Name: Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez une méthode de séquençage pour surveiller la fidélité transcriptionnelle dans les organismes eucaryotes. Cette technique permet de mesurer les erreurs de transcription endogènes et d'étudier la mutagenèse transcriptionnelle.

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Cette publication a été rendue possible par le financement de subventions T32ES019851 (de C. Fritsch), R01AG054641 et un jeune chercheur AFAR accordent (à M. Vermulst).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
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<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la préparation des bibliothèques C-seq pour la détection des erreurs de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole a de nombreux avantages par rapport aux protocoles existants, ainsi que des techniques alternatives.
Au cours des 15 dernières années, nombreux journaliste ont élaboré des systèmes qui dépendent de la luciférase7,</s...

Le génome fournit un plan biologique précis de la vie. Pour mettre en oeuvre ce plan correctement, il est important pour le génome à transcrire avec une grande précision. Cependant, la transcription est peu susceptible d’être sans erreur. Par exemple, les ARN polymérases ont longtemps été connus pour être sujette à vitro1,2, et récemment il a été démontré qu’ils commettent erreurs en vivo ainsi3,5,6, en particulier lorsqu’ils sont confrontés avec l’ADN des dommages7,8,9,10. Pris ensemble, ces observations indiquent que transcription des erreurs se produisent en permanence dans toutes les cellules vivantes, ce qui suggère qu’ils pourraient être une puissante source de protéines mutées.
Ce processus, appelé transcriptional mutagénèse, diffère de la mutagenèse classique de deux façons. Tout d’abord, contrairement aux mutations génétiques, erreurs de transcription affectent les cellules mitotiques et post-mitotiques, car ils ne dépendent pas de la réplication de l’ADN. Étudie les mécanismes qui influent sur la fidélité de la transcription fournira, par conséquent, un aperçu précieux dans la charge de la mutation des cellules mitotiques et post-mitotiques. Fait intéressant, les erreurs de transcription ont été récemment impliqués dans la promotion de l’agrégation de protéines11,12,13 et ont émis l’hypothèse pour contribuer à tant de carcinogenèse10 et la développement de résistance aux antibiotique chez les bactéries,14.
Deuxièmement, contrairement aux mutations génétiques, les erreurs de transcription sont transitoires dans la nature. Leur existence temporaire est particulièrement difficile car il fait des erreurs de transcription extrêmement difficiles à détecter. Par exemple, alors que plusieurs laboratoires ont conçu des dosages de journaliste précieux pour l’étude de la mutagénèse transcriptionnel, ces tests ne sont capables de mesurer les erreurs de transcription dans un nombre limité de contextes et modèle organismes4,15. Pour surmonter ces limites, de nombreux chercheurs sont tournent vers la technologie de séquençage de RNA (RNA-seq), qui permet en théorie des erreurs de transcription à enregistrer tout au long du transcriptome de toute espèce. Toutefois, ces études sont facilement confondus par les artefacts de construction de bibliothèque, tels que les erreurs de transcription inverse, erreurs d’amplification PCR et la nature sujette de séquencer lui-même. Par exemple, reverse transcriptases commis environ une erreur chaque bases de ~ 20 000, tandis que les ARN polymérases (RNAPs) devraient ne faire qu’une seule erreur tous les 300 000 bases5,6. Parce que le taux d’erreur de transcription inverse seul éclipse le taux d’erreur des ARN polymérases à l’intérieur des cellules, il est pratiquement impossible de distinguer les erreurs de transcription exacte des artefacts causés par la préparation de la bibliothèque de données traditionnelles de RNA-Seq ( Figure 1 a).
Pour résoudre ce problème, nous avons développé une version optimisée du cercle-séquençage (Cirseq ou C-seq désormais) dosage5,16. Ce test permet à l’utilisateur détecter les erreurs de transcription et autres variantes rares dans l’ARN dans tout le transcriptome5. L’essai circulaire-séquençage porte ce nom parce qu’il est une étape clé dans cet essai s’articule autour de circularization RNA. Une fois que les objectifs de RNA sont prospectés, ils sont inverses transcrit de façon cercle roulant, pour produire des molécules de cDNA linéaire qui contiennent de nombreuses copies du même modèle RNA. Si une erreur était présente dans un de ces modèles, cette erreur serait également présente dans chaque répétition unique contenue dans la molécule de cDNA. En revanche, les erreurs introduites par transcription inverse l’amplification par PCR et séquençage ont tendance à survenir au hasard et seront donc présents dans seulement une ou deux répétitions. Ainsi, en générant une séquence consensus pour chaque molécule de cAdn et distinguer les erreurs aléatoires des erreurs qui se produisent dans toutes les répétitions, artefacts construction bibliothèque efficacement se distingues des erreurs de transcription exacte (Figure 1 b).
Si utilisé correctement, le dosage de la C-seq peut servir à détecter avec précision le taux de substitutions de base, les insertions et suppressions dans l’ARN dans le transcriptome de toutes les espèces (par exemple, voir levé et Ochman17). Par exemple, nous avons utilisé le test C-seq pour fournir des mesures de Génome-large de la marge d’erreur de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans avec une résolution de base unique5 (observations inédites). Initialement utilisé pour séquencer avec précision les populations de virus à ARN, cette version optimisée de l’essai C-seq a été simplifiée pour réduire au minimum des conditions difficiles lors de la préparation de la bibliothèque qui contribuent aux artefacts de construction de bibliothèque. En outre, en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce, le débit du dosage est grandement amélioré, ainsi que sa facilité d’utilisation. Si utilisé correctement, ce test peut détecter avec précision les milliers d’erreurs de transcription par réplicat, améliorant ainsi considérablement les précédentes études6. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la mutagénèse transcriptionnelle et permettra à l’utilisateur de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription dans un large éventail d’organismes nouveaux.

<table><tbody><tr><td>Kit de purification d’ARN RiboPure</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Purification d’ARN total</td></tr><tr><td>Kit de purification d’ARNm Genelute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>Purification d’ARNm</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Élution et dilution</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>Fragmentation de l’ARN</td></tr><tr><td>T4 ARN Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>Circularisation de l’ARN</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>Inhibiteur de la RNase</td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptase inverse</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Transcription inverse à cercle roulant</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Transcription inverse à cercle roulant</td></tr><tr><td>Hexamères aléatoires (50 ng/&micro ; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Transcription inverse à cercle roulant</td></tr><tr><td>NEB Module de synthèse de deuxième brin</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Synthèse de deuxième brin</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra Kit de préparation de bibliothèque d’ADN pour Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>Préparation de la banque d’ADNc</td></tr><tr><td>NEB Next amorces d’index</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Amorces de PCR multiplex</td></tr><tr><td>Oligo Clean & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Nettoyage d’échantillons d’ARN et d’ADN</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Magnet ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Purification par billes magnétiques</td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Purification par billes magnétiques</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Microcentrifugeuse</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Conditions de cyclage à moyenne à haute température</td></tr><tr><td>PTC-200 Thermocycleur</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp ;</td><td>Conditions de cycle à basse température</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Stérilisation</td></tr><tr><td>50 mL Tube à centrifuger</td><td>Corning</td><td>430290</td> Sans <td>nucléases</td></tr><tr><td>15 mL Tube à centrifuger</td><td>Corning</td><td>430052</td> Tubes Eppendorf <td>sans nucléases</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td> Système de tapisserie 4200 <td>sans nucléases</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Instrument d’analyse nucléotidique pour le contrôle de la qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin</td></tr><tr><td>Haute sensibilité</td><td>ScreenTape Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Contrôle qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin</td></tr><tr><td>ScreenTape Buffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>Contrôle qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin</td></tr><tr><td>Échelle ScreenTape Agilent</td><td></td><td>5067-5578</td><td>Contrôle de la qualité des échantillons d’ARN et d’ADN simple brin</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Contrôle qualité de l’ADN double brin</td></tr><tr><td>Kit d’ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Contrôle de la qualité des échantillons d’ADNc double brin</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Incubation</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Spectrophotomètre ThermoFisher</td><td></td><td>ND-2000C</td><td>Détermination de la concentration d’ARN</td></tr></tbody></table>

surveillance de génome-large d’erreurs de transcription dans les organismes eucaryotes

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Transcription précise est nécessaire pour l’expression fidèle de l’information génétique. Étonnamment bien, on en sait peu sur les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription. Pour combler cette lacune dans les connaissances scientifiques, nous avons récemment optimisé le dosage de cercle-à-pas pour détecter les erreurs de transcription dans le transcriptome de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole sera aux chercheurs un nouvel outil puissant pour cartographier le paysage des erreurs de transcription dans des cellules eucaryotes afin que les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription peuvent être élucidés en détail sans précédent.

Comme toutes les approches de séquençage massivement parallèle, chaque expérience de C-seq produit un ensemble de données difficiles à manier, grand. Pour les nouveaux utilisateurs, il peut être difficile à gérer ces ensembles de données ; ainsi, il est recommandé que tous les utilisateurs une expérience bio-disponible avant l’expérimentation. En moyenne, l’espoir est que les utilisateurs vont générer environ 55 – 70 Giga bases (Gbases) par course sur la plupart des plateformes de séquenç...

Le présent protocole aux chercheurs un nouvel outil pour surveiller la fidélité de la transcription dans plusieurs organismes modèles.

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mutagenèse transcriptionnelle, telles que les sous-unités de l’ARN polymérase ou les processus biologiques qui contrôlent la fidélité de la transcription. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer les erreurs de transcription endogènes dans les transcriptomes des organismes eucaryotes. En général, les personnes qui ne connaissent pas ce protocole auront du mal en raison de la longueur et de la complexité du test et de la nécessité d’une bio-informatique avancée pour interpréter les données.Pour commencer le protocole, circularisez les fragments d’ARN en dénaturant à la chaleur 20 microlitres de l’échantillon préalablement préparé à 65 degrés Celsius pendant une minute. Au bout d’une minute, placez immédiatement l’échantillon sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de tampon 10x T4 RNA ligase, quatre microlitres d’ATP 10 milliMolaires, un microlitre d’inhibiteur de RNase, un microlitre d’eau sans nucléase et huit microlitres de polyéthylène glycol à 50 %, ou PEG.Ensuite, mélangez soigneusement l’échantillon par vortex. Ajoutez ensuite deux mic

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Génétique

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

Ici, nous présentons un protocole permettant d’obtenir une résolution proche de la paire de bases des interactions protéine-ADN. Ceci est obtenu par un traitement à l’exonucléase de fragments d’ADN enrichis sélectivement par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-exo) suivi d’un séquençage à haut débit.

La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

Nous décrivons une approche expérimentale de base pour l’analyse de la terminaison de la transcription par l’ARN polymérase II in vivo en utilisant BrUTP par l’approche TRO (Strand-specific transcription run-on) chez la levure bourgeonnante. Ce protocole peut être étendu à l’étude de la terminaison de la transcription par d’autres ARN polymérases chez la levure et les eucaryotes supérieurs.

Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d&#39;exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ce protocole décrit l’utilisation de combinatoire de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq et ribosomes profilage de lignées cellulaires et les cellules primaires. Il permet aux changements suivi de transcription-facteur contraignant, novo de transcription, l’ARN traitement, chiffre d’affaires et traduction au fil du temps et d’afficher le cours général des événements dans les cellules activées ou évolues rapidement.

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Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

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Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

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Nous présentons une méthode rapide et efficace pour détecter les ruptures de sites fragiles courants grâce à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) γH2A.X native. Cette approche réduit considérablement le temps et la main-d’œuvre associés aux tests traditionnels γH2A.X ChIP tout en maintenant une reproductibilité et une fiabilité élevées des résultats.

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Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole permettant d’examiner fonctionnellement la transcription et l’activité inhibitrice des agents antibactériens ciblant la transcription bactérienne.

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

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Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

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