Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser le développement des cœurs chez le poisson zèbre en 4 Dimensions (4D). L’imagerie 4D, par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM), prend 3 Dimensions (3d) images au fil du temps, de reconstruire les cœurs en voie de développement. Nous montrons qualitativement et quantitativement que cette contrainte de cisaillement active endocardique Notch signalisation au cours du développement de chambre, qui favorise la trabeculation cardiaque.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanobiologie cardiaque du développement, telles que la modulation de la contrainte de cisaillement sur la trabéculation cardiaque via la signalisation d’encoche à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière 4D. Le principal avantage de cette technique est qu’elle éclaire une section mince de l’échantillon avec un plan de cinq microns, ce qui réduit le photoblanchiment et les dommages photologiques. De plus, notre algorithme de calcul nous permet de reconstruire un cœur de poisson-zèbre battant en 4D.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des maladies cardiaques congénitales, car elle permet de visualiser séquentiellement invivo la trabéculation cardiaque à un stade précoce du développement jusqu’au phénotype ultérieur. En général, les personnes qui débutent dans cette technique trouveront qu’il est difficile d’imaginer penser en trois dimensions au fil du temps. De plus, il faut du temps pour créer le système et l’aligner avec précision.

Pour commencer, séparez le poisson zèbre mâle et femelle dans les bassins de reproduction à l’aide d’un séparateur. Ensuite, soulevez le séparateur et laissez le poisson zèbre mâle et femelle se reproduire. Collectez les embryons de poisson-zèbre et injectez du morpholino oligo dans l’embryon pour inhiber la trabéculation.

Ensuite, préparez un gel d’agarose à un pour cent en ajoutant un gramme d’agarose à 100 millilitres d’eau distillée et chauffez-le jusqu’à ce que toute l’agarose soit dissoute. Laissez refroidir l’agarose, puis utilisez une pipette de 20 microlitres pour charger un petit tube en plastique avec l’un des embryons préparés et de l’agarose. Fixez le tube sur la platine du microscope et utilisez l’objectif dix x.

Ajustez l’objectif à l’aide du bouton de manière à ce que le haut de l’embryon soit net. Prenez des images de l’embryon de poisson entier sur plusieurs cycles de battements cardiaques en utilisant une épaisseur de feuille légère de cinq microns. Collectez 500 images xy avec un temps d’exposition de dix millisecondes.

Ensuite, déplacez l’étage d’un micron dans l’accès z vers une nouvelle couche et répétez la procédure d’imagerie. Continuez à imaginer 500 images par plan z jusqu’à ce que le cœur entier soit entièrement imagé. Ensuite, ouvrez le logiciel de traitement d’images et commencez à empiler les images en 3D.

Pour ce faire, cliquez d’abord sur les données ouvertes. Ici, sélectionnez toutes les images à empiler en 3D, puis sélectionnez charger. Ajoutez ensuite la taille du voxel de 0,65 par 0,65 par un micron et cliquez sur OK.

La saisie de la bonne taille de voxel est essentielle pour une analyse précise des images 3D. Maintenant, cliquez sur la boîte de vue multiplaner et visualisez l’image 3D. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone de coupe bleue à un point, sélectionnez Affichage, puis cliquez sur volran.

Dans le menu Édition, sélectionnez Options, puis Modifier la palette de couleurs. Ajustez la couleur à l’aide des cases puis cliquez sur OK. Toujours dans le logiciel de traitement d’images, cliquez sur fichier et ouvrez les données de la série chronologique.

Sélectionnez les tiffs 3D qui viennent d’être créés en cliquant sur charger, et entrez la même taille de voxel que précédemment. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone de coupe bleue d’un point, puis sélectionnez afficher suivi de volran. Maintenant, cliquez sur modifier.

Sélectionnez les options. Ensuite, sélectionnez Modifier la palette de couleurs. Ajustez la couleur à l’aide des cases puis cliquez sur OK.

Ensuite, faites un clic droit sur le contrôle de la série chronologique, cliquez sur Movie Maker et appuyez sur le bouton de lecture pour regarder le film. Pour terminer, ajoutez un nom de fichier, une taille d’image, une fréquence d’images, une qualité égale à un, puis entrez monoscopique. Cliquez ensuite sur Appliquer.

Enfin, exportez la vidéo. Les forces biomécaniques, telles que la contrainte de cisaillement hémodynamique, sont intimement impliquées dans la morphogenèse cardiaque. Ici, la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière a été utilisée pour visualiser les crêtes trabéculaires faisant saillie dans la lumière ventriculaire 75 heures après la fécondation.

100 heures après la fécondation, un réseau trabéculaire est clairement visible. Dans un embryon traité avec la micro-injection gata1aMO, l’hématopoïèse et la viscosité sont réduites de 90 %. Cette diminution de la viscosité a atténué la contrainte de cisaillement hémodynamique, ce qui a entraîné une initiation retardée et un réseau trabéculaire moins dense.

Ce retard et cette densité du réseau trabéculaire ont pu être récupérés en régulant à la hausse l’expression des gènes liés à l’encoche, sauvant la formation trabéculaire 75 heures après la fécondation et 100 heures après la fécondation. Ainsi, les oligonucléotides morpholino gata1a ont réduit les forces hémodynamiques, ce qui a conduit à une régulation négative de la signalisation de l’encoche, tandis que l’ARNm Nrg1 a sauvé les gènes régulés liés à l’encoche et a relancé la trabéculation. Une fois maîtrisée, cette technique d’imagerie peut être réalisée en environ deux heures si elle est correctement exécutée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement cardiaque pour étudier les facteurs du gène encoche, qui sont responsables de la bonne formation de la trabéculation chez le poisson zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir des images à l’aide de la microscopie à éclairage plan sélectif et de créer des fichiers d’image 4D. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux.

Et des précautions, telles que le port de lunettes appropriées, doivent toujours être prises pendant cette procédure.