Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

L’objectif global de cette expérience est de déterminer l’accessibilité à la chromatine d’un locus génétique en réticulant de manière covalente l’ADN aux protéines associées, suivie d’une purification et d’une quantification de l’ADN libre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chromatine, car l’accessibilité de l’ADN peut être déterminée, quel que soit le type de cellule, dans les cellules non traitées et également dans les cellules subissant un remodelage de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas l’utilisation d’enzymes pour cliver l’ADN ou d’anticorps qui doivent être titrés pour chaque cadre expérimental.

Ce protocole présente l’avantage supplémentaire de ne pas nécessiter d’équipement spécial autre qu’un sonicateur. Olesja Ritter et Tabea Riedlinger, qui sont doctorantes dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer le protocole, ajoutez du formaldéhyde directement dans le milieu de croissance des cellules qui ont été ensemencées la veille, pour atteindre une concentration finale de 1 % volume par volume.

Incuber le milieu pendant 10 minutes à température ambiante et faire pivoter les plaques manuellement toutes les deux minutes. Ensuite, ajoutez de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire pour éteindre le formaldéhyde. Incuber la solution pendant cinq minutes à température ambiante et la mélanger toutes les deux minutes.

Aspirez le milieu, puis ajoutez délicatement du PBS glacé sur le côté du plat pour laver les cellules. Aspirez le milieu et répétez soigneusement le lavage deux fois. Après le troisième lavage, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS glacé et utilisez un grattoir cellulaire pour détacher les cellules, si nécessaire.

Transférez-les dans un tube de réaction de 1,5 millilitre sur de la glace. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 300 g et quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table refroidie. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant.

Remettez la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de tampon de lyse FAIRE en pipetant soigneusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace. Après l’incubation, sonicez l’ADN réticulé pour le partager à une taille moyenne de 200 à 300 paires de bases et refroidissez les échantillons pendant la sonication pour éviter de chauffer l’échantillon.

La fragmentation de l’ADN est essentielle pour cette expérience, car la taille des fragments affecte la sensibilité de la solution de l’ensemble de la technique, il est donc important d’établir soigneusement les conditions de sonication à l’avance et de vérifier la taille des fragments de chromatine dans chaque expérience. Centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes et 13 000 g à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de réaction.

Divisez les échantillons en aliquotes de 100 microlitres. Utilisez une aliquote de 100 microlitres pour inverser la réticulation et à utiliser comme référence pour l’ADN total. Ajoutez 10 microlitres de RNase A et incubez l’échantillon pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de protéinase K.Utilisez un thermobloc programmable pour incuber l’échantillon pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, puis pendant six heures à 65 degrés Celsius pour cliver les protéines et inverser les réticulations. Obtenez une nouvelle aliquote de 100 microlitres, ajoutez 10 microlitres de RNase A et incubez l’échantillon pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, procéder en parallèle avec l’échantillon non réticulé et l’échantillon réticulé de la section précédente.

Ajouter H2O pour atteindre un volume final de 300 microlitres. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de phénol chloroforme alcool isoamylique dans une hotte et vortex vigoureusement. Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 13 000 g et quatre degrés Celsius.

Ensuite, transférez soigneusement 280 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction. Assurez-vous de ne pas prendre de débris de l’interphase, qui contient également des protéines, et jetez la phase inférieure restante comme déchet de solvant organique. Répétez le traitement et transférez soigneusement 270 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction.

Ajoutez 270 microlitres de chloroforme dans une hotte et vortex vigoureusement. Centrifugez l’échantillon. Après la centrifugation, transférez soigneusement 250 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction, en prenant soin de ne pas transporter de débris de l’interphase.

Jetez l’échantillon restant comme déchet de solvant organique. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires, 250 microlitres d’isopropanol et ajoutez cinq microlitres de glycogène comme support d’ADN. Retournez les tubes et incubez-les à température ambiante.

Après l’incubation, centrifugez l’échantillon pour précipiter l’ADN. Ensuite, lavez la pastille d’ADN avec 400 microlitres d’éthanol à 70 % volume par volume et centrifugez l’échantillon. Aspirez soigneusement le surnageant et laissez sécher la pastille pendant 10 minutes à température ambiante.

Une fois que le granulé est sec, mettez-le à nouveau en suspension dans 100 microlitres de tampon TE. Incuber l’échantillon d’ADN libre non désticulé pendant quatre heures à 65 degrés Celsius pour éliminer les réticulations inter-ADN. Enfin, quantifiez la quantité d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et effectuez une petite aliquote pour vérifier la taille du fragment sur un gel d’agarose à 2 % en poids par volume.

Les cellules HeLA ont été stimulées avec du TNF pendant une heure et analysées par FAIRE. Le rapport entre l’ADN libre et l’ADN total a été déterminé pour le promoteur de l’ACTB, le gène qui code pour la bêta-actine et le contrôle positif, une région d’hétérochromatine sur le chromosome 12, le contrôle négatif et le promoteur de l’IL8. Un gel coloré au bromure d’éthidium présentant différents temps de sonication a été généré et indique que la taille optimale de la chromatine de 200 à 300 paires de bases a été obtenue après 20 minutes de sonication.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage profond peuvent être effectuées afin de déterminer l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde et du phénol chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans une hotte, porter des gants et éliminer correctement les déchets doivent être assurées en effectuant cette procédure.