Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

L’objectif global de cette technique est de fabriquer, d’étalonner et d’utiliser des microélectrodes monopolaires sélectives d’ions potassium. L’utilisation de telles électrodes permet d’évaluer quantitativement la dynamique de la concentration en ions potassium évoqués dans des tranches de cerveau adultes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en physiologie, telles que l’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’homéostasie des ions potassium dans le système nerveux central.

Le principal avantage de cette technique est qu’en plus d’être une méthode de fabrication facile et directe, les capteurs à microélectrodes représentent l’étalon-or pour la mesure de la concentration en ions potassium. Pour préparer les capillaires en verre borosilicaté à la silanisation, placez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Remplissez le tube conique avec de l’acide chlorhydrique à une molaire et incubez les capillaires de verre dans de l’acide chlorhydrique avec une agitation douce pendant la nuit pendant au moins six heures.

Ensuite, rincez brièvement les capillaires avec de l’éthanol à 70 %, puis séchez-les complètement à 100 à 120 degrés Celsius pendant six à huit heures. Conservez les capillaires lavés dans des récipients contenant un dessiccant anhydre à base de sulfate de calcium jusqu’à quatre semaines avant de les utiliser à nouveau. Avant la silanisation, tirez les capillaires vers une pointe fine à l’aide d’un extracteur de microélectrodes.

Ensuite, placez les microélectrodes dans un récipient en verre à l’aide de ruban adhésif autoclavable, de sorte que les électrodes soient surélevées par le bas pour éviter la rupture de la pointe. Ensuite, retirez environ 0,5 millilitre de solution de silanisation DDS à 5 % de son contenant en utilisant la méthode de remplacement de l’azote. Remplissez un ballon d’azote gazeux et fixez une seringue ou un tube et une aiguille au ballon.

Ensuite, insérez l’aiguille dans le récipient DDS tout en aspirant le DDS dans une seringue séparée à l’aide d’une aiguille plus longue. Ensuite, appliquez la solution de silanisation goutte à goutte sur les pointes des pipettes et couvrez immédiatement le récipient. Placez le récipient contenant les microélectrodes avec la solution de silanisation dans un four de laboratoire préchauffé à 170 à 180 degrés Celsius pendant 10 à 12 heures ou à 200 à 220 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, sortez la plaque du four. Placez la plaque sur un banc à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour permettre à la verrerie de refroidir. Retirez les microélectrodes de la plaque et placez-les dans un récipient hermétique rempli de dessiccant.

microélectrodes silanisées maintenues à l’abri de l’humidité peuvent être utilisées jusqu’à une semaine après la silanisation. Pour amorcer les électrodes, préparez une solution mère de cocktail d’ionophores de potassium et conservez-la dans un récipient hermétique et opaque à température ambiante. Ensuite, préparez une solution mère de chlorure de sodium de 10 millimolaires tamponné par HEPES à 300 millimolaires à pH 7,4.

Fixez l’électrode dans une pince. Par la suite, à l’aide d’un instrument contondant, ratissez l’extrémité de l’électrode à environ 10 à 20 micromètres de large, puis remplissez l’électrode avec le chlorure de sodium tamponné HEPES à l’aide d’un embout MicroFil de calibre 28 relié à une seringue. Observez que la solution saline a atteint l’extrémité de l’extrémité de la pointe de la microélectrode et assurez-vous que la microélectrode est exempte de grosses bulles qui pourraient interférer avec le flux de courant.

À l’aide d’une micropipette, appliquez une petite goutte de l’ionophore de potassium près de l’extrémité de la microélectrode. Si l’électrode a été correctement silanisée, la gouttelette sera absorbée dans la pointe cassée. Remplissez l’électrode à environ 1 millimètre avec l’ionophore de potassium et retirez l’excédent à l’aide de papier de soie.

Pour calibrer les microélectrodes, bullez toutes les solutions d’étalonnage et coupez en tranches les solutions tampons avec 95 % d’oxygène/5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes avant de commencer l’expérience. Commencez à perfuser le bain avec de l’ACSF contenant des ions potassium de 4,5 millimolaires à un rythme de trois millilitres par minute. Placez l’électrode sélective d’ions potassium dans le porte-électrode fixé à la tête de l’électrode sur le manipulateur.

Ensuite, insérez l’extrémité de l’électrode dans le perfusat de bain. Assurez-vous que l’électrode de terre argent/chlorure d’argent baigne dans la même solution et que le débit est régulier. Appliquez les solutions d’étalonnage étape par étape et notez les changements potentiels en millivolts à travers la pointe de l’électrode.

Attendez que le potentiel à la pointe de l’électrode atteigne une valeur stable avant de passer à la solution suivante. Ensuite, mesurez la variation de tension à l’état stationnaire en réponse à l’application des solutions d’étalonnage sur la pointe de l’électrode. Confirmer que la pente de la réponse en tension de l’électrode est d’au moins 52 et d’au plus 59 millivolts par variation de dix fois de la concentration de potassium.

Pour préparer des tranches d’hippocampe, faites une incision de deux à trois centimètres de la partie caudale du crâne pour couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane. Tout en rétractant manuellement le cuir chevelu, faites deux incisions horizontales d’un centimètre à partir du foramen magnum le long des côtés du crâne. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins, faites une incision le long de la ligne médiane de l’arrière du crâne jusqu’au nez.

Ensuite, insérez une pince fine près de la ligne médiane et rétractez le crâne incisé en deux parties. Extrayez le cerveau de la souris du crâne et utilisez une lame pour retirer le cervelet, le cortex préfrontal et les bulbes olfactifs, qui sont respectivement situés dans les parties caudale et rostrale du cerveau. Ensuite, montez le bloc cérébral sur le plateau du vibratome à l’aide de Super Glue.

Remplissez le plateau du vibratome avec une solution de coupe glacée. Ensuite, coupez des sections de tissu sur la plaine coronale à une épaisseur de 300 micromètres. Habituellement, quatre à six tranches coronales d’hippocampe peuvent être collectées.

Une fois chaque section coupée, transférez immédiatement la tranche dans le bécher porte-tranche chauffé à 32 à 34 degrés Celsius. Gardez les sections à cette température pendant 20 minutes avant de transférer le bécher avec les sections à température ambiante pendant au moins 20 à 30 minutes avant l’enregistrement. Pour mesurer la dynamique des ions potassium, placez délicatement la tranche de cerveau dans le bain à l’aide d’une pipette Pasteur et maintenez-la doucement en place avec une harpe en platine avec des cordes en nylon.

Assurez-vous que les pointes de l’électrode de stimulation bipolaire sont à peu près parallèles les unes aux autres et qu’elles sont au même niveau que la plaine de la tranche. Pendant cinq à sept secondes, insérez lentement les électrodes dans la couche radiale CA3 à environ 40 à 50 micromètres de profondeur pour stimuler les collatéraux de Schaffer. Ensuite, insérez soigneusement l’électrode sélective d’ions potassium dans la couche radiale CA1 jusqu’à environ 50 micromètres de profondeur en abaissant lentement l’électrode pendant environ trois à quatre secondes.

Laissez le potentiel se stabiliser à travers l’électrode avant d’appliquer des stimulations à la tranche, ce qui prend généralement de cinq à 10 minutes. Si la tranche présente des changements spontanés excessifs dans les concentrations d’ions potassium extracellulaires, jetez-la et répétez le processus avec une nouvelle tranche. Pour mesurer la libération d’ions potassium évoqués, appliquez des trains de stimulation électrique via l’isolateur de stimulus tout en enregistrant numériquement les réponses.

Appliquez une stimulation à 10 hertz et une milliseconde par impulsion à partir d’une amplitude de stimulus de 10 microampères. Appliquez des amplitudes de stimulation croissantes d’un facteur deux jusqu’à ce qu’une amplitude maximale de réponse potassique soit détectée. Si aucune réponse n’est observée, rapprochez la position de l’électrode sélective d’ions potassium du site de stimulation par incréments de 100 micromètres.

Pour confirmer que les changements de concentration en ions potassium sont médiés par l’activation du potentiel d’action des collatéraux de Shaffer activés électriquement, appliquez en bain 0,5 TTX micromolaire dans l’ACSF pendant 10 minutes et répétez le protocole de stimulation. Aucune réponse évoquée ne doit être observée. Après avoir amorcé les électrodes avec la solution saline tamponnée HEPES et l’ionophore de potassium, les électrodes peuvent être testées pour leur réponse rapide aux changements progressifs des concentrations d’ions potassium dans le bain et pour la réponse linéaire aux changements d’ions potassium dans le bain sur la plage d’étalonnage de 0,1 à 100 millimolaires d’une manière prédite par l’équation de Nernst.

Le potentiel à l’état d’équilibre peut être tracé en fonction de la concentration en ions potassium du bain afin de déterminer la pente de la droite, qui doit être d’environ V 58,2 millivolts et d’au moins 52 millivolts par démultiplication par dix de la concentration en ions potassium. La réactivité des électrodes sélectives du potassium a été testée plus en détail et la réponse à une augmentation de 5,5 millimolaires du potassium a été observée avec des constantes de temps de montée et de décroissance d’environ 85 millisecondes. Une fois que les électrodes de stimulation et de sélection des ions potassium ont été placées dans le tissu et que l’enregistrement a atteint une ligne de base stable, des impulsions d’amplitude de courant croissante peuvent être appliquées.

La forme d’onde de cette activité se présente sous la forme d’une augmentation rapide du potassium avec un taux de décroissance exponentiel, qui est aboli avec l’application de TTX. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois à quatre heures si elle est exécutée avec soin et précision. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder la pointe de l’électrode aussi petite que possible pour permettre des enregistrements précis, mais suffisamment grande pour permettre un faible bruit.