Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Cette méthode permettra au chercheur de sonder des systèmes difficiles à étudier, tels que les peptides et les ions de métaux de transition de première rangée, qui sont généralement difficiles à utiliser des applications plus standard. Le principal avantage ici est d’utiliser des techniques orthogonales car elles se complètent bien, ce qui peut donner plus d’informations sur le système et nous aider à ne manquer aucun phénomène. La méthode détaillée dans cette vidéo est très bien adaptée à l’étude d’autres systèmes.

Bien que nous le montrions avec Cu(II) et un peptide, il peut être utilisé pour de nombreuses interactions différentes entre peptide métallique et protéine métallique. Je pense que la partie la plus difficile sera de trouver un bon choix de tampon pour votre ion métallique et votre peptide. Je consulterais la littérature pour voir quels tampons ont été utilisés par d’autres auparavant.

Sohee Choi, une étudiante diplômée de mon laboratoire de recherche, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, allumez le spectrophotomètre d’absorption électronique et laissez-le chauffer pendant environ 15 à 20 minutes avant utilisation. Ensuite, lancez le logiciel du spectrophotomètre et configurez les paramètres, tels que la plage de balayage de 200 à 900 nanomètres, la plage de balayage de 200 nanomètres par seconde et la ligne de base à double faisceau corrigée.

Ensuite, collectez une ligne de base sans cuvettes ni échantillons dans les trajets du faisceau. À l’aide de deux cuvettes assorties dans le spectrophotomètre à double faisceau, chargez une cuvette avec 115 microlitres d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 microlitres de l’échantillon de peptide tout en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les cuvettes car celles-ci interféreront avec le signal. Ensuite, placez la cuvette avec de l’eau ultrapure dans le faisceau de référence et la cuvette avec peptide dans le faisceau d’échantillon.

Ensuite, collectez le spectre d’absorption du peptide sans métal. Ajouter une quantité substœchiométrique de la solution de Cu(II) dans la cuvette avec l’échantillon de peptide et enregistrer le volume pour analyse ultérieure. Faites-le doucement monter et descendre pour mélanger la solution tout en évitant la génération de bulles d’air.

Après avoir équilibré pendant cinq minutes, remettre la cuvette dans le porte-cellule d’échantillon et enregistrer le spectre d’absorption. Répétez ensuite l’addition de Cu(II)aliquotes dans la solution peptidique pour divers équivalents et notez le volume total de Cu(II) ajouté à la cuvette. Après avoir initialisé le logiciel comme décrit précédemment dans deux cuvettes appariées, chargez une cuvette avec 115 microlitres d’eau ultra pure et une autre cuvette avec 115 microlitres de la solution complexe cuivre-phén.

Placer la cuvette avec de l’eau dans le faisceau de référence et la cuvette avec une solution complexe cuivre-phén dans le faisceau d’échantillonnage. Ensuite, collectez le spectre d’absorption du complexe de ligand métallique. Ensuite, ajoutez une quantité stœchiométrique de peptide à la solution complexe cuivre-phén et canalisez doucement de haut en bas pour bien mélanger tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air.

Ensuite, incuber la solution pendant cinq minutes pour atteindre l’équilibre. Remettez la cuvette dans le porte-cellule d’échantillon et enregistrez le spectre d’absorption. Plus tard, répétez l’ajout d’aliquotes peptidiques dans la solution complexe cuivre-phén pour divers équivalents et notez le volume de peptide ajouté afin que la concentration diluée puisse être déterminée.

Allumez d’abord l’ITC et lancez le logiciel ITC pour faire fonctionner l’instrument. Après la première initialisation, relogez la burette et suivez les instructions à l’écran. Retirez ensuite la burette et le couvercle de la cellule de référence.

Ensuite, retirez l’eau de la cellule de référence et rincez trois fois avec 450 microlitres d’eau ultra pure dégazée. Aspirez lentement de l’eau ultra pure jusqu’à la marque de 450 microlitres d’une seringue de chargement en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la seringue. Insérez ensuite la seringue de chargement dans la cellule de référence jusqu’à ce qu’elle soit à environ un millimètre du fond et injectez lentement une partie de la solution jusqu’à ce qu’il reste 150 microlitres dans la seringue de chargement.

Ensuite, déplacez le piston de la seringue de chargement rapidement de haut en bas d’environ 25 microlitres plusieurs fois pour déloger les bulles à la surface de la cellule. Ensuite, injectez lentement jusqu’à ce que le piston atteigne la marque des 100 microlitres sur la seringue de chargement, distribuant ainsi un total de 350 microlitres d’eau ultra pure dans la cellule de référence et remplacez le couvercle de la cellule de référence. Après avoir retiré toute solution résiduelle de la cellule d’échantillon, chargez 450 microlitres d’EDTA 10 millimolaires à l’aide d’une seringue de chargement et faites tremper pendant 10 minutes pour vous assurer que les ions de métaux traces sont éliminés, car l’EDTA liera les métaux traces.

Après avoir retiré la solution d’EDTA, rincez soigneusement la seringue de chargement avec de grandes quantités d’eau ultra pure. Nettoyez l’ITC conformément aux instructions du fabricant en rinçant la cellule d’échantillon avec de l’eau ultra pure. Retirer toute eau résiduelle de la cellule d’échantillon, puis conditionner la cellule d’échantillon en rinçant avec 450 microlitres de tampon au moins trois fois.

Ensuite, retirez le tampon résiduel qui conditionne la cellule échantillon et chargez la solution peptidique dans la cellule d’échantillon à l’aide de la seringue de chargement. Rincez ensuite la seringue de titrage avec 200 microlitres de la solution tamponnée en retirant d’abord le piston. À l’aide d’une micropipette, pipeter la solution tampon à travers le trou situé sur le dessus de la seringue de titrage en verre à travers la seringue et sortir l’aiguille en dessous.

Plus tard, insérez complètement le piston dans la seringue de titrage. Ensuite, trempez l’extrémité de l’aiguille de la seringue de titrage dans la solution métallique et tirez lentement le piston vers le haut, ce qui fait que la solution métallique remplit la seringue et entraîne un volume vide au sommet de la partie verre de la seringue de titrage. Pour éliminer le volume vide, tournez la seringue de titrage parallèlement au sol.

Retirez ensuite le piston et inclinez légèrement la partie vitrée vers le sol. Agiter doucement la seringue de titrage afin que la solution se déplace vers la partie verre de la seringue de titrage et remplisse la majeure partie du volume vide. Mais assurez-vous qu’il reste deux à trois microlitres de volume vide.

Tout en gardant la seringue parallèle au sol, réinsérez le piston. Tenez ensuite la seringue de titrage à la verticale et replongez l’extrémité de l’aiguille dans la solution métallique. Ensuite, poussez le piston vers le bas jusqu’à ce que l’air cesse de sortir de l’aiguille et chargez la seringue de titrage en tirant lentement vers le haut jusqu’à ce que juste au-dessus de la marque des 50 microlitres tout en gardant l’extrémité de l’aiguille dans la solution.

Insérez délicatement la partie en verre de la seringue de titrage dans la burette et vissez jusqu’à ce que les doigts soient serrés. Ensuite, à l’aide d’un essuie-glace léger et délicat, absorbez la solution qui sort de la seringue de titrage en raison de la compression du piston sans toucher le bout de l’aiguille. Ensuite, insérez la burette avec une seringue de titrage dans la cellule d’échantillon et fixez-la solidement.

Pour configurer les paramètres du logiciel ITC, sélectionnez Instrument Control. Régler la vitesse d’agitation et la température. Ensuite, sous Détails de l’expérience, entrez les concentrations de la seringue et de la cellule en unités millimolaires.

Ensuite, dans la section Méthode d’expérience, sélectionnez Titrage incrémentiel. Cliquez sur Configuration et spécifiez 20 injections de 2,5 microlitres et si une plus grande résolution est nécessaire pour observer l’événement de liaison, augmentez le nombre d’injections et diminuez le volume par injection. Ensuite, entrez l’espacement temporel entre chaque injection afin qu’il soit suffisamment long pour que le signal s’équilibre et revienne à la ligne de base, généralement 300 secondes.

Cliquez ensuite sur le bouton Exécuter pour démarrer l’expérience et spécifier l’emplacement d’enregistrement des données. Le titrage du Cu(II) a été effectué dans le peptide C, démontrant que l’ajout de 150 micromolaires de Cu(II) provoquait une augmentation immédiate de la bande à 600 nanomètres attribuée à la bande d-d de Cu(II) et continuait d’augmenter jusqu’à ce que 300 millimolaires de Cu(II) soient ajoutés. Un ajout supplémentaire supérieur à 300 micromolaires de Cu(II) n’a pas augmenté l’absorption de l’interdiction d-d indiquant une saturation et que le Cu(II) se lie au peptide C dans un complexe 1:1 avec une valeur log K supérieure à six.

Le peptide C a été titré en environ 10 complexes cuivre-phén micromolaires et l’absorption de la bande de transfert de charge à 265 nanomètres a diminué, ce qui indique que le peptide C était capable de chélater le Cu(II) du ligand phénanthroline avec une valeur log K de 7,4 à 7,8. Le thermogramme ITC montre le titrage de 1,4 millimolaire Cu(II) en 154 micromolaires C-Peptide dans un tampon MOPS millimolaire. L’affinité de liaison s’est avérée avoir une valeur log K de huit avec un changement d’enthalpie de 8 kilojoules par mole.

L’énergie libre de Gibbs est de moins 46 kilojoules par mole et le changement d’entropie de 120 joules par mole par kelvin. Un titrage contrôlé de 1,4 millimolaire Cu(II) dans un tampon MOPS millimolaire en l’absence de peptide C ne montre aucune liaison dans le thermogramme. Je dirais de s’assurer que tout est propre.

S’il reste des ions métalliques ou des peptides d’expériences antérieures, cela peut affecter considérablement la stœchiométrie et fournir une compétition inconnue dans les expériences de liaison. Le dichroïsme circulaire est une autre méthode pour étudier les interactions entre peptides métalliques ou protéines métalliques, car il examine la chiralité. La spectrométrie de masse peut également interroger ces complexes en examinant les changements de masse.

Cet ensemble de techniques a été utilisé par de nombreux laboratoires qui étudient les ions métalliques interagissant avec des peptides ou des protéines.