L'isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

L’objectif global de cette procédure est de différencier les cellules TH 17 des lymphocytes T CD 4 positifs naïfs. Ceci est accompli en prélevant d’abord les ganglions lymphatiques et la rate d’une souris adulte C 57 black six. Dans un deuxième temps, les tissus sont broyés pour obtenir une suspension unicellulaire.

Les cellules T négatives CD quatre positives et CD 25 sont ensuite isolées et cultivées dans des conditions de contrôle inductrices ou d’activation de TH 17. En fin de compte, Q-P-C-R-E-I-S-A et la cytométrie en flux peuvent être utilisés pour évaluer l’expression de l’IL 17 A. Cette méthode peut donc donner un aperçu de la différenciation des lymphocytes T CD quatre en cellules T huit, 17 cellules chez les souris C 57 noires.

Il peut également être appliqué à d’autres modèles de souris. La démonstration de cette méthode est essentielle car les ganglions lymphatiques sont très petits, ce qui rend les étapes de dissection difficiles. Sans visualisation directe de cette méthode, Au moins quatre heures avant l’ajout des cellules enrobent les puits d’une nouvelle plaque de culture tissulaire de micro-test UBO de 96 puits avec 30 microlitres d’anti CD, trois dilués dans du PBS stérile, tapotez les côtés de la plaque pour assurer une couverture uniforme des puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius après quatre heures, Réfrigérez l’assiette jusqu’à ce qu’il soit temps d’ajouter les cellules.

Après avoir confirmé la mort par luxation cervicale, stérilisez la zone d’incision sur une souris adulte C 57 black six avec 70 % d’éthanol. Saisissez ensuite la peau antérieure à l’ouverture de l’urètre et coupez de la ligne médiane ventrale jusqu’à la zone du menton, en prenant soin de ne pas perturber le péritoine. Ensuite, épinglez la peau pour permettre l’accès aux ganglions lymphatiques et à la rate pour l’enlever.

Retirez maintenant les ganglions lymphatiques axillaires situés près de l’aisselle de la souris derrière les muscles pectoraux et placez le tissu dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de tampon de course AutoMax. Ensuite, retirez les ganglions lymphatiques brachiaux situés dans le tissu conjonctif près de chaque aisselle. Ensuite, retirez les ganglions lymphatiques cervicaux superficiels situés dans le cou de l’animal, flanquant la trachée, puis retirez les ganglions lymphatiques inguinaux situés dans la région de la hanche à la conjonction des trois vaisseaux sanguins.

Pour accéder aux ganglions lymphatiques mésentériques, coupez d’abord la ligne médiane ventrale à travers la muqueuse péritonéale. Les ganglions lymphatiques mésentériques sont situés profondément dans le mésentère de la souris, généralement dans un cordon de quatre à huit nœuds qui peut apparaître comme un collier de perles. Retirez la rate, en la tirant et en la détachant du pancréas.

Ensuite, placez-le dans la boîte de Pétri avec les ganglions lymphatiques pour broyer les organes. Placez les ganglions lymphatiques sur le côté givré d’une lame de microscope, puis frottez les tissus avec le côté givré d’une deuxième lame. Pour filtrer les organes broyés en une suspension unicellulaire, pliez d’abord plusieurs fois un morceau d’environ trois pouces sur trois pouces de nylon de 40 microns et placez-le dans le haut d’un tube de centrifugation de 15 millilitres.

Utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 21 pour aspirer les cellules et le tampon, puis distribuer lentement la solution cellulaire dans le nylon plié. En prenant soin d’éviter de percer la matière avec l’aiguille. Une fois qu’une suspension unicellulaire a été obtenue, la solution doit sembler cohérente avec aucun morceau visible de tissu solide.

Placez cette solution sur de la glace. Après avoir trié les cellules par séparation AutoMax jusqu’à une pureté de cellule d’au moins 80 % CD, quatre CD positifs et 25 négatifs. Comptez les cellules par exclusion du bleu trian, puis diluez la suspension cellulaire à une fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture cellulaire.

Rincez maintenant tous les puits de la plaque anti CD à trois couches avec 200 microlitres de PBS. Chacun jetant le linge dans un conteneur à déchets. Ajoutez ensuite 100 microlitres de mélanges de cocktail ou de contrôle d’activation TH 17 dans les puits appropriés en trois exemplaires.

Enfin, ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque puits et incubez les cellules pendant au moins 72 heures ou jusqu’à cinq jours pour obtenir une différenciation cellulaire TH 17 pour Eli SA et QPCR. Après la période d’incubation, regrouper les triplés de chaque échantillon dans des tubes einor individuels. Après avoir fait tourner les cellules, transférez le surnageant dans des tubes einor séparés et stockez-le à moins 20 degrés Celsius pour mesurer plus tard la production d’IL 17 A par ELI.

A.To préparer la QPCR après avoir retiré le surnageant en suspension, les granules restantes dans 175 microlitres, tampon de lyse de l’ARN pour une extraction immédiate de l’ARN ou stocker à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à commencer la procédure après la période d’incubation. En préparation de l’activation cellulaire avant l’IL-17, un pool de coloration intracellulaire de chacune des cellules de contrôle inductrices ou d’activation du TH 17 triplées dans les puits individuels d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Ajoutez 400 microlitres de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.

Pour porter le volume total à un millilitre, ajoutez ensuite de la mycine ionique PMA et du felden A dans chaque puits et incubez les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius pour détecter la présence d’IL 17 A par coloration intracellulaire et cytométrie en flux. Tout d’abord, transférez les cellules de chaque puits de la plaque à 24 puits dans un tube einor séparé. Ensuite, faites tourner les tubes.

Retirez les surnageants et remettez en suspension les pastilles de cellule dans 200 microlitres de tampon de télécopie. Transférez les cellules remises en suspension dans une plaque de cytométrie à flux de 96 puits et faites tourner à nouveau les cellules après avoir lavé les pastilles dans 200 microlitres de tampon de fax, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon de fax et ajoutez 100 microlitres du mélange de coloration des anticorps extracellulaires. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.

Après avoir lavé les cellules deux fois, incubez les granulés dans 100 microlitres de BD cyto. Fixez le tampon cyto perm recouvert d’une feuille d’aluminium pendant 20 minutes à température ambiante. Maintenant, lavez les cellules deux fois dans 100 microlitres d’un tampon de lavage permanent X BD, puis incubez les cellules dans 50 microlitres de mélange d’anticorps intracellulaires recouverts d’une feuille d’aluminium pendant 15 minutes à température ambiante.

Après avoir lavé à nouveau les cellules, suspendez-les dans 200 microlitres de tampon de coloration BD, puis transférez les cellules dans des tubes de cytométrie en flux contenant 200 microlitres de tampon de coloration. Conservez les tubes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être lus pour l’analyse cytométrique en flux des échantillons, première porte sur la population de cellules vivantes. Ensuite, utilisez la population de cellules vivantes pour bloquer la population de CD quatre positifs et de CD huit négatifs.

Enfin, à partir de la démarche de la population CD quatre positive CD huit négative sur la population IL 17 A positive pour différencier les cellules TH 17, les cellules ganglionnaires et spléennes non fractionnées doivent être enrichies pour la population de cellules T CD 25 négatives DC 4 positives. Dans cette figure, des cellules ganglionnaires groupées non fractionnées, des cytes SP et des fractions de cellules TT séparées par AutoMax colorées avec anti CD quatre et anti CD 25 sont représentées. Ce premier nuage de points montre un profil représentatif du pourcentage de lymphocytes CD 4 positifs, CD-25 positifs et CD-25 négatifs positifs présents dans les ganglions lymphatiques et les cellules de la rate non fractionnés.

La procédure d’isolement fournit également une population enrichie de CD quatre CD 25 positifs treg positifs qui peut être utilisée dans des expériences supplémentaires. Dans ce dernier nuage de points, l’enrichissement cellulaire souhaité avec une population composée à 84 % de cellules T CD quatre positifs CD 25 négatifs est illustré. Cette population enrichie de lymphocytes T CD 25 positifs et négatifs contribue à assurer une différenciation plus réussie des lymphocytes T 17, comme l’illustre cette figure.

Alors que l’incubation de lymphocytes T CD 25 négatifs positifs avec des lymphocytes CD trois et antiCD 28 pendant cinq jours produit des lymphocytes T CD 25 positifs dans des conditions induisant TH 17 produit un sous-ensemble de lymphocytes CD 17 produisant des lymphocytes CD 4 positifs CD 25 positifs. L’état de différenciation de TH 17 peut être évalué plus en détail par PCR quantitative et les données d’Elis A ici les données de lymphocytes T CD 4 positifs enrichis CD 25 négatifs incubés sous contrôle ou de conditions induisant TH 17 sont montrées CD quatre positifs. Les lymphocytes T CD 25 négatifs incubés dans des conditions TH 17 régulent à la hausse l’IL 17 A, ce qui peut être déterminé par QPCR et ELI SA. Le facteur de transcription spécifique de TH 17, ROAR gamma T, est également régulé à la hausse par quatre lymphocytes T CD 25 négatifs positifs incubés dans des conditions inductrices de TH 17, comme cela peut être mesuré par QPCR.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’obtenir une pureté cellulaire d’au moins 80 % de CD, quatre cellules positives et négatives avant d’incuber les cellules dans des conditions d’induction de TH 17. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les ganglions lymphatiques et la rate de souris C 57 black six, comment incuber des cellules dans des conditions de contrôle T huit 17 ou d’activation, et comment évaluer la différenciation des lymphocytes T CD quatre naïfs en cellules T huit 17 Sud.