Utilisation pratique de l’interférence d’ARN : l’administration orale d’ARN Double brin dans Liposome transporteurs pour les blattes

L’objectif global de ce protocole est d’appauvrir l’expression génique dans l’intestin des cafards en utilisant l’interférence ARN via l’ingestion orale d’ARN double brin encapsulé dans des transporteurs de liposomes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement de nouvelles méthodes de lutte antiparasitaire, telles que l’élimination de gènes essentiels en plein champ peut-elle tuer les ravageurs ? Le principal avantage de cette technique est que le liposome protège l’ARN double brin spécifique du gène pour assurer sa livraison à la cellule cible.

Jia-Hsin Huang, post-doctorante, et Yun Liu, un technicien de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, anesthésez les cafards sur de la glace jusqu’à ce qu’ils ne bougent plus pendant trois minutes. Ensuite, ramassez un insecte à l’aide du pouce et de l’index pour accéder à sa face ventrale.

Ensuite, utilisez des ciseaux à disséquer pour couper le bout d’une coxa d’une patte arrière entre la coxa et le trochanter. La coupe ailleurs sur la coxa est moins efficace pour les collections d’hémolymphe. Maintenant, placez une micropipette de 10 microlitres sur l’incision et pressez doucement l’abdomen tout en aspirant l’hémolymphe saignante.

Répétez ce processus jusqu’à ce que l’hémolymphe de cinq cafards ait été recueillie dans un seul tube de microcentrifugation. Ensuite, faites tourner brièvement l’hémolymphe accumulée pendant 10 secondes. Ensuite, combinez 10 microlitres d’hémolymphe avec 50 microlitres de 1x tampon salin pour insectes.

Maintenant, centrifugez l’hémolymphe diluée pendant 10 minutes pour extraire les hémocytes de la solution. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube. Enfin, quantifiez la concentration totale de protéines à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de microvolume et ajustez la concentration de chaque échantillon à six milligrammes de protéines par microlitre.

Pour recueillir le jus de l’intestin moyen, anesthésiez d’abord les cafards sur de la glace. Ensuite, transférez-en un sur une plaque de dissection chargée de 1x tampon salin pour insectes froid, et utilisez des épingles à insectes pour le fixer côté ventral vers le haut. Maintenant, disséquez l’abdomen à l’aide d’une pince à épiler fine.

Ensuite, retirez tout l’intestin et transférez-le dans un plat frais avec 1 tampon salin pour insectes. Ensuite, isolez l’intestin moyen, c’est-à-dire la région située entre la culture et les tubules de Malpighian. Pour ce faire, retirez la partie avant de l’animal et retirez l’intestin postérieur.

Ensuite, transférez rapidement l’intestin moyen dans un tube de microcentrifugation avec 100 microlitres de tampon salin pour insectes. Collectez les intestins moyens de six cafards dans le même tube. Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant 10 secondes.

Ensuite, centrifugez le mélange pendant 10 minutes pour séparer les hémocytes et les tissus intestinaux. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre et ajustez la concentration à six milligrammes de protéines par microlitre. Les lipoplexes d’ARN double brin doivent être utilisés dans l’heure qui suit la préparation.

Lors de leur préparation, assurez-vous de combiner en même temps tout le réactif dilué avec l’ARN double brin dilué. Ensuite, vortex rapidement et incubez le mélange. Une fois prêt, mélangez quatre microlitres de la solution d’ARN double brin avec 10 microlitres de tampon salin d’insecte comme contrôle, ou mélangez-le avec 10 microlitres d’enzymes extraites de l’hémolymphe ou du jus de l’intestin moyen.

Ensuite, faites un contrôle inhibé par une enzyme en ajoutant deux microlitres d’EGTA. Sinon, ajoutez deux microlitres d’eau sans RNase. Ensuite, incubez les échantillons pendant une heure ou plus à 25 degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez 200 microlitres de réactif d’extraction et 40 microlitres de chloroforme, puis vortex. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 10 minutes. Ensuite, transférez 150 microlitres de chaque surnageant dans un nouveau tube et précipitez l’ARN double brin de chaque échantillon en ajoutant 150 microlitres d’isopropanol et en incubant les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes.

Après l’incubation, centrifugez à nouveau les échantillons et jetez le surnageant. Ensuite, lavez deux fois les granulés d’ARN en ajoutant 200 microlitres d’éthanol à 70 % à chaque granulé et en centrifugeant le tube. Après le deuxième lavage, séchez les granulés d’ARN double brin à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide pendant trois minutes.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 10 microlitres d’eau sans RNase. Enfin, vérifiez l’intégrité de l’ARN double brin traité à l’aide d’un gel d’agarose à 1,5 %. Nourrissez les cafards deux fois par jour, une heure après l’allumage des lumières et une heure avant l’extinction des lumières.

Faites-le pendant huit ou 16 jours sans pause. Pendant ce temps, les cafards devraient être privés d’eau. Pour l’alimentation, ayez à disposition des lipoplexes d’ARN double brin fraîchement préparés et de l’ARN double brin nu.

Pour le bolus, utiliser avec quatre microlitres de lipoplexes d’ARN double brin ou 250 nanogrammes d’ARN double brin nu. Pour nourrir un cafard, saisissez-le d’abord par les ailes à l’aide d’une pince flexible. Ne saisissez pas les parties du corps d’un cafard.

Ensuite, pipetez lentement la gouttelette de solution près des pièces buccales et observez le cafard ingérer la gouttelette. Après le dernier repas, fournissez des bouteilles d’eau aux cafards. Tout au long de la période d’alimentation, évaluez quotidiennement les insectes pour vérifier s’il n’y a pas de mortalité et retirez les cafards qui ne bougent plus de l’expérience.

L’administration orale continue de lipoplexes à double brin a permis de réduire l’expression de la tubuline dans l’intestin moyen de 40 % au neuvième jour à 60 % au 17e jour. En comparaison, l’ARN double brin nu n’a eu aucun effet. Cela est probablement dû au fait que l’exposition de l’ARN double brin nu au jus de l’intestin moyen a entraîné une dégradation en l’heure, tandis que l’ARN double brin conjugué aux liposomes est resté stable.

Non seulement les niveaux d’ARN ont diminué, mais l’alimentation continue des lipoplexes d’ARN double brin de tubuline a également entraîné une létalité significative. Il est peu probable que cela soit dû au vecteur, car les lipoplexes transportant l’ARN double brin vers l’EGFP n’ont entraîné aucune létalité. Lors de la tentative de ce système d’administration orale d’interférence ARN, il est important d’effectuer une alimentation continue d’ARN double brin pendant plusieurs jours.

Une fois maîtrisé, l’étape d’alimentation peut se faire en deux minutes par insecte si elle est bien exécutée. Si nécessaire, différentes formulations de nanoparticules de liposomes peuvent être appliquées pour améliorer la procédure d’alimentation et l’efficacité de l’ARNi. En fin de compte, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la lutte antiparasitaire d’explorer de nouvelles stratégies de lutte à l’aide de l’ARNi.