des réponses à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’aneuploïdie, telles que l’interaction du système immunitaire avec les cellules aneuploïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère une population cellulaire qui n’abrite que des caryotypes complexes.
Pour commencer la synchronisation des cellules RPE-1 hTERT, utilisez des cellules fraîchement décongelées et distribuez-les dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres en utilisant huit millilitres de milieu de croissance standard. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit.
Le lendemain, remplacez le milieu de croissance standard par un milieu contenant cinq millimolaires de thymidine. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour synchroniser les cellules à la frontière G1S. Après 24 heures, lavez les cellules trois fois avec du PBS.
Ensuite, ajoutez du milieu de croissance standard aux cellules lavées et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Tout d’abord, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un milieu contenant 500 nanomolaires d’inhibiteur de Mps1 réversine.
Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un milieu de culture standard et remettez les plaques dans l’incubateur.
Environ 72 heures après la première mitose aberrante, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un milieu contenant 330 nanomolaires de nocodazole. Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, aspirez le milieu nocodazole. Ajoutez ensuite trois millilitres de PBS dans le plat et tapotez le côté de la plaque pour secouer les cellules mitotiques. Faites pivoter la plaque entre chaque tapotement pour permettre une élimination uniforme des cellules mitotiques.
Après le secouage initial, aspirez tout liquide collé au couvercle et au bord de la plaque. Ensuite, vérifiez la plaque au microscope à un grossissement de 10X. Lavez ensuite les cellules avec cinq millilitres de PBS.
Ensuite, ajoutez un milieu contenant 330 nanomolaires de nocodazole. Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius. Après le secouage final, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance standard.
Incuber les cellules pendant 12 à 24 heures à 37 degrés Celsius avant d’effectuer les tests. Les cellules restantes sur la plaque sont dites arrêtées avec des cellules complexes de caryotype ou ArCK. Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler les cellules ArCK et plusieurs caractéristiques spécifiques aux cellules ArCK sont analysées pour confirmer leur isolement.
Lescellules ArCK présentent des niveaux accrus d’inhibiteurs du cycle cellulaire p53, p21 et p16 dans l’analyse immunoblot, contrairement aux cellules euploïdes et aneuploïdes. De plus, les cellules ArCK sont positives pour la bêta-galactosidase associée à la sénescence, qui se colore en bleu-vert alors que les cellules de contrôle euploïdes ne le sont pas. Les graphiques de segmentation révèlent que les cellules ArCK sont aneuploïdes, caractérisées par des gains et des pertes chromosomiques multiples et aléatoires.
Les graphiques de segmentation montrent le nombre de copies de cellules uniques du chromosome un à l’échelle X, par rapport à une échelle logarithmique de référence euploïde. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer d’éliminer toutes les cellules mitotiques lors de chaque secousse. Après avoir effectué cette procédure, d’autres méthodes telles que les dosages de cytokines peuvent être effectuées.
Ces tests aideront à répondre à des questions supplémentaires telles que la capacité des cellules ArCK à interagir avec les cellules du système immunitaire. N’oubliez pas que le nocodazole est dangereux. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’utilisation de ce réactif.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour isoler efficacement les cellules ArCK in vitro. Cette procédure peut être effectuée en sept jours si elle est effectuée correctement.
Aperçu
Cette étude présente une méthode simple permettant d'isoler des cellules aneuploïdes possédant des caryotypes complexes et arrêtées dans le cycle cellulaire. La technique vise à améliorer la compréhension de l'aneuploïdie et de ses implications dans le comportement cellulaire et les interactions immunitaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Génétique
- Neurosciences
Contexte
- L'aneuploïdie est associée à une instabilité du génome.
- Les cellules présentant des caryotypes complexes cessent souvent de se diviser.
- La compréhension de ces cellules peut fournir des informations sur le cancer et d'autres maladies.
- L'isolement de ces cellules peut faciliter des recherches approfondies sur leurs propriétés.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour générer et isoler des cellules arrêtées dans le cycle cellulaire.
- Étudier les caractéristiques des cellules aneuploïdes.
- Explorer l'interaction entre les cellules aneuploïdes et le système immunitaire.
Méthodes utilisées
- Synchronisation des cellules RPE-1 hTERT à l'aide de thymidine et de nocodazole.
- Technique de décrochage cellulaire pour isoler les cellules en mitose.
- Analyse par immunoblot pour évaluer les inhibiteurs du cycle cellulaire.
- Coloration par bêta-galactosidase associée au vieillissement pour l'identification des cellules ArCK.
Résultats principaux
- Les cellules ArCK présentent des niveaux accrus d'inhibiteurs du cycle cellulaire.
- Ces cellules sont positives pour les marqueurs associés au vieillissement cellulaire.
- Les graphiques de segmentation confirment l'aneuploïdie dans les cellules isolées.
- La méthode permet d'isoler efficacement des cellules possédant des caryotypes complexes.
Conclusions
- Le protocole offre un moyen fiable d'étudier les cellules aneuploïdes.
- Les cellules ArCK isolées peuvent être utilisées pour des recherches ultérieures sur les interactions immunitaires.
- Une exécution correcte de la méthode peut produire des résultats en une semaine.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'isolement de cellules arrêtées au cours du cycle cellulaire et présentant des caryotypes complexes permet une détection mécanistique des phénotypes induits par l'aneuploïdie en biologie de la découverte. Cette approche facilite la validation de cibles en offrant un système reproductible pour étudier l'instabilité chromosomique ainsi que son impact sur la sénescence cellulaire, l'inflammation et les interactions immunitaires. Le fait que la méthode s'appuie sur des techniques courantes de culture tissulaire améliore son évolutivité et son adoption transfonctionnelle dans les flux de R&D en phase précoce.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques reliant l'aneuploïdie à l'instabilité du génome et aux phénotypes pro-inflammatoires.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole standardisé et peu coûteux pour générer des cellules ArCK en utilisant la synchronisation par la thymidine, la reversine et le nocodazole.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère une population cellulaire définie présentant des caryotypes complexes pour l'analyse quantitative des marqueurs de sénescence et de la sécrétion de cytokines.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à l'isolement reproductible de cellules arrêtées par la méthode de décrochage et le traitement à la nocodazole.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite l'étude des interactions entre les cellules anéuploïdes et les cellules immunitaires, contribuant ainsi à l'évaluation de cibles immunomodulatrices.
- Valeur opérationnelle : Permet des tests fonctionnels en aval, tels que le profilage des cytokines et la coloration à la bêta-galactosidase associée au vieillissement cellulaire, afin de valider les résultats phénotypiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte allant du test d'hypothèses sur une cible au criblage phénotypique, en particulier pour les mécanismes impliquant une instabilité chromosomique et des voies de réponse au stress.
- Découverte en biologie : Soutient la déminution des risques mécanistiques en isolant des cellules présentant une complexité caryotypique définie, afin de clarifier les liens causaux entre l'aneuploïdie et les phénotypes cellulaires.
- Écrans : Permet la préparation reproductible de cellules ArCK pour l'analyse à haut contenu d'inhibiteurs du cycle cellulaire et de profils sécrétoires.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs incluant la détection par immunoblot de p53, p21, p16, ainsi que des graphiques de segmentation pour la variation du nombre de copies au niveau monocellulaire.
- Recherche translationnelle : S'intègre à des études sur les interactions immunitaires, facilitant l'exploration de biomarqueurs dans les phénotypes sécrétoires associés à la sénescence.
- Réutilisation en milieu professionnel : Utilise des réactifs accessibles et du matériel de culture standard, permettant une adaptation dans différents laboratoires sans infrastructure spécialisée.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur l'aneuploïdie en fournissant un modèle d'arrêt défini avec des caryotypes complexes.
- Valeur opérationnelle : Propose un protocole de sept jours présentant une forte spécificité pour les cellules ArCK, améliorant le débit et la reproductibilité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) en permettant une évaluation précoce des risques biologiques induits par l'aneuploïdie dans les voies cibles.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles associées à l'instabilité chromosomique et à la sénescence.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les techniques de synchronisation cellulaire et les procédures de décrochage mitotique.
- Dépend de l'accès à des incubateurs standards pour cultures tissulaires, à des hématimètres et à une microscopie en champ clair ou en fluorescence pour la validation.
- Exige une standardisation de la manipulation du nocodazole et des étapes de lavage afin d'assurer l'élimination complète des cellules mitotiques dans toutes les réplicats.
- L'adaptation à d'autres lignées cellulaires peut nécessiter une optimisation des concentrations et des durées d'exposition au thymidine, à la réversine et au nocodazole.
- Limité aux modèles in vitro ; l'application aux tissus primaires ou in vivo n'est pas abordée dans le document source.
Foire aux questions sur les biopharmaceutiques
Chapters in this video
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Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
