Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mutagenèse transcriptionnelle, telles que les sous-unités de l’ARN polymérase ou les processus biologiques qui contrôlent la fidélité de la transcription. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer les erreurs de transcription endogènes dans les transcriptomes des organismes eucaryotes. En général, les personnes qui ne connaissent pas ce protocole auront du mal en raison de la longueur et de la complexité du test et de la nécessité d’une bio-informatique avancée pour interpréter les données.

Pour commencer le protocole, circularisez les fragments d’ARN en dénaturant à la chaleur 20 microlitres de l’échantillon préalablement préparé à 65 degrés Celsius pendant une minute. Au bout d’une minute, placez immédiatement l’échantillon sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de tampon 10x T4 RNA ligase, quatre microlitres d’ATP 10 milliMolaires, un microlitre d’inhibiteur de RNase, un microlitre d’eau sans nucléase et huit microlitres de polyéthylène glycol à 50 %, ou PEG.

Ensuite, mélangez soigneusement l’échantillon par vortex. Ajoutez ensuite deux microlitres de 10 unités par microlitre d’ARN ligase T4 un. Mélangez à nouveau l’échantillon par pipetage et incubez-le à 25 degrés Celsius pendant deux heures dans un thermocycleur avec la température du couvercle réglée à 30 degrés Celsius.

Après l’incubation de deux heures, ajoutez 10 microlitres d’eau sans nucléases à l’échantillon et nettoyez l’échantillon avec un kit de nettoyage et de concentration d’oligo-éléments. Éluer l’échantillon dans 20 microlitres d’eau sans nucléases. Pour transcrire inversement les molécules d’ARN circulaires, ajoutez quatre microlitres de 10 milliMolaires de dNTP, quatre microlitres de 50 nanogrammes par microlitre d’hexamères aléatoires et neuf microlitres d’eau sans nucléases à neuf microlitres d’ARN.

Mélangez soigneusement par pipetage et dénaturez l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant une minute. Après avoir dénaturé l’échantillon, placez-le sur de la glace pendant deux minutes. Ajoutez à l’échantillon huit microlitres de tampon de synthèse 5x premier brin, deux microlitres de DTT 0,1 millimolaire et quatre microlitres de transcriptase inverse de 200 unités par microlitre et mélangez par pipetage.

Incuber l’échantillon à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes avec le couvercle réglé cinq degrés Celsius au-dessus de la température d’incubation. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 20 minutes à 42 degrés Celsius avec le couvercle réglé à 47 degrés Celsius. Éluer l’échantillon dans 42 microlitres de solution d’élution après nettoyage avec le kit de nettoyage et de concentration.

Utilisez le kit de synthèse du deuxième brin pour générer une banque d’ADNc double brin. Placez les échantillons sur de la glace et ajoutez 30 microlitres d’eau NF à 38 microlitres de votre échantillon. Ensuite, ajoutez huit microlitres de tampon 10x deuxième brin et quatre microlitres d’enzyme deuxième brin et mélangez l’échantillon par pipetage doux avant de l’incuber à 16 degrés Celsius pendant deux heures et demie.

Nettoyez les échantillons avec le kit de nettoyage et de concentration d’oligo pour des réactions de 100 microlitres et éluez les échantillons dans 38 microlitres d’eau sans nucléases. Mélangez la réaction de réparation d’extrémité par pipetage et incubez-la à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Suivez l’incubation à 20 degrés Celsius avec une incubation de 30 minutes à 65 degrés Celsius.

Tout d’abord, diluez les adaptateurs pour le séquençage de nouvelle génération dix fois dans 10 milliMolaires tris HCl jusqu’à une concentration finale de 1,5 microMolaire. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’adaptateur dilué et un microlitre d’activateur de ligature à chaque échantillon et mélangez-les par vortexing. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de mélange maître TA ligase émoussé.

Pipetez l’échantillon de haut en bas pour le mélanger et incubez-le à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez trois microlitres d’enzyme réactif d’excision spécifique de l’uracile et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois la ligature terminée, ajoutez 13,5 microlitres d’eau sans nucléases à l’échantillon pour un volume total de 100 microlitres et procédez à la sélection de la taille.

Acclimatez les billes magnétiques à la température ambiante. Ajoutez 30 microlitres de billes magnétiques acclimatées et remises en suspension à chaque échantillon et mélangez par pipetage. Transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre et incubez-le à température ambiante pendant cinq minutes.

Placez l’échantillon sur un support magnétique pendant cinq minutes pour séparer les billes du surnageant. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et jetez les billes magnétiques. Ajoutez une aliquote fraîche de 15 microlitres de billes magnétiques à chaque échantillon.

Bien mélanger par pipetage et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Placez les échantillons sur une grille magnétique et incubez-les pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, retirez et jetez soigneusement les surnageants, en veillant à ne pas déranger les billes.

Ajoutez 200 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % à chacun des échantillons sans perturber les billes magnétiques granulées et incubez pendant 30 secondes. Ensuite, éliminez complètement toute trace d’éthanol des échantillons et faites sécher les billes à l’air libre pendant cinq minutes, mais veillez à ne pas trop sécher les billes. Pour éluer les échantillons des billes, retirez les tubes du support magnétique.

Ajoutez 19 microlitres de 10 milliMolaires de tris HCl. Pipetez le mélange de haut en bas plusieurs fois pour remettre les billes en suspension et incubez les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante. Replacez les échantillons sur le support magnétique et incubez-les pendant cinq minutes pour séparer les billes du surnageant.

Retirez soigneusement 15 microlitres du surnageant contenant les banques d’ADNc purifiés et de taille sélectionnée des tubes et transférez-le dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ajoutez cinq microlitres d’amorce universelle et cinq microlitres d’une amorce d’index unique à chaque banque d’ADNc purifié et mélangez-les soigneusement par pipetage. Vérifiez soigneusement que le mélange maître par polymérase ne contient pas de cristaux et d’autres précipités et réchauffez le mélange principal à la main jusqu’à ce que les précipités se dissolvent.

Ajoutez 25 microlitres de mélange maître de polymérase à l’échantillon. Mélangez l’échantillon par pipetage et suivez les conditions de cycle énumérées dans le protocole de texte d’accompagnement pour l’amplification par PCR. Nettoyez les banques finales en ajoutant 45 microlitres de billes magnétiques en suspension directement à la réaction PCR.

Mélangez-les par pipetage et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre et placez-le dans un support magnétique pendant cinq minutes. Après l’incubation, jetez le surnageant et lavez-le deux fois avec de l’éthanol à 80 % fraîchement préparé pendant 30 secondes.

Après le deuxième lavage, retirez complètement l’éthanol de l’échantillon et séchez la pastille de bille à l’air libre pendant cinq minutes. Ensuite, éluez-le en 35 microlitres de 0,1x TE. Remettez les billes en suspension en les pipetant et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois que le tube a été sur le support magnétique pendant cinq minutes, transférez 30 microlitres du surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre.

Stockez les bibliothèques à moins 80 degrés Celsius. Après isolement de l’ARN, deux pics distincts d’ARNr sont visibles sur l’électrophorétogramme. La fragmentation de l’ARN se traduira par 50 à 70 paires de fragments d’ARN.

La transcription inverse en cercle roulant a été utilisée pour générer des molécules d’ADNc composées d’au moins trois répétitions en tandem des matrices d’ARN circulaires. La sélection de la taille avec des billes magnétiques permet de purifier les bibliothèques de la taille appropriée. Les informations de séquençage d’une seule bibliothèque C-seq montrent que la plupart des répétitions ont tendance à avoir une longueur de 45 à 80 bases.

Environ 50 % des bases qui ont été séquencées font partie de ces répétitions. Étant donné que la plupart de ces bases sont présentes dans des débits contenant trois répétitions ou plus, le nombre de bases uniques qui sont séquencées est d’environ un tiers du nombre total de bases séquencées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois jours si elle est bien exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de toujours maintenir un environnement de travail stérile, exempt d’ARN qui pourraient interférer avec votre travail. Il est également important de suivre attentivement chaque étape pour s’assurer qu’aucune erreur n’est commise pendant la procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les erreurs de transcription chez les eucaryotes à l’aide du test C-seq.