Name: Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez la méthode FAIRE pour analyser l'accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères. Cette technique simple et reproductible utilise le réticulage au formaldéhyde et la sonication pour isoler les éléments régulateurs sans équipement spécialisé.

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Les auteurs voudrais remercier Tilman Borggrefe (Université de Giessen) pour le partage de bien vouloir l’appareil sonication. Le travail de M.L.S. est pris en charge par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, le système cardio-pulmonaire du Cluster Excellence (ECCPS, EXC 147/2), la Deutsche Krebshilfe (111447) et le programme IMPRS-HLR de la Société Max-Planck.

1. jour 1 : Culture de cellules
<ol><li>La culture des cellules à analyser à la quantité désirée. Médias et les conditions de culture cellulaire dépendent les types de cellules sous enquête. Remarque : En principe, toute cellule eucaryote se prête à une analyse de l’accessibilité de la chromatine par FAIRE. Pour cette expérience, 4 x 106 cellules HEK-293 t cellules sont ensemencées dans un plat unique de 10 cm dans le milieu DMEM additionné de 10 % (v/v) de SVF et 1 % (p/v) de pénicilline/streptomycine et incubés à 37 ° C pendant 24 h jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 70 à 80 % et de 5 % de CO2 (~ 8 x 10 6 cellules par plat).</li>
</ol>2. jour 2 : Réticulation de formaldéhyde et de récolte de cellules
ATTENTION : Le formaldéhyde est très toxique et doit toujours être utilisé sous une hotte aspirante. Portez des vêtements protecteurs (gants et blouse de laboratoire). Jeter les déchets convenablement.
<ol><li>Ajoutez le formaldéhyde directement au milieu de culture cellulaire dans une hotte pour atteindre une concentration finale de 1 % (v/v) (270 µL de 37 % (v/v) de formaldéhyde à 10 mL de milieu de culture cellulaire). Incuber pendant 10 min à température ambiante (20-25 ° C) et tua les plaques manuellement toutes les 2 min. NOTE : Le temps de réticulation est réglable selon le type de cellule. Pour la majorité des lignées cellulaires, 10 min de la réticulation est suffisant. Pour les tissus, des incubations plus longues peuvent être nécessaires pour permettre la fixation de toutes les cellules.</li>
	<li>Ajouter glycine à une concentration finale de 0,125 M pour étancher le formaldéhyde (ajouter 500 µL d’un stock de glycine de 2,5 M à 10 mL de milieu de culture). Incuber 5 min à température ambiante et tua toutes les 2 min.</li>
	<li>Laver les cellules 3 x dans la glace froide STP (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, ajuster le pH à 7,4 avec HCl ou NaOH). Aspirer le milieu et laver directement dans la boîte de Petri de cellule ou fiole 10 ml de PBS. Répétez cette étape deux fois plus d’être très prudent dans le cas de cellules faiblement adhérentes telles que HEK-293 t. Ajouter PBS soigneusement sur le côté du plat pour éviter le détachement des cellules.</li>
	<li>Après le troisième lavage, remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS froid glace et transférez dans un tube de réaction de 1,5 mL sur la glace. Utilisez un grattoir de cellules pour détacher les cellules lorsque cela est nécessaire. Remarque : Lorsque vous démarrez avec un matériel limité, utilisez faibles tubes de liaison à l’ADN pour éviter la perte de l’échantillon au cours de la procédure.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 300 x g à 4 ° C dans une centrifugeuse de table refroidie. Jeter le surnageant par aspiration avec soin il.</li>
</ol>3. cellule Lysis et Fragmentation de la chromatine
<ol><li>Resuspendre le culot dans le tampon de lyse FAIRE 1 mL (1 % (p/v), EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 8,1, 10 µg/mL leupeptine, 10 µg/mL aprotinine, PMSF 2 mM à 10 mM) et remettre en suspension les cellules en pipettant également soigneusement monter et descendre plusieurs fois. Incuber pendant 20 min sur la glace. Stocker les échantillons à-80 ° C à cette étape si nécessaire.</li>
	<li>Laisser agir le RETICULE ADN pour cisailler elle à une taille moyenne de 200-300 bp. Les paramètres spécifiques de le sonicateur doivent être déterminées pour chaque source d’échantillons et l’appareil utilisé sonication. Dans tous les cas veiller à ce que l’ADN est sectionnée efficacement. Une étape d’optimisation pour la tonte de l’ADN est décrit aux étapes 5.14. Refroidir les échantillons sur la glace au cours de la sonication pour éviter un échauffement de l’échantillon.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon pendant 15 minutes et 13 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de réaction. Diviser les échantillons dans 100 µL d’extraits. Stocker les échantillons à-80 ° C, le cas échéant. Remarque : Le protocole peut être interrompu à ce stade.</li>
</ol>4. de-réticulation du contrôle ADN
<ol><li>Prendre une 100 µL aliquote de l’étape 3.4 pour inverser la réticulation et servir de référence pour l’ADN total. Ajouter 10 µL de RNase-A (10 mg/mL) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de protéinase K (20 mg/mL). Un thermo-bloc programmable permet d’incuber pendant 4 h à 37 ° C, puis pendant 6 h à 65 ° C en conjonction avec les protéines et d’inverser les croisements. Enfin, tenez les échantillons à 4 ° C jusqu'à ce que le protocole est repris et passez à l’étape 5. Remarque : Autres protocoles FAIRE utilisent des échantillons de la chromatine des cellules qui n’ont pas été réticulé comme référence, supprimant ainsi la nécessité d’une réticulation de11. Le fait que ces échantillons ne sont pas réticulé pourrait conduire à des différences dans l’efficacité de la sonication ou dans la stabilité de l’ADN, c’est pourquoi l’utilisation totales référence d’échantillons d’ADN qui ont subi la même procédure que les échantillons de test est plus précise.</li>
</ol>5. jour 3 : Phénol : chloroforme Purification de l’ADN
<ol><li>Prendre le non de-réticulé aliquote de l’étape 3.4. Ajouter 10 µL de RNase-A (10 mg/mL) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
	<li>Prendre l’étape non-réticulé de formulaire aliquot 5.1 et l’échantillon de réticulé de l’étape 4.2 et continuer en parallèle. Ajouter H2O pour atteindre un volume final de 300 µL.</li>
	<li>Ajouter 300 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1) dans une hotte aspirante et vortex vigoureusement. ATTENTION : Le phénol est corrosif et toxique et doit être utilisé toujours sous une hotte aspirante. Porter des vêtements protecteurs (gants et blouse de laboratoire), assurez-vous que les tubes de réaction sont fermés hermétiquement et éliminer les déchets convenablement.</li>
	<li>Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Transvaser avec soin 280 µL de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction. Veillez à ne pas prendre tous les débris de l’interphase qui contient également des protéines. Jeter la phase inférieure restante comme des déchets de solvants organiques.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.3 à 5.5 et transvaser avec soin 270 µL de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction.</li>
	<li>Ajouter 270 µL de chloroforme dans une hotte aspirante et vortex vigoureusement. Remarque : Cette étape sert à éliminer tout phénol restant de l’échantillon.</li>
	<li>Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Transvaser avec soin 250 µL de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction, prenant soin de ne pas pour transporter les débris de l’interphase. Jeter l’échantillon restant comme déchets de solvants organiques.</li>
	<li>Ajouter 25 µL de 5 M de NaCl et 250 µL d’isopropanol. Ajouter 5 µL de glycogène (20 mg/mL) comme le transporteur de l’ADN. Bien mélanger en retournant les tubes et les incuber pendant 20 min à température ambiante. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C à précipiter l’ADN.</li>
	<li>Laver le culot d’ADN avec 400 µL d’éthanol à 70 % (v/v). Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant soigneusement et sécher le culot pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension dans 100 µL de tampon de TE (10 mM Tris pH 8, EDTA 1 mM).</li>
	<li>Incuber l’échantillon d’ADN de libre pendant 4 heures à 65 ° C pour éliminer les croisements inter-ADN de non-réticulé. Stocker les échantillons à-20 ° C.</li>
	<li>Quantifier la quantité d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et lancez une partie aliquote pour vérifier la taille du fragment sur un gel d’agarose de 2 % (p/v). Ajuster l’heure et les intensités de cisaillement, en fonction des résultats de l’analyse ADN de taille par agarose gel électrophorèse, pour obtenir une taille moyenne de 200-300 bp.</li>
</ol>6. détermination du libre Versus Total ADN par PCR Quantitative en temps réel (qRT-PCR)
<ol><li>Le ratio d’ADN nucleosome libres (par la suite dénommée gratuit ADN) par rapport à l’ADN est déterminée par qRT-PCR17,18au total. Échantillons peuvent également être quantitativement analysés par microarray hybridation ou séquençage en profondeur pour les déterminations de génome.</li>
	<li>Conception des amorces de qPCR pour les régions à tester et de contrôles positifs et négatifs. Remarque : Des contrôles positifs appropriés sont amorces situés dans le promoteur des gènes de ménage activement transcrit comme ACTB, GAPDH, TPI1 ou TUBA1A (codant la β-actine, GAPDH, TPI ou α-tubuline). Contrôles négatifs appropriés sont trouvent dans les régions d’hétérochromatine ou gène déserts. Autres témoins négatifs appropriés peuvent être conçus dans des régions génomiques adjacentes au locus dynamiquement réglementé sous enquête au contrôle des différences numéros copie locale (tableau 1).</li>
	<li>Diluer les échantillons d’ADN à une concentration finale de 10 ng/µL avec tampon TE et tenir compte pour le calcul final du facteur de dilution (Voir l’étape 6.5).</li>
	<li>Mettre en place une réaction de qPCR en géométrie dans une plaque à 96 puits, avec le mélange de réaction suivant / puits : ADN : 20 ng (2 µL), primer avant 200 nM (0,4 µL d’un stock de 5 µM), reverse primer 200 nM (0,4 µL d’un stock de 5 µM) , commercial prêt à l’emploi de mélange réactionnel contenant le colorant vert (5 µL d’un stock de 2 x) et H2O à 10 µL.</li>
	<li>Exécutez dans un dispositif de qPCR en temps réel, en utilisant le mode de quantification absolue et déterminez le Ct des échantillons avec les paires d’amorces différentes. Calculer le taux de récupération de l’ADN gratuit à l’ADN total pour chaque amorce à l’aide de la formule suivante, en tenant compte des facteurs de dilution de l’étape 6.3 : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg"> Résultats représentatifs et un exemple de calcul sont donnés dans le tableau 2.</li>
	<li>Pour compenser les différences entre les échantillons, normaliser le ratio de récupération contrôle positif : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

FAIRE est une méthode robuste et peu coûteuse permettant l’identification des régions sans nucléosome. Il est basé sur le principe que l’ADN enroulé autour des nucléosomes peut facilement être réticulé aux histones. Une extraction de phénol : chloroforme est utilisée pour séparer les non réticulé et les fragments d’ADN sans protéines de l’ADN protéinique, qui se trouve dans la phase inférieure du phénol et dans une certaine mesure dans l’interphase (Figure 1). Par conséquent, les régions indemnes de nucléosomes sont surreprésentées dans la fraction d’ADN libre dans la phase aqueuse. Un certain nombre de publications décrire des protocoles détaillés de la FAIRE méthode23,24,25,26, qui peut être consulté pour compléter la procédure décrite ici.
Semblable à d’autres méthodes utilisées pour déterminer la structure de la chromatine, la méthode FAIRE également critique dépend de tonte optimale de l’ADN. Si les fragments sont trop longs, toute région sans nucléosome va-t-elle être masquée par l’ADN de la chromatine lié aux adjacent. Si les fragments sont trop petits, la détection de qPCR ou séquençage en profondeur devient très difficile. Pour cette raison, la sonication de l’ADN est un paramètre crucial qui doit être contrôlé et optimisé afin d’obtenir des fragments autour de 200-300 longueur de bp, qui représentent les nucléosomes 1-2 (Figure 4).
Un autre paramètre qui peut affecter le résultat final est la réticulation de l’échantillon. Bien que la procédure de fixation décrite ici est valable pour la plupart des lignées de cellules, le chercheur doit évaluer soigneusement cette étape pour l’échantillon particulier à l’étude, surtout lors de l’utilisation des tissus, où des temps de fixation plus longues peuvent être nécessaires pour permettre la formaldéhyde atteignent les cellules dans tout l’échantillon de tissu.
Contrairement aux autres méthodes, telles que de la DNase I ou hypersensibilité nucléase micrococcique, puce ou ATAC, FAIRE ne repose pas sur une activité enzymatique ou des anticorps spécifiques, et donc il n’a pas besoin titrage ou l’optimisation des conditions de la réaction. Cela permet de FAIRE une méthode idéale pour mesurer l’accessibilité de la chromatine pour les laboratoires ayant peu d’expérience dans le domaine de la chromatine. En outre, les expériences pilotes sont uniquement tenues afin d’optimiser l’étape de cisaillement de l’ADN et le temps de réticulation, lorsque cela est nécessaire.
La méthode a été initialement développée en levure6, mais il a aussi été étendu aux cellules mammifères. L’ADN purifié avec la méthode FAIRE peut être utilisé pour le séquençage en profondeur, ce qui permet la caractérisation de Génome-large de l’état de la chromatine. Cela s’est déjà avéré utile dans un certain nombre d’études8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Les résultats des expériences de FAIRE-seq montrent un grand chevauchement avec les résultats obtenus par d’autres méthodes comme la DNase I-seq14, même si quelques différences apparaissent. C’est en raison des différences méthodologiques comme par exemple détendues ou réagencés nucléosomes pourraient nuire encore le clivage de la DNase I, alors que ces régions de l’ADN seraient moins enclins à produire des protéines ou l’ADN crosslinks et seraient ainsi déterminées que nucléosome-free régions à l’aide de FAIRE9. En outre, la présence des protéines non histones comme les ARN polymérases ou lecteur de protéines pour les marques épigénétiques pourrait entraîner dans les protéines ou l’ADN crosslinks et serait donc interprétée comme régions de protéine-emballés dans des expériences de FAIRE. Ces limitations sont inhérentes à chaque méthode utilisée pour la détermination de l’état de la chromatine, augmentant ainsi la nécessité d’utiliser une combinaison de différentes méthodes pour obtenir un aperçu complet.

L’ADN génomique des cellules eucaryotes est solidement maintenue dans des nucléosomes, qui doit être supprimé ou transformé afin de permettre l’interaction des autres protéines avec l’ADN. L’activation de la transcription d’un gène mène habituellement à une configuration plus ouverte de sa structure nucléosomique, particulièrement dans les nucléosomes + 11, pour faciliter la transcription par l’ARN polymérase. Aussi, les régions régulatrices comme promoteurs et exhausteurs de subissent des changements dynamiques dans leur accessibilité de chromatine pour permettre l’interaction avec les modificateurs de la chromatine ou de facteurs de transcription2. Plusieurs approches ont été développées afin d’identifier ces régions sans nucléosome. Il s’agit de la sensibilité aux nucléases comme DNase I3 ou une nucléase micrococcique4, qui ne peuvent accéder l’ADN quand il n’est pas étroitement enveloppé autour des nucléosomes. Autres méthodes pour l’identification de la chromatine ouverte ou d’ADN libre incluent l’intégration induite par la transposase de rétrotransposons (dosage pour la chromatine Transposase Accessible, ATAC)5, ou à l’aide de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) anticorps dirigés contre les histones. La méthode FAIRE n’est pas basée sur la capacité d’une enzyme pour atteindre l’ADN ou la fixation d’un anticorps dirigé contre une protéine particulière, mais au contraire s’appuie sur la purification des régions sans nucléosome par une extraction de phénol : chloroforme6,7. Dans cette méthode, l’ADN est lié par covalence à protéines chromatiniennes par le formaldéhyde agent de réticulation et est cisaillé par la suite en petits morceaux par sonication. Régions de chromatine serrés aura abondance ADN/protéine crosslinks, tandis que les régions de l’ADN avec peu ou pas de nucléosomes aura peu ou pas des complexes ADN/protéine réticulé. Une extraction de phénol : chloroforme permet la purification de la non réticulé gratuit ADN dans la phase aqueuse, alors que le réticulé de l’ADN aux protéines est capturée dans la phase organique phénol ou interphase aqueux-organique ainsi que les protéines. La quantification de cet ADN libre par rapport à une référence de l’échantillon d’ADN total permet d’identifier les régions libres de la chromatine. La méthode FAIRE peut être utilisée pour la caractérisation des différentes régions génomiques, comme décrit ici, mais est également appropriée pour l’identification d’accessibilité de la chromatine pangénomique lorsqu’il est couplé au séquençage en profondeur, comme décrit dans différents modèles8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. résultats obtenus par FAIRE-seq et d’autres méthodes telles que l’ATAC-seq sont chevauchent dans une large mesure14. La méthode FAIRE est un très robuste, bon marché et facile à exécuter la méthode pour identifier les régions indemnes de nucléosome. Contrairement aux autres méthodes, elle ne nécessite pas d’expériences pilotes afin de déterminer le niveau approprié de la digestion tel que requis pour les nucléases (DNase-seq, MNase-seq) ou transposases (ATAC-seq) et décrits en détail dans un récent examen15. Les seuls paramètres à régler sont les conditions et dans certains cas, le temps de fixation de la sonication. Cet article décrit un protocole simple qui est schématiquement illustré à la Figure 1 et qui ne nécessite aucun équipement spécial autre qu’un sonicateur. Le protocole peut être effectué dans un délai raisonnablement court et fait FAIRE une méthode simple et fiable pour tester l’accessibilité de la chromatine dans un certain nombre de différents types de cellules allant de poumon cellules11 à cellules primaires provenant de souris foies16.

<table><tbody><tr><td>Phénol :chloroforme :alcool isoamylique 25:24:1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1 ml AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>Support milliTUBE 1ml</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 Focaled-ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de PCR en temps réel StepOnePlus</td><td>Applied Biosistems</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

L’expression des gènes appropriée en réponse à des signaux extracellulaires, c'est-à-dire, transcription des gènes spécifiques aux tissus et lignée, dépend des États très définis d’organisation de la chromatine. L’architecture dynamique du noyau est contrôlée par plusieurs mécanismes et façonne les programmes de sortie transcriptionnelle. Il importe, donc déterminer l’accessibilité de la chromatine locus-spécifiques de façon fiable préférence indépendante des anticorps, qui peuvent être une source potentiellement confondant de la variabilité expérimentale. Accessibilité de la chromatine peut être mesurée par différentes méthodes, y compris le test d’isolement Formaldehyde-Assisted des éléments réglementaires (FAIRE), qui permettent la détermination de l’accessibilité générale de la chromatine dans un nombre relativement faible de cellules. Nous décrivons ici un protocole FAIRE qui permet une identification simple, fiable et rapide des régions génomiques avec un taux d’occupation faible en protéines. Dans cette méthode, l’ADN est par covalence liée aux protéines chromatine utilisant le formaldéhyde comme agent de réticulation et cisaillé en petits morceaux. L’ADN gratuit est ensuite enrichie par extraction phénol : chloroforme. Le ratio d’ADN libre est déterminé par la PCR quantitative (qPCR) ou séquençage de l’ADN (ADN-seq) par rapport à un échantillon de contrôle représentant l’ADN total. Les régions avec une structure plus souple de la chromatine sont enrichies dans l’échantillon d’ADN libre, permettant ainsi l’identification des régions génomiques avec plus faible compaction de la chromatine.

Nous avons utilisé la méthode FAIRE pour mesurer les différences dans l’accessibilité de la chromatine des gènes de MHC classe II dans les cellules HEK293T comme publié19. Gènes codant de MHC classe II sont exprimées en antigène présentant des cellules (CPA), soit constitutivement, soit en réponse à des cytokines signalisation20. L’expression des gènes MHCII est entraînée par un complex activateur qui se lie à des éléments d’ADN spécifiques, appelées boîtes XY, situés dans le promoteur et les activateurs de ces gènes21,22. Cela se reflète au niveau de la chromatine, telle que révélée par notre analyse FAIRE des régions sélectionnées dans les gènes de MHC classe II HLA-DPB1 et HLA-DMA. Ces expériences ont montré que la chromatine est ouverte aux régions englobant les zones XY, alors qu’il est plus compact dans les organes de gène (Figure 2).
Par exemple, pour les calculs, dans cette expérience particulière, nous avons dilué le total échantillon d’ADN 10 fois (facteur de dilution 10), et l’échantillon d’ADN libre n’était pas dilué (facteur de dilution 1) pour le qRT-PCR. Les Cts obtient pour les différentes régions testées et les calculs pour obtenir les rapports de valorisation finale et récupération relative sont répertoriées dans le tableau 2. Ces ratios de récupération relative ont été obtenues à l’aide du promoteur ACTB comme contrôle positif. Notez que ces calculs sont pour l’une des répliques utilisées pour générer les résultats montrés à la Figure 2.
Dans un contexte différent, l’accessibilité de la chromatine a été testée dans un modèle pour l’expression des gènes inductibles. Dans ce cas, on a mesuré les variations rapides de la compaction de la chromatine en réponse au facteur de nécrose tumorale de stimuli pro-inflammatoires (TNF). Les cellules HeLa ont été laissées non traitées ou stimulées avec TNF pendant 1 h, suivie de FAIRE mesurer la compaction de la chromatine à l’expression de contrôle région de promoteur du gène codant pour le TNF-responsive cytokines interleukine 8 (IL8). Ces résultats ont montré une accessibilité de chromatine fortement accrue au promoteur IL8 des cellules stimulées par TNF (Figure 3). L’accessibilité au promoteur de l’IL-8 après que stimulation de TNF est encore plus élevée que celle trouvée dans le promoteur ACTB montrant un remodelage de la chromatine dramatique dans cette région régulatrice. Comme dans ce cas, le ratio de récupération obtenu est supérieur à celui obtenu dans la région utilisée comme témoin positif (promoteur ACTB) le ratio de récupération relative est supérieur à un.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg"> Figure 1 : flux de travail du FAIRE. Les cellules sont réticulé directement dans le flacon de culture cellulaire ou un plat en ajoutant le formaldéhyde (A). Après la trempe de la formaldéhyde, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS froid glace (B) et transférées dans un tube de réaction lorsqu’ils sont remis en suspension dans le tampon de lyse FAIRE et sonication pour déformer l’ADN (C). Une partie aliquote de la chromatine extraite est de-réticulé par chauffage à 65 ° C, pour obtenir la référence de l’ADN totale (D), et ensuite l’ADN gratuit est extraite à l’aide de phénol : chloroforme de la réticulée et les aliquotes de réticulé (E). Enfin, l’ADN est quantifiée, et le ratio de libre vs total QU'ADN est calculé (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg"> Figure 2 : détermination de l’accessibilité de la chromatine dans le MHC classe II gene cluster dans les cellules HEK293T. Les cellules HEK293T ont été analysés par FAIRE. Le rapport entre libre contre l’ADN total (i.e., le taux de récupération relative) a été déterminée pour le promoteur du gène ACTB comme témoin positif, une région de hétérochromatine sur Chr. 12 comme contrôle négatif et les régions régulatrices et organes gène de MHC classe II les gènes HLA-DMA et HLA-DPB1. La partie supérieure montre une représentation schématique du locus et les positions des amorces. Barres d’erreur représentent les écarts-types de deux réplicats biologiques mesurés en géométrie. Modification de la figure d’un rapport publié19. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg"> Figure 3 : modifications de l’accessibilité de l’ADN de IL8 promoteur en réponse au traitement de TNF. Les cellules HeLa ont été stimulées avec TNF (20 ng/mL) pour 1 h et analysées par FAIRE. Le rapport entre libre versus total ADN a été déterminée pour le promoteur de l’ACTB (contrôle positif), une région de l’hétérochromatine sur Chr. 12 (témoin négatif) et le promoteur IL8. Barres d’erreur représentent les erreurs-types de la moyenne (SEM) de trois répétitions biologiques mesurées en doublons. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg"> Figure 4 : optimisation des conditions sonication. La chromatine extraite des cellules 293 t a été sonified en utilisant un sonicateur ciblé avec les tubes appropriés (Table des matières). La chromatine a été sonication pour l’heure indiquée avec des répétitions de 30 s avec les paramètres suivants : puissance crête 150, facteur d’utilisation 15 cycles par burst 500, suivie de 30 s : puissance de crête 2,5, facteur de service 15, cycles par burst 500. La chromatine qui en résulte a été de-réticulé, purifié par extraction au phénol : chloroforme et chargés dans un gel d’agarose de 2 %. Un bromure d’éthidium teinté gel apparaît, tandis que les positions des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées en bp. Dans cette expérience, la taille optimale de la chromatine (200-300 bp) a été obtenue après 20 min de la sonication. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Apprêt</td>
			<td>Séquence</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promoteur-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promoteur-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12-F contrôle négatif</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12 négatif Ctrl-R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-case-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-boîte-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-case-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-boîte-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promoteur-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promoteur-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Amorces pour qPCR.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg"> Tableau 2 : exemple de calcul de Ratios de récupération Relative FAIRE. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

La plasticité d’architecture nucléaire est contrôlée par des mécanismes épigénétiques dynamiques, y compris non codantes ARN, ADN méthylation, repositionnement du nucléosome ainsi que histone composition et modification. Nous décrivons ici un protocole d’isolement Formaldehyde-Assisted des éléments réglementaires (FAIRE) qui permet la détermination de l’accessibilité de la chromatine de façon reproductible, peu coûteuse et simple.

Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

L’objectif global de cette expérience est de déterminer l’accessibilité à la chromatine d’un locus génétique en réticulant de manière covalente l’ADN aux protéines associées, suivie d’une purification et d’une quantification de l’ADN libre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chromatine, car l’accessibilité de l’ADN peut être déterminée, quel que soit le type de cellule, dans les cellules non traitées et également dans les cellules subissant un remodelage de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas l’utilisation d’enzymes pour cliver l’ADN ou d’anticorps qui doivent être titrés pour chaque cadre expérimental.Ce protocole présente l’avantage supplémentaire de ne pas nécessiter d’équipement spécial autre qu’un sonicateur. Olesja Ritter et Tabea Riedlinger, qui sont doctorantes dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer le protocole, ajoutez du formaldéhyde directement dans le milieu de croissance des cellules qui ont été ensemencées la veille, pour atteindre une concentration finale de 1 % volume par volume.Incuber le milieu pendant 10 minutes à température ambiante et faire pivoter les plaques manuellement toutes les deux minutes. Ensuite, ajoutez de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire pour éteindre le formaldéhyde. Incuber la solution pendant cinq minutes à température ambiante et la mélanger toutes les deux minutes.Aspirez le milieu, puis ajoutez délicatement du PBS glacé sur le côté du plat pour laver les cellules. Aspirez le milieu et répétez soigneusement le lavage deux fois. Après le troisième lavage, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS glacé et utilisez un grattoir cellulaire pour détacher les cellules, si nécessaire.Transférez-les dans un tube de réaction de 1,5 millilitre sur de la glace. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 300 g et quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table refroidie. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant.Remettez la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de tampon de lyse FAIRE en pipetant soigneusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace. Après l’incubation, sonicez l’ADN réticulé pour le partager à une taille moyenne de 200 à 300 paires de bases et refroidissez les échantillons pendant la sonication pour éviter de chauffer l’échantillon.La fragmentation de l’ADN est essentielle pour cette expérience, car la taille des fragments affecte la sensibilité de la solution de l’ensemble de la technique, il est donc important d’établir soigneusement les conditions de sonication à l’avance et de vérifier la taille des fragments de chromatine dans chaque expérience. Centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes et 13 000 g à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de réaction.Divisez les échantillons en aliquotes de 100 microlitres. Utilisez une aliquote de 100 microlitres pour inverser la réticulation et à utiliser comme référence pour l’ADN total. Ajoutez 10 microlitres de RNase A et incubez l’échantillon pendant une heure à 37 degrés Celsius.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de protéinase K.Utilisez un thermobloc programmable pour incuber l’échantillon pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, puis pendant six heures à 65 degrés Celsius pour cliver les protéines et inverser les réticulations. Obtenez une nouvelle aliquote de 100 microlitres, ajoutez 10 microlitres de RNase A et incubez l’échantillon pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, procéder en parallèle avec l’échantillon non réticulé et l’échantillon réticulé de la section précédente.Ajouter H2O pour atteindre un volume final de 300 microlitres. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de phénol chloroforme alcool isoamylique dans une hotte et vortex vigoureusement. Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 13 000 g et quatre degrés Celsius.Ensuite, transférez soigneusement 280 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction. Assurez-vous de ne pas prendre de débris de l’interphase, qui contient également des protéines, et jetez la phase inférieure restante comme déchet de solvant organique. Répétez le traitement et transférez soigneusement 270 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction.Ajoutez 270 microlitres de chloroforme dans une hotte et vortex vigoureusement. Centrifugez l’échantillon. Après la centrifugation, transférez soigneusement 250 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction, en prenant soin de ne pas transporter de débris de l’interphase.Jetez l’échantillon restant comme déchet de solvant organique. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires, 250 microlitres d’isopropanol et ajoutez cinq microlitres de glycogène comme support d’ADN. Retournez les tubes et incubez-les à température ambiante.Après l’incubation, centrifugez l’échantillon pour précipiter l’ADN. Ensuite, lavez la pastille d’ADN avec 400 microlitres d’éthanol à 70 % volume par volume et centrifugez l’échantillon. Aspirez soigneusement le surnageant et laissez sécher la pastille pendant 10 minutes à température ambiante.Une fois que le granulé est sec, mettez-le à nouveau en suspension dans 100 microlitres de tampon TE. Incuber l’échantillon d’ADN libre non désticulé pendant quatre heures à 65 degrés Celsius pour éliminer les réticulations inter-ADN. Enfin, quantifiez la quantité d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et effectuez une petite aliquote pour vérifier la taille du fragment sur un gel d’agarose à 2 % en poids par volume.Les cellules HeLA ont été stimulées avec du TNF pendant une heure et analysées par FAIRE. Le rapport entre l’ADN libre et l’ADN total a été déterminé pour le promoteur de l’ACTB, le gène qui code pour la bêta-actine et le contrôle positif, une région d’hétérochromatine sur le chromosome 12, le contrôle négatif et le promoteur de l’IL8. Un gel coloré au bromure d’éthidium présentant différents temps de sonication a été généré et indique que la taille optimale de la chromatine de 200 à 300 paires de bases a été obtenue après 20 minutes de sonication.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage profond peuvent être effectuées afin de déterminer l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde et du phénol chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans une hotte, porter des gants et éliminer correctement les déchets doivent être assurées en effectuant cette procédure.

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Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal

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